劉澤文，王 偉，黃永芳，吳春銀，史曉雨，單體江

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院；b.植物保護(hù)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

油茶Camellia oleifera為山茶科Theaceae 山茶屬Camellia多年生喬木，主要分布于我國長江流域及其以南的14 個?。▍^(qū)）[1-3]，與椰子、油棕、油橄欖并稱為世界四大木本食用油料樹種[4-5]。油茶及其副產(chǎn)物是篩選具有抗菌、抗氧化和殺線蟲活性物質(zhì)的重要來源[6-7]。大量研究結(jié)果表明，油茶籽餅水提液對香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌等11 種植物病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用[8]，同時在質(zhì)量濃度為50 g/L 時，對離體松材線蟲培養(yǎng)48 h 后的活性抑制作用可達(dá)到100%，展現(xiàn)了良好的抗菌和殺線蟲活性[9]。油茶籽、花、果殼、枝和根等不同部位提取物也展現(xiàn)了不同程度的抗氧化活性[10-13]。油茶果殼是油茶的重要副產(chǎn)物，富含黃酮、多酚、皂莢素、多糖等成分[14-15]，具有抗氧化、防衰老、抑菌消炎、預(yù)防心血管疾病和抗癌等多種生物活性，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[16]。大量油茶果殼的丟棄不僅浪費(fèi)資源，還會造成環(huán)境污染[17]。

目前，有關(guān)油茶果殼在防治農(nóng)林業(yè)病原真菌及松材線蟲方面應(yīng)用的研究報道較少。本研究中采用乙酸乙酯冷浸提取法提取油茶果殼的次生代謝產(chǎn)物，并測定提取物的抗真菌、抗氧化以及殺線蟲活性，以期為植物病害的防治提供新思路，為油茶果殼的綜合開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試樣品來源

2018年11月28日，在廣東省廣州市增城區(qū)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城教學(xué)科研基地采集油茶果殼樣品。樣樹共計28 種，分別為‘岑軟1 號’‘岑軟2 號’‘岑軟3 號’‘岑軟6 號’‘岑軟7 號’‘岑軟11 號’‘岑軟24 號’‘岑溪軟枝油茶’‘長林27 號’‘璠龍4 號’‘璠龍5 號’‘贛石84 號’‘贛無2 號’‘贛無20 號’‘贛興46 號’‘桂無1 號’‘桂無2 號’‘桂無3 號’‘桂無4 號’‘桂無5 號’‘田軟6 號’‘湘林5 號’‘湘林29 號’‘湘林81 號’‘陽春1 號’‘陽春2 號’‘粵高油9 號’‘粵高油10 號。

1.1.2 供試病原菌及線蟲

供試病原菌為油茶炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides，供試線蟲為松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院植物與微生物健康實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 儀器與試劑

儀器：BJ-150 型粉碎機(jī)（浙江拜杰電器有限公司）、SW-CJ-2FD 型超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、LRH 系列生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠）、JA2003N 型分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、MLS-3870 三洋高壓滅菌鍋（松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社，日本）、Exceed-Cb 型超純水機(jī)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）、LC-16 分析型高效液相色譜儀（島津企業(yè)管理有限公司）。

試劑：98.4%多菌靈（中國農(nóng)科院植保所廊坊農(nóng)藥中試廠），甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、二甲基亞砜等有機(jī)溶劑（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）均為分析純，甲醇、乙腈（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆┚鶠樯V純，葡萄糖（天津市大茂化學(xué)試劑廠），瓊脂（健陽生物科技有限公司），1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,6-二叔丁基對甲基苯酚（BHT）等藥品（Sigma-Aldrich 公司，美國）。

1.2 方 法

1.2.1 油茶果殼提取物的制備和分析

將油茶果殼在自然環(huán)境下風(fēng)干，用粉碎機(jī)研成粉末。稱取各品種油茶果殼粉末1 g，并將其加入裝有40 mL 乙酸乙酯的離心管中，冷浸振蕩提取3 次，將提取液減壓濃縮至干，即得各品種油茶果殼提取物。稱取各品種油茶提取物，配制1 mL 質(zhì)量濃度為10 g/L 的樣品溶液，使用0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾，備用。使用高效液相色譜儀對各樣品溶液進(jìn)行分析。流動相為乙腈和水，使用二極管陣列檢測器檢測，采用梯度洗脫系統(tǒng)。色譜條件：0 ～1 min 20%乙腈等度洗脫，1 ～16 min 乙腈（體積分?jǐn)?shù)由20%上升到100%）洗脫，16 ～17 min 100%乙腈洗脫。

根據(jù)高效液相色譜分析結(jié)果，對28 種油茶進(jìn)行分類，從每類中選取1 種具有代表性的油茶品種大量制備其果殼提取物，用于生物活性測定。

1.2.2 提取物抗油茶炭疽病菌活性的測定

采用菌絲生長速率法測定不同品種油茶果殼提取物對油茶炭疽病菌的抑制活性[18]。供試樣品的初始質(zhì)量濃度為150 g/L，使用30%的DMSO依次倍半稀釋成質(zhì)量濃度為75、37.5、18.75、9.375、4.687 5 和2.343 75 g/L 的樣品溶液。分別取1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液加入到29 mL PDA 培養(yǎng)基中，混合均勻，制成樣品平板。將活化好的油茶炭疽菌餅（6 mm）接種于PDA 平板上。以加入無菌水、30% DMSO、98.4%多菌靈的PDA 培養(yǎng)基分別作為空白對照、陰性對照和陽性對照，每處理重復(fù)3 次，28 ℃條件下培養(yǎng)5 d 左右。待空白對照菌落生長至培養(yǎng)皿面積的2/3 時，采用十字交叉法測量各處理菌落生長直徑并計算抑菌率。

I=[(L1-L2)/L1]×100%。

式中：I表示抑菌率，L1表示陰性對照菌落純生長量（菌落直徑與菌餅直徑的差值），L2表示處理菌落純生長量。

使用Excel 軟件分析數(shù)據(jù)，將供試樣品質(zhì)量濃度取對數(shù)（X），將抑菌率換算為概率（Y），計算有效抑制中濃度（EC50）。

1.2.3 提取物抗氧化活性的測定

采用多孔板-DPPH 法測定不同品種油茶果殼提取物對DPPH 的清除力[19]。供試樣品的初始質(zhì)量濃度為40 g/L，使用30%的DMSO 依次倍半稀釋成質(zhì)量濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 和0.156 25 g/L 的樣品溶液。陽性對照為BHT，初始質(zhì)量濃度為2 g/L，使用30%的DMSO對半稀釋成質(zhì)量濃度為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 和0.007 812 5 g/L 的陽性對照溶液。取80 μL 質(zhì)量濃度為200 mg/L 的DPPH 無水乙醇溶液以及20 μL 系列濃度的樣品溶液或陽性對照溶液，加入96 微孔板中，以20 μL 30%的DMSO 溶液作為空白對照，避光振蕩搖勻，在37 ℃下水浴30 min，使用酶標(biāo)儀于517 nm 波長處測定吸光度。每個樣品均做4 個重復(fù)，每個重復(fù)測定3 次。計算供試樣品的DPPH 清除率。

C=[(Ac-As)/Ac]×100%。

式中：C表示DPPH 清除率，Ac表示空白對照在517 nm 波長處的吸光度，As表示樣品溶液在517 nm 波長處的吸光度。

使用Excel 軟件分析數(shù)據(jù)，將供試樣品質(zhì)量濃度取對數(shù)（X），將DPPH 清除率換算為概率（Y），計算有效中濃度（IC50）。

1.2.4 提取物抗松材線蟲活性的測定

采取觸殺法測定不同品種油茶果殼提取物的殺線蟲活性[20]。用無菌水將高濃度的線蟲水懸浮液稀釋至300 ～500 頭/mL。取不同品種油茶果殼提取物20 mg，使用400 μL 30%的DMSO 溶劑溶解，并依次倍半稀釋成50、25、12.5、6.25、3.125和1.562 5 g/L 的樣品溶液，備用。在96 微孔板中每孔加入90 μL 線蟲懸浮液，然后加入待測樣品液10 μL，3 次重復(fù)，以30%的DMSO 為陰性對照。每隔24、48、72 h 統(tǒng)計線蟲死亡率，并進(jìn)行校正。

D=[(N1-N2)/(1-N2)]×100%。

式中：D表示校正死亡率，N1表示處理組死亡率，N2表示陰性對照死亡率。

使用Excel 軟件分析數(shù)據(jù)，將供試樣品質(zhì)量濃度取對數(shù)（X），將校正死亡率換算為概率（Y），計算半抑制濃度（IC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種油茶果殼的次生代謝產(chǎn)物

根據(jù)高效液相色譜分析結(jié)果，將28 種油茶分為Ⅰ～Ⅶ類。Ⅰ類為‘岑軟1 號’，Ⅱ類為‘璠龍5 號’，Ⅲ類為‘璠龍4 號’‘贛石84 號’，Ⅳ類為‘長林27 號’‘桂無3 號’‘粵高油10 號’，Ⅴ類為‘桂無4 號’，Ⅵ類為‘岑軟2 號’‘岑軟3 號’‘岑軟11 號’‘岑軟24 號’‘贛無2 號’‘贛無20 號’‘贛興46 號’‘桂無1 號’‘桂無2號’‘桂無5 號’‘湘林5 號’‘湘林29 號’‘湘林81 號’‘陽春1 號’‘陽春2 號’，Ⅶ類為‘岑軟6 號’‘岑軟7 號’‘岑溪軟枝油茶’‘田軟6號’‘粵高油9 號’。從每類中選取1 種具有代表性的油茶品種，分別為‘岑軟1號’‘璠龍5號’‘贛石84 號’‘桂無3 號’‘桂無4 號’‘桂無5 號’和‘粵高油9 號’，其果殼提取物在210 nm 下的高效液相色譜分析結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，7 種油茶果殼提取物均含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，但不同品種油茶果殼的次生代謝產(chǎn)物的分布、種類和含量存在一定的差異。7 種油茶果殼的次生代謝產(chǎn)物主要集中在保留時間3.0 ～11.0 min 處，在保留時間約為3.5、7.5 和10.0 min 處具有相同化學(xué)物質(zhì)，但相對含量不同?！馃o3 號’果殼的次生代謝產(chǎn)物種類最多，‘桂無3 號’‘粵高油9號’和‘璠龍55 號’在保留時間為3.0 min 處存在與其他品種不同的化學(xué)信號。

圖1 各類代表性品種油茶果殼提取物高效液相色譜分析結(jié)果Fig.1 HPLC chromatograms of the fruit shell extracts from different varieties of C.oleifera

2.2 不同品種油茶果殼提取物的抗油茶炭疽病菌活性

各類代表性品種果殼提取物對油茶炭疽病菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用。其中，‘贛石84 號’果殼提取物對油茶炭疽病菌的抑制作用最強(qiáng)，EC50值為(2.02±0.09) g/L?！? 號’‘粵高油9 號’次之，EC50值分別為(2.65±0.38)、(2.84±0.19) g/L?！馃o5 號’‘桂無3 號’‘璠龍5 號’和‘桂無4 號’果殼提取物的EC50值依次為(6.70±0.34)、(3.30±0.59)、(4.41±0.33)、(4.91±0.24) g/L。但所有樣品對油茶炭疽病菌的抑制效果明顯弱于陽性對照98.4%多菌靈，其EC50值為(0.70±0.10) mg/L。結(jié)果表明，‘贛石84 號’果殼提取物的抗油茶炭疽病菌活性最強(qiáng)。

2.3 不同品種油茶果殼提取物的抗氧化活性

各類代表性品種果殼提取物均具有一定的抗氧化活性。其中，‘桂無4 號’果殼提取物的抗氧化活性最強(qiáng)，其IC50值為(5.80±0) mg/L，強(qiáng)于陽性對照的IC50值(25.90±0) mg/L。其次是‘璠龍5 號’‘粵高油9 號’‘贛石84 號’果殼提取物，其IC50值分別為(36.80±0)、(48.60±0.02)、(92.10±0.02) mg/L。‘岑軟1 號’‘桂無3 號’‘桂無5 號’果殼提取物也表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，其IC50值分別為(119.30±0.05)、(199.70±0.01)、(516.40±0.28) mg/L，‘桂無5 號’果殼提取物的抗氧化活性最弱。結(jié)果表明，‘桂無4 號’果殼提取物的抗氧化活性最強(qiáng)。

2.4 不同品種油茶果殼提取物的殺線蟲活性

各類代表性品種果殼提取物對松材線蟲的抑制效果見表1。由表1可知，除‘贛石84 號’和‘粵高油9 號’果殼提取物外，其他供試樣品對松材線蟲均表現(xiàn)出一定的抑制作用，但不同樣品之間存在差異。其中，‘璠龍5 號’果殼提取物在處理24、48、72 h后的IC50值分別為(9.65±1.54)、(5.03±0.73)、(3.72±0.12) g/L。其次是‘岑軟1 號’果殼提取物，其IC50值為8.86 ～11.38 g/L?！馃o3 號’果殼提取物在處理24 h 后開始顯現(xiàn)殺線蟲活性特征，其IC50值為7.41 ～15.91 g/L?！馃o5 號’果殼提取物的殺線蟲活性最差，其在處理72 h 后開始出現(xiàn)明顯的殺線蟲活性特征，其IC50值為17.62 ～18.26 g/L。結(jié)果表明，‘璠龍5 號’果殼提取物具有最好的殺線蟲活性。

表1 各類代表性品種油茶果殼提取物對松材線蟲的殺線活性?Table 1 Nematicidal activities against B.xylophilus of the fruit shell extracts from different varieties of C.oleifera g/L

3 結(jié)論與討論

不同品種油茶果殼提取物在抗真菌、抗氧化和殺線蟲活性方面存在明顯差異。根據(jù)油茶果殼次生代謝產(chǎn)物的高效液相色譜分析結(jié)果，可將28 個油茶品種劃分為7 大類。從每類中選1 個具有代表性的油茶品種，測定其果殼提取物的抗真菌、抗氧化和殺線蟲活性。其中：‘贛石84 號’果殼提取物對油茶炭疽病菌的抑制效果最好，其EC50值為(2.02±0.09) g/L；‘桂無4 號’果殼提取物的抗氧化活性最強(qiáng)，其IC50值為(5.80±0) mg/L，強(qiáng)于陽性對照BHT 的IC50值(25.90±0) mg/L；‘璠龍5號’果殼提取物表現(xiàn)出較好的殺線蟲活性，其在處理24、48 和72 h 后的IC50值分別為(9.65±1.54)、(5.03±0.73)、(3.72±0.12) g/L?！M石84 號’‘桂無4 號’‘璠龍5 號’可作為候選油茶品種，進(jìn)一步用于果殼提取物活性成分的鑒定。

油茶為我國重要的木本油料樹種，具有良好的適應(yīng)性和較高的經(jīng)濟(jì)價值，在我國南方廣大紅壤丘陵地區(qū)有廣泛種植[2,21]。油茶果殼為油茶加工產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物，目前亟待加強(qiáng)開發(fā)利用。有研究結(jié)果表明，油茶果殼提取物表現(xiàn)出較好的抗真菌和抗氧化活性可能與其富含酚類、皂苷、萜類和生物堿類等次生代謝產(chǎn)物有關(guān)[22-26]。此外，這些物質(zhì)還能促進(jìn)作物生長，減少病蟲害發(fā)生，提高作物的產(chǎn)量和質(zhì)量[27-28]。本研究中分別采用菌絲生長速率法、多孔板-DPPH 法和觸殺法測定了7 個具有代表性油茶品種果殼代謝產(chǎn)物的抗真菌、抗氧化和殺線蟲活性，結(jié)果表明‘贛石84 號’油茶果殼提取物對油茶炭疽病菌的抑制能力最強(qiáng)。左繼林等[29]報道，在25 個贛無性系品種中，‘贛石84 號’是最優(yōu)品種，具有一定的開發(fā)潛力。油茶果殼提取物的抗真菌活性可能與茶皂素有關(guān)，茶皂素提取純度因品種和提取工藝不同而有所差異[27]。本研究中采用的提取方法并非茶皂素的最佳提取方法，后續(xù)可進(jìn)一步研究不同品種油茶果殼茶皂素的含量差異?！馃o4 號’果殼提取物對DPPH 表現(xiàn)出最強(qiáng)的清除能力，其IC50值為(5.80±0) mg/L，清除力甚至強(qiáng)于陽性對照BHT，與前人的研究結(jié)果一致[10,30]。通過高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，7 類油茶果殼提取物均含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，且存在一定的差異，以大極性和中等極性化合物居多，油茶果殼提取物表現(xiàn)出的抗真菌、抗氧化和殺線蟲活性與這些成分的關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究。此外，本研究中僅對油茶果殼次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了初步分析，應(yīng)進(jìn)一步分離鑒定其中的活性物質(zhì)，闡明其化學(xué)結(jié)構(gòu)和活性機(jī)理。