薛 梅, 廖 怡, 盧 薇

(四川省成都市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 兒科, 四川 成都, 610000)

支氣管哮喘簡(jiǎn)稱哮喘，是以氣道重塑及慢性炎癥為主要病理特點(diǎn)的一種常見(jiàn)呼吸系統(tǒng)疾病[1], 其中氣道平滑肌細(xì)胞(ASMC)的過(guò)度增殖及凋亡不足是氣管重構(gòu)的重要原因，可繼發(fā)難治性哮喘，危害嚴(yán)重[2]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼小RNA, 可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控干擾其靶基因mRNA表達(dá)或抑制其轉(zhuǎn)錄，廣泛參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡及免疫等多種生物學(xué)進(jìn)程，研究[3-4]顯示，多種miRNA在哮喘發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用。微小RNA-455-3p(miR-455-3p)是一種與糖尿病腎病、乳腺癌等多種癌癥以及肺動(dòng)脈高壓等炎癥性疾病密切相關(guān)的miRNA[5-6]。Toll樣受體4(TLR4)是一種高度保守的天然免疫受體家族的成員，其表達(dá)水平與哮喘ASMC增殖、凋亡及功能狀態(tài)密切相關(guān)。研究[7]顯示, miR-455-3p可靶向TLR4基因調(diào)節(jié)多種細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)。本研究探討miR-455-3p與TLR4的靶向關(guān)系及其對(duì)哮喘大鼠ASMC生物學(xué)活性及炎癥因子分泌功能的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)健康雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量190～220 g, 生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2016-0041, 由南方醫(yī)科大學(xué)提供。

1.2 主要試劑及儀器

胎牛血清(FBS，貨號(hào)10099-145)、DMEM/F-12培養(yǎng)基(貨號(hào)12634010)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司; miR-455-3p NC(陰性對(duì)照)、miR-455-3p mimic、pcDNA(空質(zhì)粒)、pcDNA-TLR4(TLR4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒)和miR-455-3p、U6、TLR4、GAPDH引物均由吉瑪生物科技有限公司合成; 卵清蛋白(OVA，貨號(hào)A5503)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒(貨號(hào)11465007001)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司; 原位末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒(貨號(hào)11684795910)購(gòu)自Roche公司; BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào)P0010S)購(gòu)自上海碧云天有限公司; miRNA提取試劑盒(貨號(hào)AM1561)、Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒(貨號(hào)11668)、兔源一抗anti-TLR4(貨號(hào)14-9924-82)、anti-GAPDH(貨號(hào)PA1-16777)、二抗羊抗兔IgG(貨號(hào)A-11008)均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司; 大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(貨號(hào)ab236712)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(貨號(hào)ab234570)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司; MODEL550型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司; Forma Steri-Cycle i160 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司; ix75熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 哮喘大鼠模型建立: 參考文獻(xiàn)[8]方法，隨機(jī)選取6只大鼠，于實(shí)驗(yàn)第1、8天向大鼠皮下注射含OVA 10 mg和氫氧化鋁凝膠200 mg的混合物1 mL, 同時(shí)腹腔注射滅活百日咳桿菌5×109個(gè)，第15天霧化吸入2% OVA磷酸鹽緩沖液50 mL, 30 min/次, 1次/d, 持續(xù)1周。其余6只正常大鼠給予等量生理鹽水(代替OVA)進(jìn)行同等處理。哮喘模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)為大鼠出現(xiàn)煩躁不安，呼吸加深、加快，弓背，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)伸頸、喘息狀、大小便失禁等。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)大鼠肺組織miR-455-3p表達(dá)水平: 分別取6只哮喘大鼠(模型組)和6只正常大鼠(正常對(duì)照組)，腹腔注射3%戊巴比妥納麻醉，留取血液置于4 ℃冰箱用于后續(xù)ELISA檢測(cè)，開(kāi)胸取雙肺組織，分別稱取0.5 g(其余肺組織置于-80 ℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn))，使用RNA提取試劑盒提取肺組織總RNA并檢測(cè)其濃度，然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA, 并以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配置聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)體系，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min, 95 ℃變性15 s, 60 ℃退火60 s, 72 ℃延伸2 min, 設(shè)置45個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct算法進(jìn)行miR-455-3p表達(dá)量的計(jì)算與分析。miR-455-3p上游引物序列5′-GCAGUCCAUGGGCAUAUACAC-3′, 下游引物序列5′-GUGUAUAUGCCCAUGGACUGC

UU-3′;U6上游引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGC

ACA-3′, 下游引物序列5′-AACGCTTCACGAATT

TGCGT-3′。

1.3.3 ELISA檢測(cè)大鼠肺組織及血清中炎性因子含量: 取上述置于4 ℃冰箱的2組大鼠血液各2 mL和-80 ℃冰箱的肺組織各0.05 g, 按照TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)哮喘大鼠和正常大鼠血清與肺組織中TNF-α、IL-6含量。

1.3.4 ASMC分離、培養(yǎng)及鑒定: 取上述置于-80 ℃冰箱的肺組織，低溫融化后，于解剖顯微鏡下分離支氣管平滑肌，剪碎后置于含膠原酶2 mg/mL、木瓜蛋白酶3 mg/mL、胰蛋白酶2 mg/mL的D-Hank′s液中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化1 h, 以100目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾后, 800轉(zhuǎn)/min離心10 min, 棄上清，添加于含20%FBS、1%青鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用免疫組化染色法鑒定ASMC α-肌動(dòng)蛋白表達(dá)。選取分離成功的ASMC(第4～8代)用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn): 以pmir-GLO質(zhì)粒為載體，構(gòu)建與miR-455-3p種子區(qū)結(jié)合的TLR4基因3′UTR野生型(WT-TLR4)和突變型(MUT-TLR4)雙熒光報(bào)告重組質(zhì)粒，之后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將miRNA(miR-455-3p NC或miR-455-3p mimic)和重組質(zhì)粒(WT-TLR4或MUT-TLR4)共轉(zhuǎn)染入正常大鼠ASMC, 于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別為miR-455-3p NC+WT-TLR4組、miR-455-3p mimics+MUT-TLR4組、miR-455-3p NC+MUT-TLR4組和miR-455-3p mimics+WT-TLR4組。每組設(shè)立6個(gè)復(fù)孔, 48 h后用PLB裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，離心后取上清檢測(cè)熒火蟲(chóng)熒光素酶信號(hào)和海腎熒光素酶信號(hào)，計(jì)算其相對(duì)活性。

1.3.6 細(xì)胞炎性誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)染及分組: 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的哮喘大鼠ASMC接種于96孔細(xì)胞板，使用TNF-α刺激哮喘大鼠ASMC(96孔板中加入TNF-α至終濃度為20 ng/mL[9]), 使其產(chǎn)生炎癥反應(yīng)后常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染當(dāng)天取出細(xì)胞于顯微鏡下觀察細(xì)胞密度，達(dá)到70%～80%匯合率時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。更換無(wú)血清培養(yǎng)基后，采用Lip2000轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染miR-455-3p NC(50 nmol/L，陰性對(duì)照, miR-455-3p NC組)、miR-455-3p mimic(50 nmol/L, miR-455-3p mimic組)和共轉(zhuǎn)染miR-455-3p mimic與pcDNA(miR-455-3p mimic+pcDNA組)、共轉(zhuǎn)染miR-455-3p mimic與pcDNA-TLR4(miR-455-3p mimic+pcDNA-TLR4組)至產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的大鼠ASMC中，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，孵育4～6 h后更換新鮮培養(yǎng)基。另設(shè)正常對(duì)照組(正常大鼠ASMC)和模型組(哮喘大鼠炎癥ASMC)，每組6個(gè)重復(fù)。

1.3.7 qRT-PCR檢測(cè)各組ASMC中miR-455-3p、TLR4mRNA表達(dá): 采用RNA抽提試劑盒提取各組ASMC總RNA, 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA置于-20 ℃冰箱保存待用。采用qRT-PCR法擴(kuò)增miR-455-3p、TLR4mRNA目的片段。miR-455-3p引物序列及內(nèi)參U6引物序列見(jiàn)“1.3.2”。TLR4上游引物序列5′-CGCTTTCACCTCTGCCTTCACTA

CAG-3′, 下游引物序列5′-ACACTACCACAATAAC

CTTCGGCTC-3′; 內(nèi)參GAPDH上游引物序列5′-TGATTCTACCCACGGCAAGTT-3′, 下游引物序列5′-TGATGGGTTTCCCATTCATGA-3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 min, 94 ℃變性15 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸20 s, 共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法定量分析ASMC中miR-455-3p、TLR4mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.8 免疫印跡法(WB)檢測(cè)各組ASMC中TLR4蛋白表達(dá): 采用蛋白抽提試劑盒提取各組ASMC總蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白樣品，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE), 聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜，一抗(anti-TLR4抗體 1∶1 000, anti-GAPDH抗體1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜, TBST緩沖液洗膜，二抗IgG(1∶20 000)室溫孵育1.5 h, 洗膜，用免疫印記化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色，數(shù)字化多功能圖像增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)曝片，拍照保存，分析蛋白條帶灰度值。

1.3.9 MTT檢測(cè)各組ASMC增殖情況: 將各組大鼠ASMC于消化后計(jì)數(shù)，以1×106/mL接種于96孔細(xì)胞板，培養(yǎng)48 h后，添加MTT溶液(5 g/L)20 μL孵育4 h, 棄培養(yǎng)基后添加二甲基亞砜(DMSO)150 μL, 振蕩混勻后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)正常對(duì)照組、模型組、miR-455-3p NC組、miR-455-3p mimic組、miR-455-3p mimic+pcDNA組和miR-455-3p mimic+pcDNA-TLR4組ASMC光密度(OD)值，每組6個(gè)重復(fù)。

1.3.10 TUNEL法檢測(cè)各組ASMC凋亡情況: 將正常對(duì)照組、模型組、miR-455-3p NC組、miR-455-3p mimic組、miR-455-3p mimic+pcDNA組和miR-455-3p mimic+pcDNA-TLR4組ASMC按1×106/mL密度接種于添加蓋玻片的6孔細(xì)胞板，待細(xì)胞完全匯合后收集蓋玻片，以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，純丙酮固定。按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組ASMC凋亡情況，隨機(jī)選取6個(gè)高倍鏡下視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比(即凋亡率)。

1.3.11 ELISA檢測(cè)各組ASMC上清液中TNF-α、IL-6水平: 收集正常對(duì)照組、模型組、miR-455-3p NC組、miR-455-3p mimic組、miR-455-3p mimic+pcDNA組和miR-455-3p mimic+pcDNA-TLR4組ASMC細(xì)胞上清液，每孔取100 μL樣品，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作要求檢測(cè)TNF-α、IL-6表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 哮喘大鼠與正常大鼠肺組織中miR-455-3p表達(dá)水平

模型組大鼠肺組織中miR-455-3p表達(dá)水平為(0.33±0.04), 低于正常對(duì)照組大鼠的(0.64±0.07), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 哮喘大鼠與正常大鼠肺組織、血清中炎性因子水平

模型組大鼠肺組織與血清中TNF-α、IL-6表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)表1。

表1 2組大鼠肺組織、血清中炎性因子水平比較 ng/L

2.3 大鼠ASMC鑒定

顯微鏡下可見(jiàn)，正常大鼠ASMC呈梭形，細(xì)胞排列疏密相間，細(xì)胞形態(tài)正常，有較長(zhǎng)突起(圖1A)。免疫組化染色法鑒定結(jié)果顯示, α-肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞為棕黃色(圖1B), 提示ASMC分離成功，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A: 正常大鼠ASMC; B: 免疫組化染色法鑒定顯示大鼠ASMC分離成功。

2.4 miR-455-3p與TLR4基因靶向關(guān)系驗(yàn)證結(jié)果

TargetScan在線生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)TLR4基因3′UTR區(qū)可能包含miR-455-3p的互補(bǔ)序列，見(jiàn)圖2, 提示TLR4可能是miR-455-3p的作用靶點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示, miR-455-3p mimics+WT-TLR4組ASMC相對(duì)熒光素酶活性低于另3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 另3組ASMC相對(duì)熒光素酶活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見(jiàn)表2, 提示miR-455-3p可直接靶向抑制TLR4基因表達(dá)。

2.5 各組大鼠ASMC中miR-455-3p、TLR4 mRNA及TLR4蛋白表達(dá)水平比較

與正常對(duì)照組比較，模型組和miR-455-3p NC組miR-455-3p表達(dá)水平降低,TLR4mRNA、TLR4蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與模型組、miR-455-3p NC組比較, miR-455-3p與miR-455-3p mimics+WT-TLR4組比較, *P<0.05。

mimic組和miR-455-3p mimic+pcDNA組miR-455-3p表達(dá)水平升高,TLR4mRNA、TLR4蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與miR-455-3p mimic+pcDNA組比較, miR-455-3p mimic+pcDNA-TLR4組miR-455-3p表達(dá)水平降低,TLR4mRNA、TLR4蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 模型組miR-455-3p、TLR4mRNA及TLR4蛋白表達(dá)水平與miR-455-3p NC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); miR-455-3p mimic組miR-455-3p、TLR4mRNA及TLR4蛋白表達(dá)水平與miR-455-3p mimic+pcDNA組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3、圖3。

表2 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-455-3p與TLR4的靶向關(guān)系

表3 各組大鼠ASMC中miR-455-3p、TLR4 mRNA及TLR4蛋白表達(dá)水平比較

A:正常對(duì)照組;B:模型組;C:miR-455-3pNC組;D:miR-455-3pmimic組;E:miR-455-3pmimic+pcDNA組;F:miR-455-3pmimic+pcDNA-TLR4組。圖3 各組大鼠ASMC中TLR4蛋白表達(dá)免疫印跡圖

2.6 各組大鼠ASMC增殖活性和凋亡率比較

與正常對(duì)照組比較，模型組和miR-455-3p NC組ASMC增殖活性降低，凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與模型組、miR-455-3p NC組比較, miR-455-3p mimic組和miR-455-3p mimic+pcDNA組ASMC增殖活性升高，凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與miR-455-3p mimic+pcDNA組比較, miR-455-3p mimic+pcDNA-TLR4組ASMC增殖活性降低，凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 模型組ASMC增殖活性、凋亡率與miR-455-3p NC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); miR-455-3p mimic組ASMC增殖活性、凋亡率與miR-455-3p mimic+pcDNA組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4、表4。

表4 各組大鼠ASMC增殖活性(OD)、凋亡率比較

2.7 各組大鼠ASMC上清液TNF-α、IL-6水平比較

模型組和miR-455-3p NC組ASMC上清液TNF-α、IL-6水平高于正常對(duì)照組, miR-455-3p mimic組和miR-455-3p mimic+pcDNA組TNF-α、IL-6水平低于模型組和miR-455-3p NC組，miR-455-3p mimic+pcDNA-TLR4組TNF-α、IL-6水平高于miR-455-3p mimic+pcDNA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 模型組TNF-α、IL-6水平與miR-455-3p NC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); miR-455-3p mimic組TNF-α、IL-6水平與miR-455-3p mimic+pcDNA組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠ASMC上清液TNF-α、IL-6水平比較 ng/L

3 討 論

miR-455-3p是一種與人類多種疾病密切相關(guān)的小RNA, 參與多種病理生理過(guò)程的調(diào)控[10]。CHENG F等[11]報(bào)道, miR-455-3p參與骨關(guān)節(jié)炎中白細(xì)胞介素-1(IL-1)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。SUN Y等[12]研究發(fā)現(xiàn), miR-455-3p在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用，通過(guò)靶向腫瘤蛋白翻譯控制1基因抑制癌細(xì)胞增殖。另外, miR-455-3p在免疫系統(tǒng)中具有抗炎作用，與多發(fā)性硬化癥患者的疾病嚴(yán)重程度高度相關(guān)，其表達(dá)與炎癥預(yù)測(cè)靶點(diǎn)髓樣分化因子88(MyD88)呈負(fù)相關(guān)[13]。由此提示, miR-455-3p在不同疾病中發(fā)揮的作用可能不盡相同。本研究結(jié)果顯示，與正常大鼠比較，哮喘大鼠肺組織中miR-455-3p顯著下調(diào)，且肺組織和血清中炎性因子TNF-α、IL-6水平顯著升高，提示miR-455-3p可能在哮喘中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。本研究通過(guò)生物學(xué)信息預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn), miR-455-3p與TLR4存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步開(kāi)展雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，提示TLR4是miR-455-3p潛在靶基因。XU X等[7]研究發(fā)現(xiàn), miR-455-3p可能通過(guò)靶向TLR4基因抑制冠心病進(jìn)展。然而, miR-455-3p靶向TLR4對(duì)哮喘大鼠ASMC生物學(xué)行為及炎癥因子分泌功能的影響尚需進(jìn)一步研究。

TLRs是固有免疫中重要的模式識(shí)別受體家族，包含TLR1至TLR10共10個(gè)成員，其中TLR4信號(hào)通路異常激活可導(dǎo)致氣道中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及Th2淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生大量炎癥因子，引起氣道高反應(yīng)，促進(jìn)哮喘發(fā)生與發(fā)展[14]。TLR4/MyD88信號(hào)通路參與調(diào)控哮喘和小鼠氣道炎癥的發(fā)生與發(fā)展[15]。ASMC是氣道炎癥的效應(yīng)細(xì)胞，其過(guò)度增殖或凋亡不足與哮喘進(jìn)展密切相關(guān)。相關(guān)研究[16-17]表明, TLR4表達(dá)可啟動(dòng)和調(diào)節(jié)哮喘氣道炎癥反應(yīng)，進(jìn)而激活下游核因子κB(NF-κB)和TNF-α、IL-6等炎性因子，參與調(diào)控ASMC增殖與凋亡，促進(jìn)氣道重塑。本研究用TNF-α刺激哮喘大鼠ASMC, 使其產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)染miR-455-3p NC、miR-455-3p mimic和共轉(zhuǎn)染miR-455-3p mimic與pcDNA、共轉(zhuǎn)染miR-455-3p mimic與pcDNA-TLR4。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠ASMC中miR-455-3p表達(dá)水平、ASMC增殖活性顯著降低，TLR4mRNA及TLR4蛋白表達(dá)水平、凋亡率和ASMC上清液TNF-α、IL-6水平顯著升高，提示模型組細(xì)胞中miR-455-3p下調(diào)、TLR4上調(diào)，兩者可能共同參與ASMC的凋亡和炎癥反應(yīng); 與轉(zhuǎn)染miR-455-3p NC比較，過(guò)表達(dá)miR-455-3p可使ASMC中miR-455-3p表達(dá)水平、ASMC增殖活性顯著升高，TLR4mRNA及TLR4蛋白表達(dá)水平、凋亡率和ASMC上清液TNF-α、IL-6水平顯著降低，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-455-3p可能通過(guò)靶向抑制TLR4減少ASMC凋亡和降低炎癥因子水平; 與共轉(zhuǎn)染miR-455-3p mimic與pcDNA比較，共轉(zhuǎn)染miR-455-3p mimic與pcDNA-TLR4可使ASMC中miR-455-3p表達(dá)水平、ASMC增殖活性顯著降低,TLR4mRNA及TLR4蛋白表達(dá)水平、凋亡率和ASMC上清液TNF-α、IL-6水平顯著升高，反向驗(yàn)證了上調(diào)TLR4可減弱miR-455-3p對(duì)ASMC凋亡和炎癥反應(yīng)的抑制作用，提示過(guò)表達(dá)miR-455-3p可通過(guò)靶向抑制TLR4表達(dá)，減輕哮喘大鼠ASMC炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)其增殖與凋亡平衡，發(fā)揮保護(hù)作用，同時(shí)過(guò)表達(dá)TLR4可消除miR-455-3p對(duì)哮喘大鼠ASMC的保護(hù)作用。

綜上所述，過(guò)表達(dá)miR-455-3p可能通過(guò)靶向抑制TLR4表達(dá)，減輕哮喘大鼠ASMC炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)其增殖與凋亡平衡，發(fā)揮重要的保護(hù)作用。但調(diào)控TLR4的miRNA眾多，且影響哮喘ASCM增殖、凋亡的機(jī)制復(fù)雜，其他miRNA及信號(hào)通路是否共同參與哮喘大鼠ASMC增殖與凋亡平衡的調(diào)節(jié)尚不明確，有待進(jìn)一步深入探究，且后續(xù)將繼續(xù)開(kāi)展動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討miR-455-3p對(duì)哮喘大鼠的影響。