周佳琪，馬春燕，李曉暉,*

（1.大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.大連理工大學(xué)化工學(xué)院，遼寧 大連 116024）

高血壓是一種高發(fā)性心血管疾病，全世界近10 億人患有高血壓，預(yù)計(jì)到2025 年，高血壓患病人數(shù)將達(dá)到15.6 億[1-2]。在血壓復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，血管緊張素I 轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme, ACE,EC 3.4.15.1）作為一種關(guān)鍵酶，通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin system, RAS）和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（kallikrein-kinin system, KKS）參與血壓調(diào)節(jié)[3-4]。在RAS 中，ACE 可催化血管緊張素I 轉(zhuǎn)化為能夠使血管收縮的血管緊張素II[5]，而在KKS 中，ACE 能夠切割緩激肽C-端的二肽殘基，導(dǎo)致其失去血管擴(kuò)張的功能，造成血壓升高[6-7]。因此，抑制ACE 一直是治療高血壓的一種有效方法。目前市面上已有降壓藥，降壓效果強(qiáng)，但在服用后往往會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生副作用[8-10]。然而，具備ACE 抑制功效的生物活性肽由于分子量小，易吸收，無毒副作用，安全性高等特點(diǎn)[11-12]，具有研發(fā)降壓藥物的潛力。

ACE 是一種鋅金屬蛋白酶，具有C-端和N-端兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，C-端結(jié)構(gòu)域包括3 個(gè)催化活性位點(diǎn)S1、S1’和S2，S1 活性口袋包含Ala354、Glu384和Tyr523；S2 包含Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520；S1’包含Glu162，三個(gè)位點(diǎn)均具備疏水性特征[13]。大多數(shù)ACE 抑制肽都作用于其C-端結(jié)構(gòu)域[14]，ACE抑制肽序列中疏水氨基酸殘基的含量，在一定程度上決定了其ACE 抑制活性[15]。ACE 的3 個(gè)活性位點(diǎn)有各自親和的氨基酸殘基，S1 親和Pro 和芳香族氨基酸；S1’親和Val、Ala 和Leu；S2 親和Ile[16-17]。多肽C-末端3 個(gè)氨基酸殘基的改變對(duì)ACE 抑制活性影響較大[18]。研究表明多肽C-末端第2 個(gè)氨基酸為L(zhǎng)ys 或Arg 時(shí)對(duì)ACE 的抑制活性會(huì)有所提高[19-20]。此外，當(dāng)多肽的N-端含疏水性氨基酸Ala、Leu、Ile 和Val 時(shí)，能夠促進(jìn)多肽與ACE 催化活性位點(diǎn)的結(jié)合。

目前，合成得到的許多多肽類ACE 抑制劑已被證明具有良好的ACE 抑制活性，例如，Ashok 等[21]使用固相合成法合成了水牛初乳蛋白中的ACE 抑制肽GIPLPLI（IC50為74 μmol/L）。Mirzaei 等[13]通過固相合成4 種YR-10（YGKPVAVPAR，來源于釀酒酵母蛋白）的多肽類似物，篩選出較YR-10 ACE抑制活性更高YHR-10（YGKHVAVHAR），并進(jìn)一步研究了合成肽YHR-10 的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，發(fā)現(xiàn)通過除去YR-10 N-末端的Tyr 和C-末端的Arg 得到的GA-8（GKPVAVPA），ACE 抑制活性降低了3.31倍。此外，Deng 等[22]設(shè)計(jì)了10 種抗氧化肽LWHTH（來源于海鞘組織）的多肽類似物，經(jīng)過固相合成得到的多肽類似物CWHTH 不僅具備抗氧化活性，還發(fā)現(xiàn)其對(duì)ACE 表現(xiàn)出了良好的抑制作用。

雖然近年來已有大量動(dòng)物源ACE 抑制肽被分離鑒定，但大量抑制肽仍具有提升ACE 抑制活性的空間。定向改造多肽不僅能夠發(fā)掘高活性多肽，也可以了解多肽性質(zhì)與功能的聯(lián)系。丙氨酸掃描文庫(kù)技術(shù)是一種有價(jià)值的方法，已被廣泛應(yīng)用于多肽的構(gòu)效關(guān)系研究中[23]。同時(shí)，隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，大量的多肽信息被儲(chǔ)存于數(shù)據(jù)庫(kù)中并且建立了多肽分析及活性預(yù)測(cè)工具，利用這些工具可以快速篩選生物活性肽。

本研究前期從豬血紅蛋白源多肽（Pig Hemoglobin Peptide, PHP）中篩選出了2 條ACE 抑制肽：PHP1（VVYPWT）和PHP2（TKTYFPHF），IC50分別為7.42 和5.33 μmol/L[24-25]，具備較高的ACE 抑制活性，但這2 條ACE 抑制肽的構(gòu)效關(guān)系尚未明確。因此，本文以PHP1 和PHP2 作為研究母肽，利用丙氨酸掃描文庫(kù)技術(shù)結(jié)合生物活性預(yù)測(cè)工具對(duì)研究母肽進(jìn)行定向改造，設(shè)計(jì)新型多肽類ACE 抑制劑，篩選高ACE 抑制活性多肽，研究多肽序列中氨基酸疏水性、帶電性及空間位阻等性質(zhì)對(duì)其活性的影響，探索構(gòu)效關(guān)系，同時(shí)發(fā)掘具備多種生物活性的ACE 抑制肽，為開發(fā)多功能性的多肽產(chǎn)品提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Fmoc-Thr（tBu）-王樹脂、Fmoc-Phe-王樹脂、Fmoc-氨基酸、Boc-氨基酸、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽（O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate, HBTU）、1-羥基苯并三唑（1-Hydroxybenzotriazole, HOBt）、N，N’-二異丙基乙胺（N,N'-Diisopropylethylamine, DIEA）、三異丙基硅烷（Triisopropylsilane, TIS） 吉爾生化（上海）有限公司；乙腈 色譜純，美國(guó)TEDIA；血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶（ACE，源自兔肺，酶活力≥2.0 U/mg 蛋白）、N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰基]-Phe-雙甘氨酸（N-[3-（2-furyl）acryloyl]-L-phenylalanyl-glycyl-glycine, FAPGG）

Sigma 公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（2-[4-（2-hydroxyethyl） piperazin-1-yl]ethanesulfonicacid, HEPES）

阿拉丁試劑有限公司；α-葡萄糖苷酶（酶活力1 kU/13.2 mg） 北京索萊寶科技有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,p-NPG） 上海源葉生物科技有限公司；總抗氧化能力試劑盒 上海碧云天試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

島津LC-20A 型高效液相色譜儀、島津LC-20AP制備型高效液相色譜儀 日本島津公司；YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×150 mm，粒度5 μm）分析色譜柱日本YMC 公司；Agilent ZORBAX SB-C18（21.2 mm×150 mm，粒度5 μm）制備色譜柱、Agilent 1260/6130 型液質(zhì)聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent 公司；HXGL-10-50B 型冷凍干燥機(jī) 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；Molecular Devices 多功能讀板機(jī) 美國(guó)Thermo 公司；100 mL G-2 固相合成反應(yīng)管 日本Cosumosubiido 株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多肽類似物的設(shè)計(jì)及生物信息學(xué)分析

1.2.1.1 多肽類似物的設(shè)計(jì) 利用丙氨酸掃描文庫(kù)技術(shù)結(jié)合生物活性預(yù)測(cè)工具PeptideRanker 篩選母肽PHP1 及PHP2 的可突變位點(diǎn)。根據(jù)氨基酸的疏水性、帶電性和空間位阻，將母肽PHP1 及PHP2 序列中部分氨基酸殘基進(jìn)行替換，設(shè)計(jì)多肽類ACE 抑制劑類似物序列。

1.2.1.2 多肽類似物的生物信息學(xué)分析 多肽的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)：使用ExPASy（https://www.expasy.org/）的ProtParam 分析工具分析多肽的各項(xiàng)理化參數(shù)，包括理論等電點(diǎn)、凈電荷、疏水性殘基比率、半衰期[26]等。

多肽的生物活性、毒性預(yù)測(cè)：利用BIOPEPUWM（https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/）的Bioactivity prediction 模塊中的AHTpin 平臺(tái)預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)的多肽類似物是否具備ACE 抑制活性[27]。利用Bioware 生信分析工具（http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/）的PeptideRanker 模塊預(yù)測(cè)多肽的潛在生物活性[28]。利用ToxinPred 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/index.html）預(yù)測(cè)多肽的毒性[29]。

1.2.2 多肽的固相合成及純化

1.2.2.1 固相合成目標(biāo)肽 利用固相合成法合成目標(biāo)肽，多肽鏈C-末端的氨基酸（amino acid，aa）固定于王樹脂（即Fmoc-aa-王樹脂），以該氨基酸的氨基端作為合成起點(diǎn)，根據(jù)多肽從C-端到N-端的合成順序，通過氨基酸間的脫水縮合使下一位氨基酸偶聯(lián)到樹脂上，直到目標(biāo)肽N-末端最后一個(gè)氨基酸反應(yīng)完為止，實(shí)現(xiàn)將目標(biāo)肽鏈連接到樹脂上，隨后切割樹脂，得到目標(biāo)肽。具體合成步驟如下：

溶脹Fmoc-aa-王樹脂：取1 g Fmoc-aa-王樹脂，裝入固相合成器中，移取15 mL 二氯甲烷（Dichloromethane, DCM）加入其中等待15 min，使樹脂得到充分膨潤(rùn)，隨后抽濾除去DCM。

脫除氨基保護(hù)基Fmoc：加入15 mL 體積分?jǐn)?shù)為20%的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide，DMF）攪 拌 反 應(yīng)30 min 后 抽 濾，用DCM 和異丙醇反復(fù)洗滌并抽干，取出微量樹脂，通過Kaiser 法檢測(cè)樹脂顏色變化，以此來監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，若樹脂呈現(xiàn)藍(lán)紫色，說明Fmoc 已除去，氨基酸的氨基暴露，可進(jìn)行下一步反應(yīng)。

目標(biāo)肽的產(chǎn)生：將Fmoc-氨基酸（2 eq）和縮合試劑HBTU（2 eq）、HOBt（2 eq）依次溶于DMF 中，加入到固相合成器中，加入氨基酸活化試劑DIEA（4 eq），攪拌反應(yīng)1.5 h，經(jīng)DCM 和異丙醇洗滌，參照Kaiser 法[30]監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，由此實(shí)現(xiàn)肽鏈的延長(zhǎng)。重復(fù)上述脫除Fmoc 和肽鏈延長(zhǎng)步驟過程，直至接入目標(biāo)肽N-末端最后一個(gè)由Boc/Fmoc 保護(hù)的氨基酸，至此側(cè)鏈及N-端保護(hù)的目標(biāo)肽連接到了樹脂上。若最后一個(gè)氨基酸由Fmoc 保護(hù)，則先脫除Fmoc，再進(jìn)行下一步操作。

樹脂及保護(hù)基的切割：將合成完畢的肽鏈-樹脂用15 mL DCM 溶脹后抽濾，加入15 mL 三氟乙酸（trifluoroacetic acid, TFA）/TIS/H2O（體積比 95:2.5:2.5），常溫下反應(yīng)1.5～2.5 h，取出反應(yīng)液旋蒸干燥，倒入冰乙醚結(jié)晶，待乙醚揮發(fā)完全加入甲醇溶解樣品，旋蒸干燥后加入冰乙醚再次結(jié)晶，取沉淀減壓干燥，得到多肽粗品。

1.2.2.2 目標(biāo)肽的純化 RP-HPLC 制備精制：ZORBAX SB-C18制備色譜柱，流動(dòng)相A：0.1% TFA/水，B：0.1% TFA/乙腈；洗脫條件：流動(dòng)相B 在0～20 min，梯度變化為30%～80%；220 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)，流速20.0 mL·min-1；進(jìn)樣0.5 mL，柱溫30 ℃。產(chǎn)物經(jīng)真空冷凍干燥處理后經(jīng)質(zhì)譜鑒定分子量。

RP-HPLC 純度分析：YMC-Pack ODS-A 分析色譜柱，流動(dòng)相A：0.1% TFA/水，B：0.1% TFA/乙腈；洗脫條件：流動(dòng)相B 在0～15 min，梯度變化為30%～80%；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣10 μL，柱溫30 ℃。

1.2.3 多肽的體外生物活性測(cè)定

1.2.3.1 ACE 抑制活性測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[31]的方法測(cè)定ACE 抑制活性。首先，F(xiàn)APGG 用含有300 mmol/L NaCl 的80 mmol/L HEPES 緩沖液（pH8.3）配制成1 mmol/L 的溶液。精確稱取多肽樣品4 mg，用緩沖液配制成2000 μg/mL，稀釋到400、80、16、3.2、0.64 μg/mL 不同濃度，取這6 個(gè)濃度梯度的樣品溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，做3 組平行。取40 μL 樣品和50 μL FAPGG 溶液混勻，隨后加入10 μL 的ACE 溶液（0.1 U/mL），立即置于340 nm 下檢測(cè)吸光度，隨后放入培養(yǎng)箱，37 ℃下孵育，待反應(yīng)30 min 后再次檢測(cè)吸光度。HEPES 緩沖液作為空白對(duì)照組，在同等條件下測(cè)定反應(yīng)前后吸光度差值。計(jì)算對(duì)ACE 的抑制率達(dá)到50%時(shí)的多肽濃度IC50，ACE 抑制率的計(jì)算公式如下：

式中：A 為樣品組反應(yīng)前后的吸光度差值；B 為空白對(duì)照組反應(yīng)前后吸光度差值。

1.2.3.2α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性測(cè)定采用優(yōu)化的Xu 等[32]的方法。精確稱取多肽樣品4 mg，用PBS 緩沖液配制成2000 μg/mL，稀釋到1000、100、10、1、0.1 μg/mL 不同濃度，取這6 個(gè)濃度梯度的樣品溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，做3 組平行。取20 μL p-NPG 溶液（9 mmol/L）與20 μL樣品溶液混勻，37 ℃下孵育10 min，隨后加入20 μLα-葡萄糖苷酶溶液（0.2 U/mL），37 ℃下反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束后立即加入150 μL Na2CO3溶液（0.1 mmol/L）終止反應(yīng)，于405 nm 處測(cè)定吸光度。采用下方公式計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率：

式中：A1為樣品、酶和p-NPG 混合液的吸光值；A2為緩沖液代替樣品溶液的吸光值；A0為緩沖液代替酶溶液后混合物的吸光值。

1.2.3.3 抗氧化活性測(cè)定 采用ABTS 法[22]表征多肽樣品的抗氧化活性，具體操作方法參照總抗氧化能力試劑盒的說明。儲(chǔ)備溶液包括ABTS 溶液和氧化劑溶液，將兩者等量混合，室溫避光存放16 h 得到ABTS 工作母液，用80%乙醇稀釋得到ABTS 工作液，于734 nm 下測(cè)定吸光度（工作液吸光值-空白對(duì)照吸光值=0.7±0.05）。用80%乙醇將多肽樣品配制成1 mg/mL 的溶液。將200 μL ABTS 工作液加入96 孔板的檢測(cè)孔中，隨后加入10 μL 樣品溶液并混勻，室溫孵育2～6 min，測(cè)定A734。蒸餾水作空白對(duì)照，Trolox 作陽(yáng)性對(duì)照。ABTS 自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A 為加入樣品和ABTS 的吸光值；B 為不加樣品，加入ABTS 的吸光值。

1.2.4 多肽與ACE 的分子對(duì)接 從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載ACE-Lisinopril 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：1O8A），使用Pymol 軟件對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，刪除Lisinopril 配體，去水，加氫，得到ACE 蛋白分子。使用ChemBioDrawUltra 14.0 繪制多肽分子，之后利用ChemBio 3D Ultra 14.0 對(duì)多肽進(jìn)行能量最小化處理，得到多肽小分子空間構(gòu)象。利用AutoDock Vina 軟件打開處理過的ACE 大分子和多肽小分子，將其分別設(shè)置為受體和配體，設(shè)置對(duì)接盒子，選擇半柔性對(duì)接方式，進(jìn)行20 次對(duì)接。分析對(duì)接結(jié)合能，選取對(duì)接結(jié)果中的最佳構(gòu)象，使用Pymol 軟件和Protein-Ligand Interaction Profiler 在線工具進(jìn)一步分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用軟件SPSS 16.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，數(shù)值用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個(gè)試驗(yàn)平行三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽類似物的設(shè)計(jì)

以ACE 抑制肽PHP1 和PHP2 為研究母肽，對(duì)PHP1 和PHP2 進(jìn)行丙氨酸掃描，即用丙氨酸逐一替換多肽序列中的非丙氨酸殘基，構(gòu)建丙氨酸掃描文庫(kù)。得到的14 種多肽片段通過PeptideRanker 進(jìn)行生物活性預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)PHP1 序列第3、4、5 位的Tyr、Pro、Trp 和PHP2 序列第4、5、6、8 位的Tyr、Phe、Pro、Phe 分別用Ala 替換后，預(yù)測(cè)活性明顯降低，說明母肽序列中處于這些位置的原氨基酸殘基改變可能會(huì)導(dǎo)致其活性的降低甚至喪失。因此，本研究在設(shè)計(jì)新型多肽類ACE 抑制劑時(shí)，保留母肽序列中這些位置的氨基酸殘基，改變其他位置的氨基酸殘基，設(shè)計(jì)的19 個(gè)多肽類似物見表1。

表1 PHP1、PHP2 及其類似物的序列Table 1 Sequence of PHP1, PHP2 and their analogues

優(yōu)化PHP1 第1、2、6 位氨基酸殘基：將母肽PHP1 序列中第1 和2 位Val 殘基替換為帶巰基的Cys，分別得到多肽類似物PHP1A-1 和PHP1A-2；將母肽PHP1、PHP1A-1 和PHP1A-2 序列中的C-端Thr 殘基替換為強(qiáng)疏水性的芳香族氨基酸Phe，分別得到PHP1A-3、PHP1A-4 和PHP1A-5；在PHP1A-3 基礎(chǔ)上，將序列中第1、2 位的Val 殘基，分別用空間位阻小的Gly 和Ala 替換，得到PHP1A-6 和PHP1A-7。

優(yōu)化PHP2 第1、2、3、7 位氨基酸殘基：將母肽PHP2 序列中第3 位的Thr 殘基變?yōu)槭杷詮?qiáng)的Leu，得到PHP2A-1；將PHP2A-1 中的第1 位Thr 殘基替換為疏水性強(qiáng)的Ile 和Ala，分別得到PHP2A-2 和PHP2A-3；在PHP2A-2 和PHP2A-3 基礎(chǔ)上，將序列中第2 位帶正電荷的Lys 殘基替換為不帶電荷且具有疏水性的Ala，得到PHP2A-4 和PHP2A-5；將PHP2A-5 序列第7 位帶正電荷的His 替換為不帶電荷的Leu，得到PHP2A-6；將PHP2A-3 序列第3 位的Lue 替換為Ala，第7 位的His 殘基用帶有胍基的Arg 替換，得到PHP2A-7；將PHP2A-3～PHP2A-7 中的Ala 殘基替換為側(cè)鏈更小的Gly，得到PHP2A-8～PHP2A-12。

2.2 多肽的理化性質(zhì)

PHP1 和PHP2 及多肽類似物的各項(xiàng)理化性質(zhì)如表2 所示。PHP1 系列的等電點(diǎn)均在5.5 左右，PHP2 系列的等電點(diǎn)在5.5～10 之間?？偲骄H水性指數(shù)（GRAVY）是多肽中氨基酸殘基親水值總和的平均值，正值越大疏水性越強(qiáng)，負(fù)值越大親水性越強(qiáng)，PHP1 及類似物都是疏水性多肽，PHP2 系列中，PHP2A-12 親水性最強(qiáng)，PHP2A-6 疏水性最強(qiáng)。脂肪族氨基酸指數(shù)（Aliphatic index）可作為多肽的熱穩(wěn)定性指標(biāo)，指數(shù)越高熱穩(wěn)定性越高，PHP1、PHP1A-3、 PHP2A-2、 PHP2A-4、 PHP2A-6、 PHP2A-9 及PHP2A-11 的熱穩(wěn)定性相對(duì)較高。非穩(wěn)定性指數(shù)（Instability index）是多肽穩(wěn)定性的參考數(shù)值，指數(shù)＜40 被定義為穩(wěn)定性多肽，除PHP2A-11 外，其余序列均為穩(wěn)定性多肽。半衰期（Half-life）預(yù)測(cè)結(jié)果表明N-端氨基酸殘基的改變對(duì)多肽在細(xì)胞內(nèi)的半衰期影響較大，C-端氨基酸殘基改變對(duì)其影響較小。

PeptideRanker 預(yù)測(cè)得出的生物活性分?jǐn)?shù)代表了多肽具備生物活性的可能性大小，閾值為0.5，即任何預(yù)測(cè)超過0.5 閾值的多肽都被認(rèn)為具備潛在的生物活性，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示多肽類似物均具有潛在的生物活性，且絕大多數(shù)肽具有較高的活性分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。此外，AHTpin 平臺(tái)預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)的多肽類似物均具備ACE 抑制活性，ToxinPred 預(yù)測(cè)所有設(shè)計(jì)的多肽均沒有毒性。

表2 PHP1、PHP2 及其類似物的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of PHP1, PHP2 and their analogues

2.3 多肽的合成純化與體外生物活性

如表3 所示，通過多肽固相合成法合成了母肽及其類似物，并通過反相高效液相進(jìn)行了分析及純化，目標(biāo)多肽經(jīng)純化后的純度均在95%以上。經(jīng)質(zhì)譜確定目的多肽分子量與理論分子量一致。

母肽PHP1、PHP2 及其多肽類似物的ACE 抑制活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性結(jié)果如表3 所示。

表3 合成肽的生物活性Table 3 Bioactivity of synthetic peptides

ACE 抑制活性結(jié)果表明PHP1A-6、PHP2A-3、PHP2A-4、PHP2A-7 的抑制活性最高，IC50分別為3.87、3.33、2.86 和4.58 μmol/L，PHP1A-6、PHP2A-7 與母肽活性相比差異顯著（P＜0.05），PHP2A-3、PHP2A-4 與母肽活性相比差異極顯著（P＜0.01），它們的抑制活性比母肽高2～3 倍；PHP1A-3、PHP1A-4、PHP1A-7、PHP2A-1 和PHP2A-10 具有同母肽相當(dāng)?shù)囊种苹钚?。多肽類似物改變N-端氨基酸殘基會(huì)導(dǎo)致抑制活性發(fā)生較大變化，Liu 等[33]指出多肽N-端氨基酸的改變會(huì)影響食物來源ACE 抑制肽的活性。在PHP1 系列設(shè)計(jì)肽中，N-端使用疏水性更弱的Cys 替換Val（PHP1A-1、PHP1A-2），衍生肽活性與母肽相比顯著降低；在PHP2 系列設(shè)計(jì)肽中，N-端Thr 和Lys 替換成疏水性更強(qiáng)的Ile 或Leu 或Ala得到的PHP2A-1、PHP2A-3、PHP2A-4 有較高的ACE 抑制活性。表明疏水性對(duì)不同多肽ACE 抑制活性會(huì)產(chǎn)生不同的影響，在多肽序列N-端含有Val、Leu、Ala、Ile 等疏水性氨基酸時(shí)，多肽與ACE 活性中心的結(jié)合效率有所增強(qiáng)，從而增加了對(duì)ACE 的抑制活性[34]。

PHP1 系列設(shè)計(jì)肽中，N-端氨基酸Val 用空間位阻小的Gly 或Ala 替代后具有高ACE 抑制活性；而在PHP2 系列設(shè)計(jì)肽中，N-端氨基酸Thr 或Lys 用空間位阻小的Gly 或Ala 替代后仍能夠保持良好的ACE 抑制活性，體現(xiàn)了多肽中氨基酸空間位阻的變化對(duì)ACE 抑制活性有影響[35]。PHP2 系列多肽帶電性與ACE 抑制活性沒有明顯的相關(guān)性。

多肽C-端氨基酸的改變也會(huì)對(duì)活性產(chǎn)生影響。當(dāng)酪蛋白和羊奶乳清提取多肽的C-端三個(gè)氨基酸中存在Pro 時(shí)，會(huì)提高其ACE 抑制活性[36]，芳香族氨基酸Phe、Tyr、Trp 的存在也會(huì)增強(qiáng)多肽對(duì)ACE 的抑制作用[37]。本研究設(shè)計(jì)多肽的C-端三肽中保留了原有的Pro 或?qū)-端的Thr 替換為Phe 后，設(shè)計(jì)肽仍能保持與母肽相當(dāng)?shù)幕钚?。此外，PHP2 序列中的His 替換為L(zhǎng)eu 會(huì)降低ACE 抑制活性，PHP2A-7 中Arg 的引入對(duì)其活性產(chǎn)生了積極影響。本研究發(fā)現(xiàn)C-端第二位為His 或Arg 時(shí)對(duì)多肽的ACE 抑制活性有著非常重要的作用，原因可能是His 的咪唑環(huán)和Arg 的側(cè)鏈胍基的存在會(huì)更有利于多肽與ACE 的結(jié)合[13]。

綜上所述，多肽序列中氨基酸殘基的疏水性、空間位阻及其序列中位置對(duì)其ACE 抑制活性影響較大。

α-葡萄糖苷酶抑制活性結(jié)果顯示，母肽及其多肽類似物的α-葡萄糖苷酶抑制活性與PeptideRanker預(yù)測(cè)活性接近。母肽PHP1 的α-葡萄糖苷酶抑制作用不明顯，PHP2 的抑制活性IC50為296.79 μmol/L。PHP1 系列多肽類似物抑制活性較母肽都有明顯提高，其中，PHP1A-3 和PHP1A-7 的IC50分別為3.09，9.51 μmol/L，它們具備高活性的原因分析是肽段C-端含有的Phe 增加了多肽的疏水性，因此增加了α-葡萄糖苷酶抑制活性。與PHP1A-3 比較發(fā)現(xiàn)，PHP1A-7的序列N-端用Ala 替代序列中的Val 后，多肽的活性降低了，這與研究發(fā)現(xiàn)的高活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽往往是高度疏水的，多肽中的強(qiáng)疏水性氨基酸Val、Ile、Leu 及Phe、Pro、Ala 等疏水氨基酸殘基更易與α-葡萄糖苷酶的氨基酸殘基結(jié)合，從而發(fā)揮對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制的結(jié)論一致[38-40]。分析認(rèn)為多肽N-端疏水性強(qiáng)具有更高的α-葡萄糖苷酶抑制作用。

研究表明，高α-葡萄糖苷酶抑制活性多肽的凈電荷多為0 或+2[41]，本研究中PHP2 系列設(shè)計(jì)肽中除PHP2A-7 和PHP2A-10 外，其余凈電荷為0 或+2的多肽活性較母肽均有顯著提高，表明凈電荷可能與PHP2 系列設(shè)計(jì)肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性有關(guān)。與PHP2A-3 相比，Ala、Arg 替換Leu、His 得到的PHP2A-7 降低了多肽疏水性，可能是導(dǎo)致其α-葡萄糖苷酶抑制活性降低的原因；同樣的，與PHP2A-9 相比，用Gly 替換Ile 得到的PHP2A-10 抑制活性也較母肽有所降低。

多肽類似物PHP2A-6、PHP2A-11 和PHP2A-12 表現(xiàn)出了最高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50分別為5.58、2.35 和3.98 μmol/L，較母肽有極顯著性提高（P＜0.01），三種多肽類似物均具有潛在的降血糖活性。Arise 等[42]發(fā)現(xiàn)多肽中Leu 含量高可能會(huì)增加α-葡萄糖苷酶抑制活性，PHP2A-6、PHP2A-11 序列中含有2 個(gè)Leu 可能是其具備高活性的原因。多肽序列中氨基酸空間位阻的變化與其α-葡萄糖苷酶抑制活性沒有相關(guān)性。

綜上所述，多肽序列中氨基酸的疏水性、凈電荷及其序列中位置對(duì)其α-葡萄糖苷酶抑制活性影響較大。

抗氧化活性表明，多肽濃度為1 mg/mL 時(shí)，含有Cys 的多肽類似物PHP1A-1、PHP1A-2、PHP1A-4 和PHP1A-5 的ABTS+·清除率均較高，與母肽相比差異極顯著（P＜0.01），這是因?yàn)镃ys 上的巰基使得多肽具備強(qiáng)的抗氧化能力[43]，本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cys 殘基處于肽鏈N-端第1 位比在2 位時(shí)具有更好的抗氧化能力，可能是由于Cys 處于末端時(shí)，多肽巰基基團(tuán)更易與自由基接觸產(chǎn)生反應(yīng)。研究表明多肽序列中存在Leu、Pro、Phe、Ala 等疏水性氨基酸有利于提高抗氧化活性，可能是疏水性氨基酸作為供氫體與ABTS+·反應(yīng)，提高了多肽的自由基清除能力[44]。PHP2A-5 和PHP2A-6 的抗氧化活性較母肽有所提高，這可能與Ala 替換了Thr、Lys，Leu 替換了His，保留了序列中的Pro、Phe，提高了多肽的疏水性有關(guān)。

2.4 ACE 抑制肽-ACE 的分子對(duì)接

ACE 抑制活性 較高的PHP1A-6、PHP2A-3、PHP2A-4 和PHP2A-7 分別與ACE 進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果經(jīng)Pymol 軟件分析抑制肽與ACE 的氨基酸殘基之間形成的氫鍵情況（如圖1）。經(jīng)Protein-Ligand Interaction Profiler 分析抑制肽與ACE 疏水相互作用、π-π堆積及鹽橋。

圖1 ACE 與多肽類似物的復(fù)合物模型Fig.1 The models of ACE in complex with the peptide analogues

PHP1A-6 與ACE 的Asn277（2.9 ?）、Ala354（3.2 ?）、Glu376（2.8 ?）、Glu376（2.9 ?）、Asp377（2.9 ?）、Glu384（3.0 ?）、Asp453（2.7 ?）、Lys454（3.0 ?）之間形成8 個(gè)氫鍵，其中，Ala354、Glu384在ACE 的S1 活性口袋中，PHP1A-6 進(jìn)入ACE 活性口袋，C-端和N-端氨基酸殘基都與ACE 產(chǎn)生了氫鍵相互作用，其中N-端Gly讓出了更大的空間使得肽鏈中其余氨基酸殘基與ACE 產(chǎn)生了氫鍵。PHP1A-6 與ACE 的Thr166、Trp279、Glu376、Val379、His383、Phe512、Val518、Tyr523之間存在疏水相互作用。PHP1A-6 中Trp 的吲哚基與His383的咪唑環(huán)之間形成了π-π堆積作用。PHP1A-6 的C-端羧基與His383、His387之間形成了鹽橋。

PHP2A-3 與ACE 的Glu162（3.0 ?）、Gln281（3.1 ?）、Thr282（2.7 ?）、His353（3.1 ?）、Glu376（2.9 ?）、His513（2.7 ?）、Tyr523（2.7 ?）之間形成7 個(gè)氫鍵。PHP2A-3 與 Ala354、 Trp357、 Val379、 Val380、 His383、 Phe457、Phe512、Val518、Tyr523、Phe527之間產(chǎn)生疏水相互作用。PHP2A-3 中Tyr 的芳香環(huán)與His387之間形成了π-π堆積作用。

PHP2A-4 與ACE 的Glu162（2.8 ?）、Thr282（2.8?）、His353（3.2 ?）、His513（2.9 ?）、Tyr523（2.8 ?）之間形成5 個(gè) 氫 鍵。PHP2A-4 與Ala354、Asp358、Tyr360、Val379、Val380、His383、Phe391、Phe457、Phe512、Val518、Tyr523、Phe527之間產(chǎn)生疏水相互作用。PHP2A-4 中Tyr 的芳香環(huán)與His387之間形成了π-π堆積。

PHP2A-7 與ACE 的Glu162（3.1 ?）、Thr282（2.8 ?）、His353（3.1 ?）、Glu376（2.9 ?）、Asp377（3.0 ?）、His513（2.7 ?）、Tyr523（2.7 ?）之間形成7 個(gè)氫鍵。PHP2A-7 與 Trp279、 Thr282、 Ala354、 Trp357、 Val379、 Val380、His383、Phe457、Phe512、Val518、Tyr523、Phe527之間產(chǎn)生疏水相互作用。PHP2A-7 中Tyr 和Phe 的芳香環(huán)與His383、His387產(chǎn)生了π-π堆積作用。肽鏈中的Arg與Glu162、Glu376、Asp377作用形成了鹽橋。

PHP2A-3、PHP2A-4 及PHP2A-7 主要與S1 活性口袋中的Tyr523，S2 的His353，His513，S1’形成了氫鍵相互作用。PHP2A-3、PHP2A-4 和PHP2A-7 主要是其N-端高疏水性氨基酸殘基與ACE 之間產(chǎn)生了疏水相互作用，C-端氨基酸與ACE 的部分氨基酸殘基之間產(chǎn)生了氫鍵、肽鏈中的Tyr 和Phe 與ACE的His387形成了π-π堆積，PHP2A-7 的Arg 還與ACE之間產(chǎn)生了鹽橋，從而發(fā)揮較強(qiáng)的ACE 抑制作用，因此，證明了PHP2 系列多肽N-端氨基酸殘基疏水性強(qiáng)會(huì)增加對(duì)ACE 抑制活性，并且保留C-端的Phe和Pro 及引入Arg 對(duì)ACE 的抑制起到了積極的作用。

3 結(jié)論

本研究以ACE 抑制肽PHP1 和PHP2 為母肽，經(jīng)丙氨酸掃描誘變結(jié)合生物活性預(yù)測(cè)篩選出了母肽序列中的可突變位點(diǎn)并對(duì)其進(jìn)行氨基酸替換，設(shè)計(jì)了19 個(gè)新型ACE 抑制肽類似物。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，多肽類似物均具備潛在的生物活性且無毒性。通過固相合成法合成了母肽及其類似物，產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC 純化和分析后的純度均在95%以上。ESI-MS 鑒定目的多肽分子量與理論分子量一致。通過驗(yàn)證新型多肽的體外生物活性，表明氨基酸殘基的疏水性、空間位阻及其序列中位置對(duì)ACE 抑制活性影響較大，多肽的N-端疏水性越強(qiáng)，ACE 抑制作用越強(qiáng)，當(dāng)N-端氨基酸替換為空間位阻小的Gly 和Ala 時(shí)，多肽的ACE 抑制活性變強(qiáng)。對(duì)新型多肽分子和ACE 進(jìn)行分子對(duì)接，多肽抑制劑與ACE 之間形成多個(gè)氫鍵、疏水相互作用、π-π堆積和鹽橋，增加了對(duì)ACE 的抑制作用。綜上，本研究設(shè)計(jì)的多肽類似物均具有較高的ACE 抑制活性，其中，PHP1A-6、PHP2A-3、PHP2A-4 和PHP2A-7 的ACE 抑制活性較母肽有顯著性提高（P＜0.05），PHP1A-3、PHP1A-4、PHP1A-7、PHP2A-1 和PHP2A-10 具有同母肽相當(dāng)?shù)囊种苹钚?，其余多肽類似物的ACE 抑制活性較母肽有所降低，IC50介于10～60 μmol/L 范圍內(nèi)。絕大部分多肽類似物的α-葡萄糖苷酶抑制活性與母肽相比均有明顯提高，PHP1A-3、PHP1A-7、PHP2A-6、PHP2A-11 和PHP2A-12 的α-葡萄糖苷酶抑制作用最強(qiáng)。其中，PHP1A-3 和PHP1A-7 具備較強(qiáng)的ACE 抑制和α-葡萄糖苷酶抑制雙重活性，具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。多肽類似物中含有Cys 的片段具有較高的ABTS+·清除率，具備潛在的抗氧化活性。