溫 柔，王曉晴，孫允紅，楊 穎， 侯 林

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 青島中醫(yī)藥科學(xué)院，山東 青島266000)

五加皮酒是以五加皮為主藥，在民間廣泛流傳配制的傳統(tǒng)藥酒，具有祛風(fēng)濕、痿痹、壯筋骨，填精髓等功效[1]。唐·《外臺秘要》[2]記載的五加皮酒方詳細記述了五加皮酒的制備工藝，其方為“五加根莖細刨五斗，六月六日曲未三斗，黍米一石，糯米亦得。以五斗共五加同下于大釜中，以木度深淺，與水準刻之，即更添水一石五斗，并前計兩石……”先以水煎五加皮取汁浸曲，再煎其藥渣取汁與黍米共煮，放涼加曲發(fā)酵而成。

目前市面上生產(chǎn)的五加皮酒，多以糧食白酒為酒基，配以多味藥材經(jīng)浸泡、配制、調(diào)色等工藝而制成[3]。白酒即蒸餾酒，普遍酒精度數(shù)偏高，蒸餾酒古稱“燒酒”，《本草綱目》載“燒酒，味辛、甘，性大熱，有大毒”。傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒采用的是傳統(tǒng)黃酒釀造工藝制備，酒精度普遍較低。當(dāng)前對于使用傳統(tǒng)黃酒釀造工藝制備五加皮酒的研究相對空白，本研究基于《外臺秘要》中記載的五加皮酒方，對傳統(tǒng)五加皮酒進行處方考證。在古方的基礎(chǔ)上對傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒制備工藝進行研究，得到五加皮最佳水提及糖化工藝，為傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒的制備研究提供實驗依據(jù)。

1 處方考證

1.1 處方沿革

《神農(nóng)本草經(jīng)》[4]記載最早的釀造五加皮酒大概出自戰(zhàn)國時期?！锻饪拼蟪伞穂5]記載：杰出的本草學(xué)家陶弘景就錄：“用單味五加皮，煮根莖釀酒，主益人?！薄侗静菥V目》[6]記載五加皮酒的制備方法“用五加皮刮去骨，煎汁和麴米釀成飲之?；蚯兴榇?，浸酒煮飲，或加牛膝、當(dāng)歸、地榆諸藥”。唐·《外臺秘要》[7]記載的五加皮酒方則詳細記述了單味五加皮酒的制備工藝，其方“五加根莖細刨五斗，六月六日曲未三斗，黍米一石，糯米亦得……”先以水煎五加皮取汁浸曲，再煎其藥渣取汁與黍米共煮，放涼加曲發(fā)酵而成?！秱浼鼻Ы鸱健穂8]記載五加皮酒方：“五加皮、枸杞根白皮各一斗。以水一石五斗煮取汁七斗，分取四斗浸曲一斗，余三斗用拌飯下米，多少如常釀法?！薄短绞セ莘健穂9]記載的五加皮酒為浸漬法制備：“五加皮細銼一升，以清酒一斗。漬十日，溫服一中盞?！蔽墨I考證可知，傳統(tǒng)的五加皮酒大多是采用釀造法制備而來。先水煎煮五加皮得到五加皮水提液及藥渣，然后將五加皮水提液及藥渣與米、曲共同發(fā)酵。

1.2 藥材基原

五加皮最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，又名五加，尚有材漆、五花、木骨、追風(fēng)使、刺通、白剌等異名[10]。《名醫(yī)別錄》有載：“五加皮，五葉者良，生漢中及冤句，五月、七月采蓮，十月采根，陰干?！蔽寮悠ぞ哂凶萄a、祛風(fēng)濕、補肝腎、強筋骨等功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》[11]言其“主心腹疝氣，腹痛，益氣，療蹩、小兒不能行、疸創(chuàng)陰蝕?！睍惺状翁岢鑫寮泳哂幸鏆?、療蹩的作用?！睹t(yī)別錄》[12]云：“男子陽瘓，囊下濕，小便余瀝，女人陰癢及腰脊痛，兩腳痛風(fēng)弱，五緩，虛嬴，補中益精，堅筋骨，強志意，久服輕身耐老?！薄缎滦薇静荨分嘘P(guān)于五加皮功效的記載，且云“久服輕身耐老……五葉者良?！薄侗静菟急驿洝份d：“五加皮，宜下焦風(fēng)濕之緩證。若風(fēng)濕搏于肌表，則非其所司。古方多浸酒醜酒，及酒調(diào)末服之，以行藥勢。”2020年版《中國藥典》[13]收錄五加皮為五加科植物細柱五加皮Acanthopanax gracilistylusW.W. Smith的干燥根皮。

1.3 藥材炮制

《外臺秘要》記載的五加皮酒方，詳細記述了五加皮的炮制方法：“五加根莖細刨五斗，六月六日曲未……”《太平圣惠方》記載“五加皮細銼一升……”仲景云：“銼如麻豆大，與咀同義。咀，古之制也，古無鐵刃，以口咬細，令如麻豆，為粗藥煎之，使藥水清飲于腹中，則易升易散也，此所謂咀也。今人以刀器銼如麻豆大，此咀之易成也?！盵1“4]如麻豆大”在煮散的粒度描述中十分常見，“麻豆”在歷代古籍文獻中卻未見有明確記載。但“麻”在歷代古籍文獻中均有明確且統(tǒng)一的釋義，即我國傳統(tǒng)種植的大麻，古代五谷之一的大麻籽實以及古代百姓衣著及喪服所用的麻布均來源于大麻[15]?！奥椤睘樯？浦参锎舐椋奥槎埂睘榇舐榈某墒旃麑?，即火麻仁。2020 年版《中國藥典》中記載火麻仁呈卵圓形，長 4 ～ 5.5 mm，直徑 2.5 ～ 4 mm。因此，“麻豆大”推測為2 ～ 5 mm。而 4目篩孔徑為 4.75 mm，一號篩（10目）的孔徑則為2.00 mm[16-19]。因此，“如麻豆大”可取過4目篩但不過一號篩（10目）的粗顆粒。由此推測，《外臺秘要》記載的五加皮酒方中五加皮應(yīng)取粉碎后過4目篩但不過10目篩的粗粉。

1.4 計量考證

原方中記載五加皮用量為五斗，黍米為一石，水為兩石。已知五加皮粉碎的粒度，由此可以計算出五加皮粉末的密度。實驗得到五加皮粉末松密度和振實密度分別為0.412、0.410，黍米的松密度和振實密度分別為0.831、0.836。查閱文獻可知古代與現(xiàn)代換算關(guān)系：1斗 = 2 000 mL，一石 = 10斗[20]。由此可推出，五加皮∶黍米∶水= 1∶4∶10。

2 傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒的制備工藝研究

2.1 材料

2.1.1 儀器 2695型高效液相色譜儀包括2998型檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；DK-S14 型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9140B 型電熱鼓風(fēng)干燥箱［中儀國科（北京）科技有限公司］；FA2104型萬分之一電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；CPA225D 型十萬分之一電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；KQ-500E 型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；LA759 型超純水機（英國 ELGA 公司）。

2.1.2 藥材及試劑 黍米購自沈陽信昌糧食貿(mào)易有限公司；五加皮（生產(chǎn)批號：210601）購自青島天成中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)侯林副教授鑒定，均符合2020年版《中國藥典》（一部）相關(guān)項下要求；綠原酸對照品（批號：Y24J7K16726，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；葡萄糖對照品（批號：20191029，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙腈為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；磷酸為分析純；超純水為實驗室自制。

2.2 工藝流程

五加皮粉碎過篩后煎煮得到五加皮水提液及藥渣。黍米經(jīng)浸泡、洗米、燙米后與五加皮水提液及藥渣共煮進行煮糜。將煮好的糜倒入消毒后的鐵盤中，使其快速降溫。降到指定溫度后加入麥曲進行糖化。糖化結(jié)束后加入酵母，轉(zhuǎn)移至缸中進行發(fā)酵。發(fā)酵7 d后過濾取濾液，將過濾后的酒液置于85℃水浴30 min，即可。

2.3 五加皮水提工藝研究

2.3.1 樣品溶液制備 取五加皮粗粉50 g于圓底燒瓶中，加入水，浸泡，回流，得到五加皮水提液，將提取液離心、過濾、定容至500 mL。

2.3.2 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計L9（34）正交試驗，按方法測定浸出物含量和綠原酸含量，對浸出物含量和綠原酸含量進行綜合評分，以綜合評分為指標，正交因素水平見表1。

表1 五加皮水提工藝正交因素水平表Tab. 1 Level table of orthogonal factors water extraction technology of Acanthopanacis Cortex

2.4 五加皮糖化工藝研究

2.4.1 糖化液的制備 取黍米500 g，浸泡24 h后進行燙米，再浸泡24 h，與五加皮提取液及藥渣共煮進行糊化，攤涼，加入麥曲糖化，得到糖化液。

2.4.2 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計L9（34）正交試驗，以還原糖為指標，正交因素水平見表2。

表2 五加皮糖化工藝正交因素水平表Tab. 2 Level table of orthogonal factor of saccharification process of Acanthopanacis Cortex

2.5 方法

2.5.1 浸出物含量測定 精密量取25 mL水提液于干燥至恒重的蒸發(fā)皿，水浴蒸干。105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，平行測定兩次，以干燥品計算供試品中水溶性浸出物的含量。

2.5.2 綠原酸含量測定 （1） 色譜條件 色譜柱為WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈（B）-0.05%磷酸水（A），梯度洗脫（0 ～ 10 min，5% →10%B，10 ～ 30 min，10% →15%B，30 ～ 40 min，15%→85%B）；檢測波長：270 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

（2） 對照品溶液的制備 精密稱取5.08 mg綠原酸對照品，加甲醇溶解，定容至5 mL容量瓶中，即得。

（3） 供試品溶液的制備 精密吸取“2.3.1”項下樣品溶液25 mL于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干。加甲醇溶解，定容至25 mL，過濾，取濾液。

（4） 標準曲線的制備 分別精密吸取規(guī)定配制的綠原酸對照品溶液2.5 mL，按半倍稀釋法，定容至5 mL容量瓶中，依次得到濃度為0.031 15、0.062 23、0.124 46、0.248 92、0.497 84、0.995 68 mg/mL系 列對照品。按“2.5.2（1）”項下色譜條件進樣，測定峰面積。以濃度為橫坐標（X，mg/mL），峰面積為縱坐標（Y），得到標準曲線。

2.5.3 還原糖含量測定 （1） 對照品溶液的制備

精密稱取50 mg經(jīng)105℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

（2） 供試品溶液的制備 取“2.4.1”項下糖化液4 000 r/min離心20 min，上清液定容至100 mL容量瓶，取上清液1 mL定容至100 mL容量瓶中，得到供試品溶液。精密吸取1 mL供試品溶液，測定吸光度，計算還原糖含量。

（3） 線性關(guān)系考察 采用 3,5－二硝基水楊酸比色法。分別精確吸取葡萄糖標準液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.7 mL 置于10 mL 具塞試管中，蒸餾水補至2.0 mL，加入 3,5－二硝基水楊酸試劑1.5 mL，將各試管中的溶液混合均勻，沸水浴 5 min 取出，立即冷卻至室溫，定容至刻度，搖勻，在540 nm波長處測定吸光度，得到葡萄糖標準曲線方程。

2.5.4 浸出物和綠原酸權(quán)重系數(shù)確定 采用CRITIC法[21-24]。CRITIC法是一種客觀權(quán)重賦權(quán)法，它以兩個基本概念為基礎(chǔ)，一是對比強度，以標準差的形式來表現(xiàn); 二是評價指標之間的沖突性，以指標之間的相關(guān)性為基礎(chǔ)，故該方法是基于評價指標的對比強度和指標之間的沖突性來綜合衡量指標的客觀權(quán)重，在考慮指標變異性大小的同時兼顧指標之間的相關(guān)性，完全利用數(shù)據(jù)自身的客觀屬性進行科學(xué)評價。

3 結(jié)果與分析

3.1 五加皮水提工藝研究

3.1.1 綠原酸HPLC分析結(jié)果 按照“2.5.2（2）（3）”項下方法制備對照品溶液和五加皮供試品溶液，按“2.5.2（1）”項下色譜條件進行分析。色譜圖見圖1、圖2，各峰之間分離度足夠，峰形良好，可以用于樣品的HPLC分析。

圖1 綠原酸標準品HPLC圖譜Fig. 1 HPLC of chlorogenic acid standard

圖2 五加皮供試品HPLC圖譜Fig. 2 HPLC of Acanthopanacis Cortex sample

3.1.2 綠原酸標準曲線 按“2.5.2（4）”項下繪制標準曲線，結(jié)果顯示，綠原酸對照品溶液濃度（X，mg/mL）和峰面積（Y）呈線性關(guān)系，回歸方程為Y= 8×106X+ 152 965，R2= 0.999 6，表明綠原酸對照品在0.031 15 ～ 0.995 68 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.3 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗 取綠原酸對照品，連續(xù)進樣6次，得峰面積，計算RSD = 0.21%，表明儀器精密度良好。

（2） 重復(fù)性試驗 取6份制備的同一批供試品溶液，按色譜條件進樣，得峰面積，計算綠原酸含量，RSD = 1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

（3） 穩(wěn)定性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h按“2.5.2（1）”項下色譜條件進樣，測得2種溶液中綠原酸峰面積RSD分別為0.58%、1.7%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（4） 加樣回收率試驗 精密吸取125 mL濃度為0.154 5 mg/mL樣品溶液于250 mL容量瓶中，定容至刻度作為供試品溶液。精密吸取6份 25 mL供試品，精密稱取對照品2.00 mg，制備供試品溶液，按“2.5.2（1）”項下色譜條件進樣，測得平均回收率為101.82%，RSD為0.31%。

3.1.4 正交試驗結(jié)果 由表3可知，溶劑量的均方值最大，即溶劑量對五加皮水提液中浸出物含量和綠原酸含量影響最大，其次為浸泡時間，最后為煎煮時間，即B＞A＞C。由表4分析可知，因素B具有顯著影響（P＜0.05），而A、C不具有顯著影響（P＞0.05）。最終確定五加皮最佳水提工藝為A2B3C2，即浸泡時間為40 min、溶劑量為12倍、煎煮時間為90 min。

表3 五加皮水提工藝正交試驗結(jié)果表Tab. 3 Orthogonal test results table of water extraction of Acanthopanacis Cortex

表4 五加皮水提工藝正交試驗結(jié)果方差分析表Tab. 4 Orthogonal test results analysis of variance table of Acanthopanacis Cortex

3.1.5 正交試驗結(jié)果驗證 按“3.1.3”項下優(yōu)化工藝進行 3 批驗證試驗，結(jié)果見表5，浸出物含量、綠原酸含量及綜合評分RSD均小于3%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表5 五加皮水提工藝驗證（n = 3）Tab. 5 Process validation of Acanthopanacis Cortex （n = 3）

3.2 糖化工藝研究

3.2.1 葡萄糖標準曲線 按“2.5.3（3）”項下繪制標準曲線，結(jié)果顯示，葡萄糖對照品溶液濃度（X，mg/mL）和吸光度（Y）呈線性關(guān)系，回歸方程為Y= 0.014 4X- 0.047 6，R2= 0.999 9，表明葡萄糖對照品溶液在10 ～ 70 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2.2 方法學(xué)考察 （1） 精密度試驗 取濃度為70 μg/mL的無水葡萄糖對照品溶液，連續(xù)測定6次，得吸光度，RSD = 0.12%，表明儀器精密度良好。

（2） 重復(fù)性試驗 取6份同一批供試品溶液，測定其吸光度，計算還原糖含量，RSD = 3.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

（3） 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別在0、10、20、30、40、50、60 min測定吸光度，RSD =0.39%，表明溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

（4） 加樣回收率試驗 精密吸取0.5 mL濃度 為69.49 μg/mL供 試 品 溶 液6份 于10 mL試 管中，分別加入0.5 mL濃度為70.8 μg/mL的對照品溶液，按方法顯色，測定吸光度，測得平均回收率為97.77%，RSD為0.87%。

3.2.3 正交試驗結(jié)果 由表6可知，加曲量的均方值最大，即加曲量對糖化液中還原糖含量影響最大，其次為糖化溫度，最后為糖化時間，即A＞C＞B。由表7分析可知，因素A具有顯著影響（P＜0.05），而B、C不具有顯著影響（P＞0.05）。最終確定最佳糖化工藝為A3B3C2，即加曲量為14%、糖化時間為50 min、糖化溫度為65 ℃。

表6 糖化工藝正交試驗結(jié)果表Tab. 6 Table of orthogonal test results of saccharification process

3.2.4 正交試驗驗證 按“3.2.3”項下最佳工藝進行 3 批驗證試驗，結(jié)果見表8，還原糖含量RSD＜3%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表 7 糖化工藝正交試驗結(jié)果方差分析表Tab. 7 Orthogonal test results ANOVA table of saccharification process

表8 糖化工藝驗證（n = 3）Tab. 8 Process validation of saccharification process（n = 3）

4 討論

中藥酒劑，也稱藥酒，屬于中藥的傳統(tǒng)劑型，使用歷史悠久。《中國藥典》規(guī)定藥酒為蒸餾酒提取制成的澄清液體制劑。蒸餾酒古稱“燒酒”，《本草綱目》載“燒酒，味辛、甘，性大熱，有大毒”[25]。而高度蒸餾酒導(dǎo)致的安全性問題正是制約其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素。臧貴勇等[26]研究了水族抗痹癥藥酒的急性毒性，結(jié)果顯示抗痹癥藥酒小鼠一次經(jīng)口給藥 LD50=29. 664 mL/kg，白酒對照組小鼠一次經(jīng)口給藥 LD50=27. 222 mL/kg，說明白酒是導(dǎo)致藥酒毒性的關(guān)鍵因素?，F(xiàn)代藥酒的生產(chǎn)多是以糧食白酒為酒基，配以多種藥材經(jīng)過浸泡、勾兌而成。以傳統(tǒng)釀造法制備的藥酒不僅酒精度低，對人體危害小，而且在釀造過程中引入原料米的活性物質(zhì)，具有安全、健康、口感豐富的特點，符合現(xiàn)代人追求的養(yǎng)生保健生活方式。

釀造法制備藥酒是我國傳統(tǒng)藥酒制備方法，《本草綱目》中記載的68個藥酒均是以釀造法制備?；仡櫵幘频钠鹪春桶l(fā)展，得到兩點認識：一是在古代至少清代以前“酒”指的是釀造法制備而來的低度酒，藥酒的溶劑也是釀造法制備而來的低度酒；二是釀制法工藝是古代藥酒生產(chǎn)的主要工藝。進入現(xiàn)代，工業(yè)化規(guī)?；a(chǎn)的藥酒已經(jīng)取代了小作坊生產(chǎn)，滅菌工藝成熟，制約釀制法工藝的技術(shù)因素已經(jīng)不復(fù)存在，可以考慮將釀制法工藝重新引入藥酒的生產(chǎn)。

5 結(jié)論

本研究以古籍《外臺秘要》中記載的五加皮酒方為基礎(chǔ)，從處方沿革、藥材基原、藥材炮制及計量考證對傳統(tǒng)五加皮酒進行處方考證，對傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒制備工藝中的五加皮水提工藝和糖化工藝進行了優(yōu)化，并驗證了這兩個工藝的可行性，為傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒的制備研究提供了初步的實驗依據(jù)。