姚永謀，張遠(yuǎn)芳，劉芳，方會龍，劉青，劉澤，王俊杰，黃建華

（1.湘南學(xué)院藥學(xué)院，湖南 郴州 423000；2.湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 郴州 423000；3.湘南學(xué)院護(hù)理學(xué)院，湖南 郴州 423000）

積雪草為傘形科植物積雪草［Centella asiatica（L.）Urb.］的干燥全草，用于濕熱黃疸、中暑腹瀉、石淋血淋、癰腫瘡毒、跌撲損傷［1］。在我國主要分布于華東、華南、中南及西南等地［2］。積雪草主要含有三萜及其苷類、揮發(fā)油、黃酮類、生物堿等化合物［3］，積雪草總苷作為其主要藥用活性成分近年來被研究的比較多，其中積雪草苷具有神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、抗缺血再灌注損傷、抗支架再狹窄、保護(hù)肺臟等多方面作用［4］，羥基積雪草苷在臨床上被用于抗炎抗氧化、抗抑郁癥、抗腫瘤、皮膚增白、治療燒傷性瘢痕、增強記憶、防治冠心病、心肌梗死、腦血栓、腦梗死等［5-6］。目前對于積雪草中積雪草總苷等有效成分的脫色研究主要采用的是活性炭脫色，常用于化妝品工業(yè)中［7］。最近也有文獻(xiàn)報道氧化鋁對積雪草有效成分也具有脫色效果［8］，但這些研究內(nèi)容均不夠詳細(xì)充分或者只對羥基積雪草苷等單一成分進(jìn)行了相關(guān)研究，而積雪草提取物含有的成分較多，影響其脫色等品質(zhì)提升的因素也較多，關(guān)于積雪草總苷提取物的脫色研究筆者尚未見到相關(guān)報道。因此，本文在已有研究基礎(chǔ)上，以脫色率為主要考察指標(biāo)，結(jié)合積雪草總苷含量和回收率等結(jié)果，利用響應(yīng)面法［9-10］進(jìn)一步研究中性氧化鋁對積雪草總苷提取物的脫色效果，并對中性氧化鋁用量、溫度、時間以及pH值等影響條件進(jìn)行優(yōu)化，以期得到最優(yōu)的脫色條件。本研究可以為積雪草提取物的品質(zhì)提升和開發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

2020年采自于湖南省郴州市蘇仙區(qū)白露塘地區(qū)的積雪草原料，經(jīng)湘南學(xué)院王俊杰教授鑒定為傘形科植物積雪草［Centella asiatica（L.）Urb.］的干燥全草，經(jīng)干燥破碎后，進(jìn)行乙醇回流提取，提取物再經(jīng)硅膠柱分離得到棕黃色的積雪草提取物粉末，其中積雪草總苷含量為65.4%，羥基積雪草苷為42.0%，積雪草苷為23.3%。

1.2 儀器與試劑

Agilent 1260 InfinityⅡ液相色譜儀（美國Agilent公司）；AUW120D分析天平（島津儀器有限公司）；KQ-600DE超聲清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；RCT-B-S25恒溫磁力攪拌器（德國IKA公司）；UVmini-1280紫外分光光度計（島津儀器有限公司）；SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

羥基積雪草苷（純度＞98%，批號：PRF8032843，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）；積雪草苷（純度＞98%，批號：PRF7082702，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）；95%乙醇（分析純，湖南匯虹試劑有限公司）；怡寶純凈水（市購）；中性氧化鋁（100～200目，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法

2.1 原料脫色

準(zhǔn)確稱取0.2 g積雪草提取物粉末，用10 mL 50%乙醇超聲溶解，然后加入一定量過100～200目篩的中性氧化鋁粉末，并在一定的溫度、時間以及pH值等條件下進(jìn)行攪拌脫色得到脫色溶液，經(jīng)濃縮干燥后得到脫色產(chǎn)品。

2.2 脫色率的計算

取脫色溶液用50%乙醇稀釋150倍后在204 nm波長下用紫外分光光度計測定吸光度，扣除溶劑背景后計算脫色率。

脫色率［11］=（脫色前吸光度-脫色后吸光度）/脫色前吸光度×100%。

2.3 單因素試驗設(shè)計

采用中性氧化鋁用量、脫色溫度、脫色時間、pH值作為考察因素，根據(jù)“2.1”項操作進(jìn)行單因素試驗，考察4個因素對積雪草總苷提取物脫色效果的影響。

2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以X1（中性氧化鋁用量）、X2（脫色時間）、X3（脫色溫度）、X4（pH值）為考察因素，應(yīng)用Design-Expert 11軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計，選擇合適的響應(yīng)面因素和水平，以脫色率為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗，如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平Tab.1 Response surface test factor level

2.5 含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備

精密稱取積雪草苷4.25 mg、羥基積雪草苷7.86 mg置于同一個5 mL容量瓶中，加入色譜純甲醇超聲溶解后定容至刻度，即得1 mL中分別含積雪草苷0.85 mg、羥基積雪草苷1.572 mg的對照品混合溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備

精密稱取積雪草提取物粉末與脫色后的干燥產(chǎn)品各20 mg分別置于25 mL容量瓶中，加入色譜純甲醇超聲溶解后定容至刻度，混勻后過0.45 μm微孔濾膜，得供試品溶液。

2.5.3 色譜條件

采用島津InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以甲醇：乙腈：水（24：26：50）為流動相；等度洗脫，流速為0.8 mL/min；檢測波長為204 nm；進(jìn)樣量為10 μL。對照品和積雪草提取物樣品色譜圖見圖1。

圖1 積雪草苷、羥基積雪草苷的對照品（A）和樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatogram of control substances（A）and samples（B）of asiaticoside and madecassoside

2.5.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.5.1”項下對照品混合溶液0.1、0.2、0.4、0.5、1.0、2.0 mL到10 mL容量瓶中，加入色譜甲醇定容至刻度，搖勻后按“2.5.3”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄各色譜峰面積。以對照品峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行回歸分析，得到積雪草苷、羥基積雪草苷的線性方程見表2，結(jié)果表明2個成分在各自的線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

表2 積雪草苷與羥基積雪草苷的線性關(guān)系考察Tab.2 The linearity of asiaticoside and madecassoside

2.5.5 精密度試驗

精密吸取“2.5.1”項下對照品混合溶液10 μL，按“2.5.3”項色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，經(jīng)測定積雪草苷、羥基積雪草苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）分別為1.33%、0.32%，表明儀器的精密性良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一份供試品溶液（“2.5.2”項下的積雪草提取物溶液），按“2.5.3”項色譜條件分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)行測定，得到樣品中積雪草苷、羥基積雪草苷峰面積的RSD分別為0.76%、0.61%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性試驗

稱取該積雪草提取物粉末6份，按“2.5.2”項下的方法制備得到6份供試品溶液，再按“2.5.3”項色譜條件進(jìn)行測定分析，結(jié)果測得樣品中積雪草苷、羥基積雪草苷含量的RSD分別為1.03%、1.85%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 樣品回收率試驗

精密稱取該積雪草提取物粉末6份，分別精密加入不同量的積雪草苷、羥基積雪草苷對照品，按“2.5.2”項下的方法制備供試品溶液，取對照品溶液和供試品溶液，依次進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，按外標(biāo)法計算含量，并分別計算兩種成分的回收率。分別得到積雪草苷的平均回收率為99.50%，RSD=1.54%（n=6），羥基積雪草苷的平均回收率為102.10%，RSD=1.01%（n=6）。

2.5.9 樣品測定

稱取“2.1”項下得到的脫色產(chǎn)品，按照“2.5.2”項方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項下的色譜條件進(jìn)行測定色譜峰面積，并計算樣品中積雪草苷、羥基積雪草苷的含量。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗結(jié)果與分析

3.1.1 脫色時間對積雪草提取物脫色效果的影響

積雪草提取物溶液在40℃，pH=7下加入0.8 g中性氧化鋁粉末，分別保溫脫色10、15、20、25、30 min時，得到的脫色效果如圖2A所示。由圖中可知，隨著脫色時間的增加，積雪草提取物的脫色率呈先上升后趨于平緩趨勢，其中當(dāng)脫色時間分別為10、15、20、25、30 min時，得到的脫色溶液顏色依次為黃色、黃色、淡黃色、略顯淡黃色、略顯淡黃色，且25 min與30 min的脫色時間對積雪草提取物的脫色效果相差不明顯，為節(jié)約時間，選擇脫色時間為25 min。

3.1.2 脫色溫度對積雪草提取物脫色效果的影響

積雪草提取物溶液在pH=7下加入0.8 g中性氧化鋁粉末，分別在脫色溫度為25℃、30℃、40℃、50℃、60℃時保溫脫色25 min，得到的脫色效果如圖2B所示，由圖中可知隨著脫色溫度的增加，積雪草提取物的脫色率呈先上升后下降趨勢，其中當(dāng)脫色溫度分別25℃、30℃、40℃、50℃、60℃時，得到的脫色溶液顏色依次為淡黃色、淡黃色、略顯淡黃色、接近無色、接近無色。結(jié)合脫色溫度為50℃時積雪草提取物的脫色率最高，因此選擇脫色溫度為50℃。

3.1.3 PH值對積雪草提取物脫色效果的影響

積雪草提取物溶液在50℃，分別在pH為5、6、7、8、9時加入0.8 g中性氧化鋁，保溫脫色25 min，得到的脫色效果如圖2C所示。由圖中可知隨著pH值增加，積雪草提取物的脫色率呈下降趨勢。其中pH值為5、6、7、8、9時，得到的脫色溶液顏色依次為無色、無色、接近無色、淡黃色、黃色。且pH值為5與6時對積雪草提取物的脫色效果相差不明顯，從條件的溫和程度和對設(shè)備的要求來看，選擇pH值為6。

圖2 不同因素對積雪草提取物脫色效果的影響Fig.2 Effects of different factors on the decolorization of C.asiatica extract

3.1.4 中性氧化鋁用量對積雪草提取物脫色效果的影響

積雪草提取物溶液在50℃，pH=6下分別加入0.2 g、0.4 g、0.8 g、1.6 g、3.2 g中性氧化鋁粉末時，保溫脫色25 min，得到的脫色效果如圖2D所示。由圖中可知，隨著中性氧化鋁用量增加，積雪草提取物的脫色率呈上升趨勢，其中當(dāng)中性氧化鋁用量分別為0.2 g、0.4 g、0.8 g、1.6 g、3.2 g時，得到的脫色溶液顏色依次為棕黃色、黃色、接近無色、無色、無色?？梢钥闯龇e雪草提取物的脫色率與中性氧化鋁的用量呈正相關(guān)，但實驗中發(fā)現(xiàn)中性氧化鋁的用量越多，積雪草提取物中的積雪草總苷成分的損失也越明顯，綜合考慮選擇中性氧化鋁粉末用量為1.6 g，即積雪草提取物的8倍量。

3.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

3.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面實驗得到的積雪草提取物的脫色結(jié)果如表3所示。從表中數(shù)據(jù)可知，脫色率最高的為試驗8，并結(jié)合脫色后總苷含量與總苷回收率等多個指標(biāo)，采用了綜合權(quán)重評分方法確定最優(yōu)的脫色條件。其中綜合權(quán)重評分=（脫色率×50%+總苷含量×25%+總苷回收率×25%），經(jīng)評分得到表中最優(yōu)的脫色條件為中性氧化鋁1.6 g、脫色溫度50℃、脫色時間25 min、pH為6，這與單因素試驗的結(jié)果基本吻合，說明該響應(yīng)面設(shè)計的29個試驗點可信度較高。

3.2.2 回歸模型的方差分析

利用Design-Expert 11軟件對表3中脫色率數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，因總苷含量和總苷回收率數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學(xué)意義，只需對脫色率數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得二次多元回歸方程：脫色率Y=40.17+15.46X1+1.07X2+2.11X3-4.22X4-4.11X1X4-4.28X2X3-。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果Tab.3 The result of the response surface test

從表4中數(shù)據(jù)可知，該回歸模型P＜0.0001，表明該回歸模型有統(tǒng)計學(xué)意義，而失擬項P＞0.05不顯著，同時R2=0.9499與Radj2=0.8998都接近1，表明該模型的可信度較高，對試驗的擬合度較好，從而該回歸方程可代替實際值對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。另外從X1（中性氧化鋁的用量）與X4（pH值）對積雪草提取物的脫色效果的影響都極顯著，且結(jié)合F值可判斷4種因素對脫色效果的影響順序為：X1（中性氧化鋁的用量）＞X4（pH值）＞X3（脫色溫度）＞X2（脫色時間）。

表4 回歸方程方差分析Tab.4 Analysis of variance of regression equation

3.2.3 兩因素交互影響的響應(yīng)面分析

對脫色時間、中性氧化鋁的用量、脫色溫度、pH值四因素進(jìn)行交互作用分析的結(jié)果如圖3所示。依據(jù)響應(yīng)面的坡度和等高線的形狀，從圖中可知，中性氧化鋁用量的響應(yīng)面坡度最陡，pH值次之，再者是脫色溫度，脫色時間最緩。中性氯化鋁用量與pH值的等高線不呈圓形，交互作用很顯著，而脫色時間與脫色溫度的等高線呈圓形，交互作用不顯著。分析其原因可能主要是中性氧化鋁作為一種常用的吸附性脫色材料，其作用類似于活性炭，用量與脫色效果呈正相關(guān)；同時積雪草提取物中除了主要的積雪草總苷成分外，可能還有酚酸類物質(zhì)的色素，在酸性條件下更有利于中性氧化鋁對這些色素成分的吸附，使得中性氧化鋁的用量和pH值對積雪草提取物的脫色起決定性作用。

圖3 不同影響因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface diagram of the interaction of different influencing factors

綜上得到積雪草提取物脫色最優(yōu)條件為：中性氧化鋁為1.562 g、脫色時間為25.7 min、脫色溫度為50.7℃、pH值為6。

3.2.4 驗證試驗

將響應(yīng)面法得到的積雪草提取物脫色最優(yōu)條件按“2.1”項操作進(jìn)行驗證試驗，得到樣品的脫色率實測值為81.1%（n=3），與理論值相近，說明該方法具有一定的參考性，且脫色后得到的產(chǎn)品中積雪草總苷含量達(dá)到了74.9%，明顯高于原料含量，同時積雪草總苷的回收率可達(dá)76.4%。

4 討論

本研究首次采用響應(yīng)面法優(yōu)化了中性氧化鋁對積雪草提取物的脫色條件，得到的脫色效果顯著，發(fā)現(xiàn)影響積雪草提取物脫色效果的主要因素及優(yōu)先順序為中性氧化鋁的用量＞pH值＞脫色溫度＞脫色時間，其中中性氧化鋁的用量與pH值是極顯著因素。實驗過程中雖然中性氧化鋁的用量越多，積雪草提取物的脫色效果越好，但也發(fā)現(xiàn)積雪草總苷的吸附損失量與中性氧化鋁的用量呈正比，所以綜合脫色效果和目標(biāo)成分來看，選擇8倍量的中性氧化鋁用量較為合適。同時進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境有利于積雪草提取物的脫色，這可能與積雪草提取物中含有的酚酸類物質(zhì)有關(guān)，但溶液酸性不能過強，當(dāng)pH＜3時脫色后的產(chǎn)品會發(fā)生變化并產(chǎn)生新的深顏色物質(zhì)，結(jié)合實際應(yīng)用考慮選擇pH為6左右較為合適。最后通過本研究最優(yōu)脫色條件的驗證試驗，證明了該工藝條件穩(wěn)定可靠，脫色后積雪草提取物品質(zhì)得到了明顯的提升，且在考察積雪草提取物脫色率的同時，建立了一種積雪草總苷的含量測定方法，為積雪草提取物的品質(zhì)提升和開發(fā)利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)和參考。