宋興超，孟金柱，趙園園，吳震洋，安清明

（銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 銅仁 554300）

脊椎動(dòng)物生長激素（growth hormone,GH）由脊椎動(dòng)物腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞合成和分泌，它和催乳素（prolactin,PRL）及胎盤催乳素（placental lactogen,PL）屬同一個(gè)基因家族，是與脊椎動(dòng)物生長發(fā)育關(guān)系最為密切的一種單鏈多肽類激素[1]。GH的主要生物學(xué)功能是促進(jìn)蛋白質(zhì)和核酸的合成[2]，參與脂肪分解和葡萄糖吸收[3]，加速脊椎動(dòng)物骨骼和肌肉的生長發(fā)育[4]等。此外，GH 基因是一種寶貴的基因資源，在轉(zhuǎn)基因畜禽品種培育和生長激素制劑開發(fā)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。迄今為止，國內(nèi)外對(duì)該基因的研究主要集中于馬鹿[5]、梅花鹿[6,7]、狐貍[8]、山羊[9,10]和家兔[11,12]等哺乳動(dòng)物與雞[13]、鴨[14]等禽類以及魚類[15,16]GH 基因的克隆及其變異位點(diǎn)與重要經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性等方面。隨著基因組學(xué)大數(shù)據(jù)的逐漸更新，美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）的GenBank 數(shù)據(jù)庫中也集中收錄了大量物種GH 基因相關(guān)DNA 或mRNA 序列，然而，在分子水平上對(duì)生長性狀相關(guān)基因的研究還相對(duì)薄弱，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了當(dāng)今組學(xué)時(shí)代研究基因?qū)ιL性能影響機(jī)制的需要，同時(shí)也較少有研究者從比較基因組學(xué)角度探究不同物種GH 基因的變異及遺傳多樣性。為此，本研究選取GenBank公共數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的馬鹿等21 個(gè)物種的GH基因完整編碼區(qū)序列（codingregionsequence,CDS），利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)結(jié)合的方法分析了不同物種間和物種內(nèi)GH 基因的遺傳多樣性，旨在探明該基因在不同物種種間和種內(nèi)的遺傳變異及分化特征，為進(jìn)一步研究其調(diào)控動(dòng)物生長、發(fā)育和分化等方面的分子遺傳學(xué)機(jī)制提供基礎(chǔ)資料，同時(shí)也為探尋調(diào)控鹿科動(dòng)物特殊經(jīng)濟(jì)性狀的重要候選基因以及馬鹿的分子育種工作的深入開展奠定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列來源

從美國國立生物技術(shù)信息中心（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GenBank 公共數(shù)據(jù)庫中查詢并下載馬鹿等21 個(gè)物種的150 條GH 基因CDS 序列（表1）。

表1 不同物種GH 基因序列信息Table 1 The information of sequences for GH genes in different species

續(xù)表

1.2 分析方法

首先，利用BioEdit軟件（Version 3.3.19.0）的Clustal W 方法對(duì)選取的150 條序列的完整編碼區(qū)進(jìn)行多重比對(duì)，運(yùn)用DnaSP（Version 4.0.10.4）軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行遺傳變異及多樣性分析，包括多態(tài)位點(diǎn)（S）、單一多態(tài)位點(diǎn)（SP）和簡約多態(tài)位點(diǎn)（PIP）等參數(shù)，進(jìn)一步生成單倍型，計(jì)算物種間核苷酸歧異度（Dxy）、凈遺傳距離（Da）、同義替換位點(diǎn)數(shù)（SS）、非同義替換位點(diǎn)數(shù)（NSS）以及密碼子有效值（ENC）和偏愛指標(biāo)（CBI）。其次，采用MEGA 5.05 軟件的UPGMA 方法進(jìn)行物種間聚類，分析物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。然后利用Prot-Param、SignalP[17]等相關(guān)在線軟件預(yù)測(cè)不同物種GH基因核苷酸及編碼氨基酸序列結(jié)構(gòu)特征。最后基于PHD 和SWISS-MODEL 同源建模的方法進(jìn)行馬鹿GH 蛋白二級(jí)與三維結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同物種GH基因編碼區(qū)核苷酸多樣性

2.1.1 多態(tài)位點(diǎn)、單倍型和多樣性分析 在所研究的共有片段為576 bp 的不同物種150 條序列中，共發(fā)現(xiàn)426 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其百分率約為63.68%，包括單一多態(tài)位點(diǎn)（S）43 個(gè)，占6.43%，簡約多態(tài)位點(diǎn)（PIP）383個(gè)，百分率為57.25%。21 個(gè)物種的GH 基因序列共生成92 種單倍型，單倍型多樣性（Hd）為0.985，平均核苷酸差異數(shù)目（K）為89.10，核苷酸多樣性（）為0.1547。不同物種內(nèi)的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)和單倍型數(shù)不一致表明GH基因在種群間存在遺傳變異（表2）。其中，山羊和原雞GH 基因的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)較多，說明這兩個(gè)物種的GH基因多態(tài)性比較豐富。GH 基因在狨多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為0，僅生成1 種單倍型，初步表明GH 基因編碼區(qū)核苷酸多態(tài)性在物種間比在物種內(nèi)豐富，也可能與該物種樣本含量較少有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。獼猴GH 基因的多態(tài)位點(diǎn)、平均核苷酸差異數(shù)目最多，核苷酸多樣性也最高，經(jīng)查閱獼猴GH 基因序列（GenBank 登錄號(hào)：U02293）為GH 基因的一種變異體，利用BioEdit軟件多重比對(duì)后發(fā)現(xiàn)該序列變異位點(diǎn)很多，這可能是導(dǎo)致獼猴核苷酸多樣性最高的直接原因。

表2 不同物種GH 基因序列多態(tài)信息、單倍型及遺傳多樣性Table 2 Polymorphic information,haplotype and variety of GH gene in different species

續(xù)表

2.1.2 核苷酸歧異度、凈遺傳距離和遺傳分化 各物種間凈遺傳距離（Da）在0.004～0.474 之間，核苷酸歧異度（Dxy）在0.013～0.485 范圍（表3）。不同物種間凈遺傳距離和核苷酸歧異度的變化范圍均較大，說明不同物種之間的遺傳分化比較明顯。其中，綿羊和山羊之間的凈遺傳距離和核苷酸歧異度最小，表明綿羊和山羊之間的親緣關(guān)系在所分析的16 個(gè)物種間最近；Da的最大值出現(xiàn)在人、狨與草魚之間，而獼猴和草魚之間的Dxy 值最大，說明人、狨、獼猴與草魚間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，初步推測(cè)人、狨與草魚的GH 基因在進(jìn)化過程中的遺傳分化較大。

表3 不同物種間凈遺傳距離（Da）和核苷酸歧異度（Dxy）Table 3 Net genetic distance and nucleotide divergence in different species

根據(jù)不同物種間的遺傳分化指數(shù)（Gst），利用MEGA 5.05 軟件的未加權(quán)配對(duì)組（UnweightedPairGroupMethod with Arithmetic mean,UPGMA）方法構(gòu)建16 個(gè)物種GH 基因的分子聚類圖（圖1）。由圖1可知，綿羊與山羊的親緣關(guān)系較近，草魚與其他物種間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這與NCBI 中公布的動(dòng)物形態(tài)、生理分類學(xué)結(jié)果基本相符。

圖1 根據(jù)16 個(gè)物種GH 基因的遺傳分化指數(shù)構(gòu)建的分子聚類圖Fig.1 Phylogenetic tree based on genetic differentiation of GH gene of 16 different species

2.1.3 編碼區(qū)核苷酸序列長度及終止密碼子的差異 由表1可知，不同物種GH 基因完整編碼區(qū)序列長度為633～654 bp，大多數(shù)物種GH 基因CDS 長654 bp，家馬、家犬、家貓、水貂、小家鼠、褐家鼠、原雞、火雞、鵪鶉、野鴨和鵝GH 基因CDS 為651 bp，草魚和斑馬魚為633 bp。終止密碼子TAG 普遍用于馬鹿、綿羊等哺乳動(dòng)物及草魚、斑馬魚等魚類，鳥類中原雞、鵪鶉、野鴨和鵝采用TGA 作為GH 基因的終止密碼子。

2.2 不同物種GH基因編碼氨基酸序列多樣性及結(jié)構(gòu)特征分析

2.2.1 密碼子偏愛性 本研究選取的各個(gè)物種GH基因序列編碼區(qū)密碼子有效值（Effective Number of Codon,ENC）為42.056（＜61），密碼子偏愛指標(biāo)（Codon Bias Index,CBI）為0.566（＞0），經(jīng)過卡方檢驗(yàn)并計(jì)算未校正的2 值為0.702，說明GH 基因?qū)γ艽a子有較強(qiáng)的偏愛性。

2.2.2 同義替換和非同義替換 不同物種的150 條GH基因序列編碼區(qū)中同義替換平均位點(diǎn)數(shù)為133.73，核苷酸多樣性均值為0.310 2，非同義替換平均位點(diǎn)數(shù)為418.27，核苷酸多樣性均值為0.099 8。含有兩條序列以上物種的同義替換位點(diǎn)數(shù)（Synonymous site,SS）為140.42～158.70，非同義替換位點(diǎn)數(shù)（Non-synonymous site,NSS）為478.25～489.28。本研究結(jié)果表明，所選物種GH 基因的同義替換位點(diǎn)數(shù)明顯低于非同義替換位點(diǎn)數(shù)，說明所分析的這些不同物種在進(jìn)化過程中可能受到正選擇的影響。獼猴的非同義替換位點(diǎn)數(shù)較其他物種多，初步表明獼猴GH 基因編碼區(qū)的非同義替換較其他物種高。

表4 不同物種GH 基因同義替換和非同義替換位點(diǎn)數(shù)Table 4 Synonymous and nonsynonymous substitution of GH gene among different species

2.2.3 不同物種GH 基因編碼氨基酸序列理化特性分析 利用在線工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）和SignalP 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分別預(yù)測(cè)不同物種GH 蛋白的理化特性及信號(hào)肽裂解位點(diǎn)（表5）。結(jié)果表明，21 個(gè)不同物種GH 基因編碼的氨基酸序列長度為210～217 aa，相對(duì)分子質(zhì)量為23 653.23～24 959.61 Da，大多數(shù)物種的理論等電點(diǎn)在7.00 以下（馬鹿、綿羊、山羊、牛、火雞和鵪鶉除外），為一種酸性蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)和親水性值分別為29.81～53.44 與（-0.286）～（-0.080），推斷大多數(shù)物種GH 蛋白屬親水性不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。GH 蛋白在N 端存在一段信號(hào)肽，不同物種信號(hào)肽的長度及裂解位點(diǎn)稍有差異，但親緣關(guān)系較近的物種裂解位點(diǎn)大致相同。

表5 不同物種GH 基因編碼氨基酸序列理化特性參數(shù)及信號(hào)肽裂解位點(diǎn)Table 5 Physicochemical characteristic parameters and cleavage sites of GH amino acid in different species

2.3 馬鹿GH蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)PHD（http://npsa-pbil.ibcp.fr）方法預(yù)測(cè)馬鹿GH 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，由圖2可知，馬鹿GH 蛋白具有生長激素特征性的5 個(gè)螺旋區(qū)（圖中下劃線所示：H1～H5）。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為-螺旋（67.74%），其次是無規(guī)則卷曲（32.26%），它將5 個(gè)-螺旋區(qū)連接起來。

圖2 馬鹿GH 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Secondary structure prediction of the GH protein in Cervus elaphus

為精確揭示馬鹿GH 蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)，本研究采用SWISS-MODEL 同源建模方法構(gòu)建了馬鹿GH 蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。將馬鹿GH 蛋白（GenBank 登錄號(hào)：CAJ18232）進(jìn)行模板比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白28～216 位氨基酸與人Growth Hormone Prolactin 1～186 位氨基酸同源性達(dá)到64%，利用SPDBV 軟件顯示（圖3），初步表明馬鹿GH 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與其他物種相似，28～216 位氨基酸包括4 個(gè)反向平行的-螺旋，推測(cè)與GH 蛋白功能相關(guān)的位點(diǎn)主要集中在這4 個(gè)螺旋中，反向平行的空間結(jié)構(gòu)更有利于疏水基團(tuán)暴露于蛋白空間結(jié)構(gòu)的外側(cè)，有利于功能的發(fā)揮。

圖3 馬鹿生長激素（GH）蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Tertiary structure of GH protein in Cervus elaphus

3 討論

3.1 不同物種GH基因核苷酸多樣性

從本研究所分析物種GH 基因核苷酸序列多態(tài)信息、單倍型及其多樣性等參數(shù)可以看出不同物種的相關(guān)遺傳變異參數(shù)存在較大差異，初步表明GH 基因存在種間遺傳變異，種內(nèi)相對(duì)保守，即種間遺傳多樣性較種內(nèi)豐富。研究顯示，GH基因在狨中僅生成1 種單倍型，分析認(rèn)為，除了GH 基因在種內(nèi)比較保守外，還可能與該物種樣本量較少有關(guān)。本研究結(jié)果還表明，不同物種間的核苷酸歧異度、凈遺傳距離均較大，這說明不同物種間的遺傳分化已經(jīng)十分明顯。山羊和綿羊以及山羊和牛間的核苷酸歧異度最小，表明其親緣關(guān)系很近；草魚和獼猴間的核苷酸歧異度最大，表明二者間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。從16 個(gè)物種的150 條GH 基因序列構(gòu)建的聚類圖也可看到，山羊和綿羊之間的親緣關(guān)系最近，而斑馬魚、草魚和其他物種間具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。上述結(jié)果與NCBI 中動(dòng)物分類學(xué)基本一致。

3.2 不同物種GH基因編碼氨基酸序列分析

本研究結(jié)果表明，生長激素GH 多肽鏈表現(xiàn)為親水性，理論等電點(diǎn)除馬鹿、山羊、綿羊、牛、火雞和鵪鶉外，其他物種均小于7.00，表現(xiàn)為酸性蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)高于7.00 的物種尚需進(jìn)一步的生化試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。通過ProtParam 分析不同物種GH 蛋白發(fā)現(xiàn)其不穩(wěn)定系數(shù)在29.81～53.44，軟件分析得出大多數(shù)物種GH蛋白不穩(wěn)定（計(jì)算指數(shù)＜40：穩(wěn)定，計(jì)算指數(shù)＞40：不穩(wěn)定）。對(duì)21 個(gè)物種的GH 蛋白信號(hào)肽分析結(jié)果表明，這些物種的GH 蛋白都有一段約26 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，但親緣關(guān)系較近的物種裂解位點(diǎn)基本一致，可以推斷該基因在游離的核糖體上起始合成后再進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)從而發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)在翻譯過程中，物種間或物種內(nèi)的不同基因在密碼子的使用上一般都有明顯的偏愛性[18]，本研究也得出GH 基因?qū)γ艽a子具有較強(qiáng)的偏愛性。蛋白質(zhì)在翻譯過程中某些堿基會(huì)發(fā)生一定程度的替換，包括同義替換和非同義替換。同義替換現(xiàn)象的發(fā)生大多不受自然選擇的控制，同義替換速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非同義替換速率，且這種現(xiàn)象發(fā)生的速率與基因密切相關(guān)，被認(rèn)為是凈化選擇的結(jié)果。而在某些基因中，非同義替換速率則遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同義替換速率，前人分析在于達(dá)爾文正向選擇[19]。本研究結(jié)果顯示，所分析物種GH 基因的非同義替換位點(diǎn)數(shù)明顯高于同義提換位點(diǎn)數(shù)，初步表明，所分析16 個(gè)物種在進(jìn)化過程中很大程度上可能受到達(dá)爾文正向選擇的影響。利用DnaSP軟件分析發(fā)現(xiàn)，狨GH 基因中非同義替換位點(diǎn)數(shù)為488.33，明顯多于其他物種，表明狨GH 基因編碼區(qū)的非同義替換較其他物種更為明顯，其原因尚待進(jìn)一步深入分析。

3.3 馬鹿GH基因編碼氨基酸序列二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能及其關(guān)系的分析是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一個(gè)重要組成部分。通過分析未知功能或新發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，確認(rèn)其功能單位或結(jié)構(gòu)域，可以為遺傳操作提供目標(biāo)，為設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)或改造已有蛋白質(zhì)提供可靠的依據(jù)，為預(yù)測(cè)新基因的結(jié)構(gòu)和功能提供參照[20]。本研究預(yù)測(cè)馬鹿GH 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法為PHD，主要以-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，-螺旋通常是脊椎動(dòng)物的高度保守序列，而無規(guī)卷曲則將-螺旋連接起來，這與王磊等利用Jpred 3 在線軟件預(yù)測(cè)牦牛[21]和汪艷宏[22]采用DNAman 軟件分析赤鱗魚GH 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致。說明馬鹿GH 基因編碼氨基酸序列具有生長激素典型的螺旋結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析，對(duì)理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系有著極其重要的意義。本研究通過SWISS-MODEL同源建模方法構(gòu)建了馬鹿GH 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，馬鹿GH 蛋白與其他物種的空間結(jié)構(gòu)相似，均形成4 個(gè)反向平行的生長激素特征性螺旋結(jié)構(gòu)模式，從側(cè)面更好地詮釋了GH 蛋白功能位點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究基于比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)GH 基因在21 個(gè)物種間的遺傳多樣性比較豐富，種內(nèi)相對(duì)保守；山羊和綿羊之間的親緣關(guān)系最近，斑馬魚、草魚和其他物種間具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系；GH蛋白屬不穩(wěn)定酸性蛋白，均存在1 個(gè)信號(hào)肽且親緣關(guān)系較近的物種具有相似的裂解位點(diǎn)；馬鹿GH 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)存在4 個(gè)反向平行的互補(bǔ)螺旋。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究GH 基因功能及其應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。