張銳柳海平趙寧李愛(ài)強(qiáng)柴喜平

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

外泌體(Exosomes)是由多種細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞外囊泡(EVs)，直徑為40～100 nm，與細(xì)胞具有相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸及糖綴合物，其包含一系列膜相關(guān)的高階寡聚蛋白復(fù)合物，表現(xiàn)出明顯的分子異質(zhì)性，所具有的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)能夠輕松地與其他細(xì)胞的細(xì)胞膜融合，可以通過(guò)直接接觸、內(nèi)分泌或旁分泌的方式將其內(nèi)含的生物活性物質(zhì)選擇性地傳遞進(jìn)入靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑及細(xì)胞間信號(hào)分子的傳遞。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞間囊泡的運(yùn)輸方式在人類健康和疾病的許多方面發(fā)揮著重要作用，包括發(fā)育、免疫、組織動(dòng)態(tài)平衡、癌癥和退行性疾病[1-2]。近年來(lái)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞源性外泌體可以調(diào)節(jié)骨代謝，重建骨平衡，與骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)有著密切的關(guān)系[3]。本文意在對(duì)不同細(xì)胞源性外泌體與骨質(zhì)疏松之間的關(guān)系及其治療OP的機(jī)制與可行性進(jìn)行綜述，以期為外泌體在OP的基礎(chǔ)研究與臨床診療中提供參考。

1 外泌體與骨穩(wěn)態(tài)

骨骼是人體的主要支撐框架，具有剛性及自我修復(fù)能力，它為軟器官提供保護(hù)，為負(fù)責(zé)造血和脂肪存儲(chǔ)的骨髓提供了穩(wěn)定的環(huán)境[4]。同時(shí)，骨組織是一種代謝高度活躍的組織，處于不斷的生理活動(dòng)中以去除舊的、受傷的骨，并新形成骨取代它，新形成的骨在促進(jìn)或保持骨強(qiáng)度和適應(yīng)不斷變化的生物力學(xué)方面具有更強(qiáng)的機(jī)械性能，健康的骨骼總是處于這種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，隨著年齡的增長(zhǎng)，當(dāng)骨吸收大于骨形成時(shí)，這種動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)時(shí)就會(huì)導(dǎo)致OP等嚴(yán)重疾病[5]。而這種動(dòng)態(tài)平衡即骨穩(wěn)態(tài)主要受成骨細(xì)胞(osteocblast，OB)、破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的調(diào)控。

OB是位于骨表面的大型立方體細(xì)胞，調(diào)控成骨，促進(jìn)骨基質(zhì)合成和隨后的礦化；OC是一種來(lái)源于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的大型多核細(xì)胞，能夠在吸收區(qū)分泌Cl-、H+、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和組織蛋白酶K(CtsK)來(lái)降解骨組織[6]；BMSCs是組織工程中最理想的種子細(xì)胞，在一定條件下可向成骨細(xì)胞定向分化，對(duì)于骨穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要[7]；骨形成與骨微環(huán)境中的血管生成密切相關(guān)，而骨微環(huán)境中血管的生成需要多種內(nèi)皮細(xì)胞與信號(hào)通路的參與[8]，因此內(nèi)皮細(xì)胞參與了骨微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持。上述OB、OC、BMSCs及內(nèi)皮細(xì)胞相互影響、相互調(diào)節(jié)，進(jìn)而維持骨穩(wěn)態(tài)，防治OP的發(fā)生。而細(xì)胞間信息相互交流的機(jī)制尚不清楚，傳統(tǒng)理論認(rèn)為細(xì)胞通過(guò)旁分泌途徑分泌相關(guān)細(xì)胞因子而進(jìn)行信息交流[9]。而外泌體是大多數(shù)細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，它們被脂質(zhì)雙分子層包裹，并攜帶蛋白質(zhì)、聚糖、脂質(zhì)、DNA、RNA等生物分子，其被其他細(xì)胞吸收時(shí)，這些生物分子被轉(zhuǎn)移并影響受體細(xì)胞的表型，從而發(fā)揮效應(yīng)[10]。作為細(xì)胞間交流和遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要介質(zhì)，近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)OB、OC、BMSCs及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的外泌體在維持骨穩(wěn)態(tài)、防治OP方面發(fā)揮了重要的作用。

2 不同細(xì)胞源性外泌體與骨質(zhì)疏松

2.1 BMSCs源性外泌體與OP

BMSCs分化方向在骨代謝中扮演著重要的角色，外因及信號(hào)處理過(guò)程如何調(diào)控其分化方向是目前研究的熱點(diǎn)，外泌體作為干細(xì)胞重要的旁分泌形式，可通過(guò)信號(hào)蛋白、RNA等物質(zhì)調(diào)控BMSCs增殖和分化改善骨質(zhì)疏松[11]。目前有多項(xiàng)研究報(bào)道，來(lái)源于BMSCs的外泌體(MSC-Exo)具有與BMSCs相似的功能，并且與BMSCs相比，MSC-Exo具有穩(wěn)定性好、易保存、無(wú)免疫源性、易獲得、轉(zhuǎn)化方便等優(yōu)點(diǎn)。因此具有上述特性的MSC-Exo可能是改善傳統(tǒng)BMSCs治療OP不足的理想替代品[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs來(lái)源的外泌體可通過(guò)多種信號(hào)通路來(lái)影響OP。絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是存在于哺乳動(dòng)物中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞外刺激到細(xì)胞核的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶[13]。研究表明成骨細(xì)胞的基因表達(dá)和功能發(fā)揮與MAPK信號(hào)通路的刺激有關(guān)[14]，Zhao等[12]從大鼠骨髓中分離出MSC，提取MSCs衍生的外泌體(MSC-Exo)，而后將成骨細(xì)胞系的hFOB 1.19細(xì)胞作為研究對(duì)象，設(shè)立空白對(duì)照組、MSC-Exo干預(yù)組、MSC-Exo+JNK基因敲除組，結(jié)果顯示，MSC-Exo干預(yù)組細(xì)胞存活率及細(xì)胞周期明顯高于其他兩組，因此得出結(jié)論，MSC-Exo可通過(guò)MAPK信號(hào)通路促進(jìn)hFOB 1.19細(xì)胞增殖，從而延緩骨質(zhì)疏松的發(fā)展。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)節(jié)骨代謝的重要分子途徑[15]，Wnt信號(hào)的激活有助于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成的骨量及強(qiáng)度的增加，因此，該通路對(duì)成骨細(xì)胞增殖及分化至關(guān)重要[16]。Zuo等[17]研究發(fā)現(xiàn)MSC-Exo可以減輕輻射誘導(dǎo)的大鼠骨丟失，機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、加速DNA損傷修復(fù)、減少與抑制增殖和細(xì)胞衰老相關(guān)的蛋白以及通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路恢復(fù)BMSCs成骨和成脂平衡相關(guān)。

核酸是外泌體的重要組成成分，包括mRNA、miRNA、lncRNA等[18]。其中miRNA是一類長(zhǎng)17～24個(gè)核苷酸的非編碼微小RNA[19]，包裹在外泌體中的miRNA能夠被靶細(xì)胞攝取與靶mRNA 3’UTR結(jié)合，進(jìn)而如同內(nèi)源性的miRNA通過(guò)沉默靶基因而發(fā)揮其作用[20]。干細(xì)胞源性外泌體很大程度上是通過(guò)其攜帶的miRNA發(fā)揮成骨作用。Qiu等[21]研究發(fā)現(xiàn)BMSC來(lái)源的外泌體miR-150-3p能夠促進(jìn)OB增殖和分化，機(jī)制與上調(diào)Runx2、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osterix)、堿性磷酸酶(ALP)及骨鈣素相關(guān)。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)MSC-Exo通過(guò)將miR-935傳遞到OB中抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)，而STAT1沉默則促進(jìn)了OB和礦化結(jié)節(jié)中的ALP活性，從而抑制骨質(zhì)疏松。Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)在MSCs成骨分化過(guò)程中，分化晚期細(xì)胞分泌的外泌體中miR-31、miR-144和miR-221低表達(dá)有助于誘導(dǎo)成骨分化，而分化晚期外泌體中miR-21顯著增加，而miR-21可作用于成骨分化抑制因子Spry1和Sox2，另一方面miR-21可以通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-AKT-GSK3β通路，激活Runx2的表達(dá)而促進(jìn)MSCs的成骨。lncRNA是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，現(xiàn)已成為MSCs成骨過(guò)程中的新型調(diào)節(jié)劑。miR-34c可通過(guò)靶向SATB2和Runx2因子及抑制Notch通路中的多種因子影響成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞，從而在骨穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[24]。MALAT1是最早鑒定出與人類疾病相關(guān)的lncRNA之一[25]，Yang等[26]研究發(fā)現(xiàn)MALAT1通過(guò)OPG/RANKL通路調(diào)節(jié)骨溶解，其下調(diào)可抑制破骨細(xì)胞活性。Yang等[27]研究發(fā)現(xiàn)miR-34c逆轉(zhuǎn)了MALAT1的作用，SATB2逆轉(zhuǎn)了miR-34c的作用，而B(niǎo)MSCs衍生的外泌體MALAT1通過(guò)介導(dǎo)miR-34c/SATB2軸增強(qiáng)了骨質(zhì)疏松小鼠的成骨細(xì)胞活性，可減輕骨質(zhì)疏松。

綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體不僅可以影響MAPK、Wnt/β-catenin等成骨相關(guān)信號(hào)通路，并且可通過(guò)其內(nèi)含的miRNA、lncRNA等物質(zhì)發(fā)揮調(diào)控BMSCs成骨分化的作用，從而減輕骨質(zhì)疏松。

2.2 OB源性外泌體與OP

OB是骨微環(huán)境的重要組成細(xì)胞，可通過(guò)分泌外泌體參與調(diào)節(jié)成骨-破骨平衡。Ge等[28]對(duì)小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3外泌體進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)1 069個(gè)蛋白質(zhì)，進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，生物學(xué)過(guò)程主要集中在蛋白定位和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，能夠促進(jìn)MSCs成骨分化的Integrin信號(hào)通路和在骨代謝平衡中發(fā)揮重要作用的mTOR信號(hào)通路備受關(guān)注；而分子功能顯示在骨重塑中起重要作用的Rho GTP酶較為重要，這說(shuō)明OB衍生的外泌體在成骨過(guò)程中發(fā)揮作用。研究[29]發(fā)現(xiàn)礦化前成骨細(xì)胞MC3T3-E1分泌的外泌體能夠促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(ST2)向成骨細(xì)胞分化，機(jī)制可能與MC3T3-E1分泌的外泌體改變了ST2細(xì)胞miRNA表達(dá)，這些改變的miRNA協(xié)同抑制Axin1，上調(diào)β-catenin蛋白，從而激活Wnt/b-catenin途徑，刺激成骨分化。微環(huán)境由細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和細(xì)胞分泌的外泌體及生長(zhǎng)因子組成，Narayanan等[30]研究發(fā)現(xiàn)分化細(xì)胞的ECM調(diào)節(jié)干細(xì)胞的表型，而它們的外泌體包含控制干細(xì)胞分化表型的特異性指導(dǎo)因子(miRNA、RNA、蛋白質(zhì))，在帶有OB外泌體的成骨細(xì)胞或成脂細(xì)胞外基質(zhì)上分化的hMSCs都顯示出成骨相關(guān)基因的表達(dá)，因此，在hMSCs譜系分化過(guò)程中，外泌體可能會(huì)覆蓋ECM介導(dǎo)的指示信號(hào)。

另有研究發(fā)現(xiàn)，OB源性外泌體可能與破骨細(xì)胞形成相關(guān)。Deng等[31]研究表明OB源性外泌體含有RANKL蛋白，并且能夠通過(guò)受體配體(RANKL-RANK)將其轉(zhuǎn)移至破骨細(xì)胞前體，刺激RANKL-RANK信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成。研究[32]發(fā)現(xiàn)溶酶體膜蛋白-1陽(yáng)性的成骨細(xì)胞外泌體攜帶了RANKL、骨保護(hù)素以及抗酒石酸酸性磷酸酶，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞形成。

因此，OB源性外泌體不僅可以加強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化和礦化，并且含有控制干細(xì)胞表型的特異性指導(dǎo)因子，促使干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，另一方面，OB源性外泌體與破骨細(xì)胞形成相關(guān)。而OB和OC之間這種外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊可能代表了骨骼建模和重塑的新機(jī)制。

2.3 OC源性外泌體與OP

骨吸收由OC介導(dǎo)，OC是目前唯一明確有降解骨質(zhì)功能的細(xì)胞，過(guò)度活躍的OC導(dǎo)致骨丟失和骨質(zhì)疏松。因此在加強(qiáng)成骨作用的同時(shí)，如何調(diào)節(jié)OC的功能在防治OP方面十分重要。Li等[33]研究發(fā)現(xiàn)OC衍生的外泌體miR-214-3p可以充當(dāng)細(xì)胞間信使以介導(dǎo)OC與OB的通訊，轉(zhuǎn)移至OB以抑制骨形成，基于此，OC中miR-214-3p的治療性抑制可能是逆轉(zhuǎn)已確診的OP的潛在骨合成代謝策略。Yang等[34]研究發(fā)現(xiàn)OC衍生的含有miR-23a-5P的外泌體可通過(guò)抑制Runx2和促進(jìn)YAP1介導(dǎo)的MT1DP來(lái)抑制OB分化。成熟OC外泌體可抑制OB內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，并誘導(dǎo)OB凋亡，促進(jìn)OP的發(fā)展。Huynh等[35]報(bào)道了破骨細(xì)胞前體的外泌體有刺激破骨細(xì)胞成熟化的作用，然而通過(guò)對(duì)成熟破骨細(xì)胞的培養(yǎng)，卻發(fā)現(xiàn)其分泌的外泌體抑制了破骨細(xì)胞生成。因此破骨細(xì)胞介導(dǎo)的外泌體的作用可能是雙向的，其中的分子機(jī)制對(duì)OP的影響尚未明確，尚需進(jìn)一步探究。

2.4 內(nèi)皮細(xì)胞源性外泌體與OP

骨組織具有高度血管化的特點(diǎn)，骨內(nèi)血管灌注不足與OP密切相關(guān)。新生血管不但能夠運(yùn)送氧氣及重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可以加速細(xì)胞增殖及骨基質(zhì)礦化[36]。研究[37]發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮組細(xì)胞衍生的含有miR-126的外泌體，可下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞SPRED1基因表達(dá)，活化RAF/ERK1/2信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管生成。van Balkom等[38]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放的含有miR-214的外泌體通過(guò)作用于相鄰內(nèi)皮細(xì)胞，可抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其遷移，促進(jìn)血管生成。

內(nèi)皮細(xì)胞源性外泌體除了可以促進(jìn)血管生成而在骨再生中發(fā)揮作用外，還可以抑制OC活性，治療骨質(zhì)疏松。Song等[39]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞源性外泌體比OB及BMSCs源性外泌體具有更有效的骨靶向性，內(nèi)皮細(xì)胞衍生的外泌體可抑制OC的活性，在去卵巢小鼠OP模型中可抑制骨質(zhì)疏松，對(duì)外泌體miRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)miR-155可能具有治療OP的潛力。Yang等[40]研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生的外泌體可以通過(guò)抑制鐵蛋白依賴性鐵下垂治療糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥。但也有研究[41]發(fā)現(xiàn)老年骨質(zhì)疏松患者內(nèi)皮細(xì)胞源性外泌體含有miR-31，而miR-31作用于MSCs后成骨分化被抑制。因此內(nèi)皮細(xì)胞源性外泌體對(duì)成骨和成血管的生理效應(yīng)尚不清楚，仍有待研究。

3 總結(jié)與展望

OP是一種骨量減低和骨微結(jié)構(gòu)破壞而易發(fā)生骨折的全身性骨骼疾病[42]。我國(guó)65歲以上人群OP患病率約為32%，由其導(dǎo)致的骨折發(fā)生率高達(dá)39%，預(yù)計(jì)2050年我國(guó)由OP引發(fā)的骨折人數(shù)將達(dá)599萬(wàn)，而相應(yīng)醫(yī)療支出將高達(dá)1 745億元，給家庭及社會(huì)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[43]。研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機(jī)制主要是骨形成與骨吸收呈負(fù)平衡，骨重建失衡造成骨丟失[44]。目前治療骨質(zhì)疏松癥的藥物可分為抗吸收調(diào)節(jié)劑和合成代謝藥物，前者包括雌激素、雄激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素和雙膦酸鹽，后者有特立帕肽，但是這些藥物通常會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。就特立帕肽而言，研究表明，77%服用20 μg的患者和78%服用40 μg的患者出現(xiàn)了關(guān)節(jié)痛、肌肉痙攣及疲勞等不良反應(yīng)；長(zhǎng)期使用雌激素會(huì)對(duì)大腦及子宮產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)；而長(zhǎng)期降鈣素治療由于降鈣素循環(huán)抗體的產(chǎn)生可導(dǎo)致機(jī)體耐受；目前最常用的治療OP 的藥物雙膦酸鹽會(huì)出現(xiàn)胃腸道刺激、骨骼和關(guān)節(jié)疼痛及下頜骨壞死等并發(fā)癥[45]。因此，開(kāi)發(fā)具有高骨靶向性和低毒性的藥物勢(shì)在必行。

外泌體是細(xì)胞間通訊的中心介質(zhì)，通過(guò)將蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及RNA傳送至鄰近或遠(yuǎn)處靶細(xì)胞，形成了一套全新的細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)，通過(guò)影響細(xì)胞的生理病理狀態(tài)與OP的發(fā)生及進(jìn)程密切相關(guān)。MSC-Exo不僅可以影響MAPK、Wnt/β-catenin等成骨相關(guān)信號(hào)通路，并且可通過(guò)其內(nèi)含的miRNA、lncRNA等物質(zhì)發(fā)揮調(diào)控BMSCs成骨分化的作用，從而減輕骨質(zhì)疏松；OB和OC源性外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊可能代表了骨骼建模和重塑的新機(jī)制；而內(nèi)皮細(xì)胞源性外泌體通過(guò)成骨與成血管生理效應(yīng)可發(fā)揮防治OP的作用。因此不同細(xì)胞源性外泌體在OP的發(fā)生及進(jìn)程中較為重要，研究其作用機(jī)制可為外泌體作為新的OP治療策略奠定理論基礎(chǔ)。

外泌體作為防治OP的新策略具有多種優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)細(xì)胞療法相比，外泌體具有較高的安全性[46]，其可避免細(xì)胞移植引起的栓子、腫瘤等并發(fā)癥；與生物納米材料相比，外泌體生物相容性較高而細(xì)胞毒性更低；并且外泌體因其穿過(guò)細(xì)胞膜及血腦屏障的能力及可調(diào)節(jié)的靶向效率，成為了遞送藥物及基因的理想載體[47]。但是將外泌體應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的治療還面臨許多難題，例如，如何大量高效地分離提純外泌體以及運(yùn)輸儲(chǔ)存是一大難題；其次，如何使其準(zhǔn)確定位到靶組織和靶細(xì)胞是臨床應(yīng)用面臨的問(wèn)題[48]。隨著對(duì)外泌體研究的不斷深入，將更系統(tǒng)更準(zhǔn)確地了解其與靶細(xì)胞之間的信號(hào)機(jī)制，外泌體有望成為防治OP的具有良好前景的治療策略。