陳 璨， 余寧靜， 單新宇， 盧 杰， 張海萍， 司紅起， 馬傳喜

(安徽農業(yè)大學農學院/農業(yè)部黃淮南部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，安徽合肥 230036)

小麥赤霉病(Fusariumhead blight，簡稱FHB)在我國乃至世界各地普遍發(fā)生，是溫暖濕潤和半濕潤麥區(qū)的重要病害之一。在大流行年份，赤霉病病穗率為50%～100%，產量損失超過80%，甚至絕收[1]。赤霉病主要是由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)侵染引起的真菌性病害，鐮刀菌侵染小麥后，不僅嚴重影響了小麥的品質和產量，其產生的各種真菌毒素，雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol，簡稱NIV)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，簡稱DON)等難以降解，會使小麥籽粒及其加工制品受到污染，進入食物鏈對人畜健康造成危害。Schroeder等首次將小麥赤霉病抗性分為抗侵染(TypeⅠ)和抗擴展(TypeⅡ)2類[2]；Mesterhazy等在此基礎上提出了3種新抗性類型，分別為抗毒素積累(TypeⅢ)、籽?？垢腥拘?Type Ⅳ)和耐病性(TypeⅤ)[3]。TypeⅠ型體現小麥抵抗病原菌初侵染的能力，一般采用自然發(fā)病或孢子彌霧接種條件下的病穗率或病情指數(disease index，簡稱DI)表示；Type Ⅱ型指小麥抵御病原菌沿穗軸擴展的能力，一般在小麥揚花期采用人工單花滴注接種下的病小穗率為指標；Type Ⅲ型抗性指小麥抑制毒素積累或降解真菌毒素的能力，一般用籽粒中毒素積累量進行評估；Type Ⅳ型可以用感病籽粒的比例進行衡量；Type Ⅴ型利用在一定發(fā)病程度下的小麥產量損失進行評價[4]。

全基因組關聯分析(genome wide association study，簡稱GWAS)是以連鎖不平衡(linkage disequilibrium，簡稱LD)為基礎，以自然群體為研究對象，通過目標性狀與分子標記之間的關聯關系，從而得到關聯位點的分析方法，現已廣泛應用于小麥、玉米、水稻等多種農作物當中[5]。國內外研究者們對小麥赤霉病抗性展開了大量研究，目前已定位400多個數量性狀基因座(quantitative trait locus，簡稱QTL)，分布在小麥的21條染色體上[6]。已發(fā)現的小麥赤霉病抗病基因有Fhb1～Fhb7[7]，其中位于3BS染色體上的Fhb1最早在我國小麥品種蘇麥3號中被發(fā)現，其在各種環(huán)境和遺傳背景下都較穩(wěn)定，現已在育種工作中得到廣泛應用。Arruda等對273份美國冬小麥品種進行GWAS分析，在4A、6A、7A、1D、4D、7D染色體上發(fā)現了與赤霉病抗性顯著關聯的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，簡稱SNP)以及多個與Fhb1關聯的標記[8]。Wang等通過對PNW和CIMMYT地區(qū)的170份春小麥材料進行赤霉病綜合評價，鑒定出一些與蘇麥3號有相似抗性的優(yōu)質品系，在1B、2B、4B、5A、5B、6A 染色體上關聯到了顯著SNP位點，其中位于5BS上的QTL可能是一個新的抗DON積累位點[9]。朱展望通過全基因組關聯分析，在自然群體中發(fā)現5個較為穩(wěn)定的抗赤霉病位點，可解釋5.0%～10.3%的表型變異率，在揚麥16/中麥895群體中檢測到7個穩(wěn)定的位點，并開發(fā)連鎖標記[10]。

5種抗性類型遺傳和作用機制各不相同，它們協同作用可提高小麥對赤霉病的整體抗性[11]，研究抗性類型間的關系利于更好地利用小麥的遺傳抗性。絕大多小麥抗赤霉病遺傳研究集中在抗擴展(TypeⅡ)類型，然而應用最為廣泛的抗赤霉病擴展基因Fhb1不能降低籽粒的抗毒素累積能力[12]。小麥抗性機制復雜，我國抗赤霉病育種實踐多采用病情指數或病小穗率作為抗性鑒定指標，但后期感染或品種的主動解毒機制會導致DI與毒素累積量低相關甚至無相關性。由于檢測技術和成本等原因，很多育種家們在研究小麥赤霉病抗性時并沒有測量籽粒中真菌毒素的含量，然而隨著赤霉病毒素污染問題的日益嚴重，我們應該加強對此類問題的重視。本研究通過對91份小麥品種(系)構建的自然群體進行田間病情指數調查，并對籽粒中DON、NIV含量進行測定，探究小麥赤霉病抗侵染和抗毒素積累之間的關系；并結合90K SNP芯片，利用全基因組關聯分析獲得與小麥赤霉病病情指數和毒素積累量顯著關聯的位點，發(fā)掘相關候選基因，以期為小麥赤霉病分子標記輔助選擇提供信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種(系)共91份，包含66份黃淮南片冬小麥區(qū)品種、13份長江中下游品種、7份西南麥區(qū)品種、1份北方麥區(qū)品種以及4份國外品種。分別于2019—2020年、2020—2021年種植于安徽省合肥市郭河安徽農業(yè)大學皖中試驗站小麥赤霉病自然發(fā)病鑒定區(qū)。

1.2 小麥赤霉病田間病情指數調查

種植材料的乳熟中后期，從每份小麥品種中隨機選取50穗，對91份小麥赤霉病的發(fā)病情況進行調查并統(tǒng)計數據結果。病情指數計算公式如下：

病情分級標準采用國家標準GB/T 15796—2011《小麥赤霉病測報技術規(guī)范》[13]。0級：無病穗；1級：感病小穗占全部小穗25%以下；2級：感病小穗占全部小穗25%～50%；3級：感病小穗占全部小穗50%～75%；4級：感病小穗占全部小穗75%以上。

1.3 超高效液相色譜(UPLC)法測定小麥真菌毒素

1.3.1 標準溶液的配制及樣品前處理 分別取 1 mg DON標準品、1 mg NIV標準品，用甲醇溶液溶解成100 μg/mL標準液。再分別取等量100 μg/mL 標準液混合成50 μg/mL 混合標準液置于-20 ℃冰箱備用。選用流動相水 ∶乙腈(體積比50 ∶50)稀釋 50 μg/mL 混合標準液10.00、8.00、5.00、2.00、1.00、0.50 μg/mL的混合工作液，經0.22 μm有機濾膜過濾后得到標準曲線溶液。

將待測的小麥籽粒樣品磨碎混勻，稱取25.0 g樣品置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL乙腈 ∶水(體積比84 ∶16)混合溶劑，35 ℃超聲萃取 30 min，靜置后用定量濾紙進行過濾，隨之吸取8 mL濾液于試管中，并加入80 μL乙酸，經Mycosep#226多功能凈化柱凈化，吸取4 mL流出液，于 55 ℃氮吹至干。在底物中加入1 mL流動相(水 ∶乙腈體積比 50 ∶50)溶解，超聲后過0.22 μm有機濾膜待上機檢測。

1.3.2 色譜條件 選取的色譜條件如下：色譜柱：C18柱，2.1 mm×100 mm，1.8 μm；檢測波長：λ=240 nm；機器檢測流動相為A相超純水(含0.1%乙酸)、B相乙腈；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；流速：0.2 mL/min；梯度洗脫程序見表1。DON、NIV含量用安捷倫高效液相色譜自帶工作站分析，根據保留時間定性，用峰面積外標法定量，最終結果取重復測量3次后的平均值。

1.4 表型數據統(tǒng)計、群體結構與關聯分析

表型數據采用SPSS 24.0及Excel 2019進行相關統(tǒng)計分析，用R語言計算3種性狀的廣義遺傳力(h2)，計算公式為h2=σg2/(σg2+σe2)[14]，其中：σg2表示遺傳方差，σe2表示環(huán)境方差。利用90K SNP芯片對91份小麥品種進行基因型分型，去除缺失率>15%，最小等位基因頻率<5%的SNP標記。

表1 梯度洗脫程序

用 Structure 2.3.4 軟件對91份小麥材料進行群體結構分析，設置模擬迭代循環(huán)次數為50 000，運行迭代參數為100 000，群體參數K為1～11，每個K獨立運行6次，選取最大ΔK對應的K值作為最佳亞群數量。

用Tassel 5.0軟件中的混合線性模型(mixed linear model，簡稱MLM)，以群體結構分析后的Q值和親緣關系K值作為協變量，結合相關的表型數據和SNP位點的基因型數據進行關聯分析，在一定程度上控制遺傳背景的影響，避免產生假陽性。當標記的-lgP>3，即P<0.001時認為性狀與標記存在顯著關聯。

2 結果與分析

2.1 表型數據分析

由91份小麥品種(系)的表型數據統(tǒng)計分析結果(圖1、表2)可知，病情指數變幅為2.0～90.5，DON含量范圍為34.0～2 997.7 μg/kg，NIV含量范圍為 48.0～1 293.5 μg/kg，變異系數范圍為23.07%～69.31%，說明該自然群體的性狀變異范圍廣，選擇潛力較大，赤霉病抗性在不同小麥品種中差異顯著。廣義遺傳力結果表明，3個性狀的遺傳力均大于60%，表明赤霉病抗性受遺傳變異的影響較大，環(huán)境對其影響較小。

表2 表型數據基本統(tǒng)計信息

2.2 不同抗性指標的相關性分析

病情指數和籽粒中DON、NIV含量分別作為品種籽粒抗侵染和抗毒素積累的指標。通過對2年內小麥病情指數和DON、NIV含量的相關性分析(圖2)可知，在毒素積累量上，NIV含量與DON含量呈顯著正相關。在毒素含量和病情指數的關系中，2020年的DON含量與病情指數沒有顯著的相關性，2021年的DON含量與病情指數呈顯著正相關。2年的NIV含量與病情指數均呈顯著正相關。在病情指數相同的情況下，毒素含量可能不同，病情指數高的品種，毒素含量卻不一定高，如Glenlen、皖52、川麥42等。毒素含量高的品種，病情指數可能不高，如荔高6號、皖麥38等。綜上表明，赤霉病病情指數與毒素含量之間存在一定的相關性，具有各自的遺傳特征。

2.3 標記分布與群體結構分析

分型質控后的21 968個SNP標記分布在小麥的21條染色體上。標記在A、B、D基因組間分布不均勻，其中B基因組的標記數最多，占總標記數的44.10%，D基因組的標記數最少，占總標記數的16.85%。物理圖譜總長度為14 043.9 Mb，標記密度為0.639 Mb/marker。群體結構分析結果使用Structure Harvest在線工具進行計算，當K=2時，運行結果最接近真實值，即這91份種質材料可大致被分為2個亞群，群體結構較為簡單。

2.4 全基因組關聯分析

將91份供試小麥材料的病情指數、DON含量和NIV含量與21 968個SNP標記進行全基因組關聯分析(圖3)，在P<0.001時，認為該位置的標記與性狀存在顯著關聯。GWAS結果共檢測到128個顯著SNP標記，分布在除1D、4D外的19條染色體上。其中，檢測到與病情指數顯著關聯的標記有30個，可解釋11.32%～18.90%的表型變異。與DON積累量顯著關聯的標記共56個，可解釋11.89%～22.29%的表型變異。與NIV顯著關聯的標記有42個，表型變異貢獻率為13.03%～34.11%。將在物理圖譜上前后3 Mb區(qū)間內的標記認為1個候選位點，在2個及以上環(huán)境中關聯到的穩(wěn)定位點有11個(表3)，其中僅與毒素穩(wěn)定關聯的位點有6個，分別在1A、4A、6A、6B、6D染色體上，可解釋11.96%～30.50%的表型變異。與毒素和病情指數都穩(wěn)定關聯的位點有4個，分別位于2A、2B、4B、5D染色體上，可解釋12.21%～34.11%的表型變異。

2.5 候選基因預測

參考中國春小麥品種的基因組信息，對穩(wěn)定的位點對應區(qū)段內基因進行分析，結合相關生物信息挖掘候選基因。通過對應的區(qū)段基因注釋，篩選得到15個與小麥赤霉病抗性相關的候選基因(表4)。其中TraesCS2A01G633200LC和TraesCS6D01G380900編碼谷胱甘肽S-轉移酶T3(glutathioneS-transferase T3)，TraesCS2A01G474700等3個基因編碼糖基轉移酶(glycosyltransferase)，TraesCS2A01G476500等5個基因編碼病程相關蛋白(pathogenesis-related protein 1，簡稱PR1)，TraesCS2B01G040000編碼 12-氧代植物二烯酸還原酶(12-oxophytodienoate reductase-like protein)，TraesCS6D01G383000編碼葡聚糖內切-1，3-β-葡萄糖苷酶(glucan endo-1，3-beta-glucosidase)，TraesCS6D01G383700編碼受體激酶蛋白(receptor-like kinase，簡稱RLK)。

表3 穩(wěn)定關聯的位點信息

表4 篩選獲得的與小麥赤霉病抗性相關的候選基因信息

3 討論與結論

近年來，受秸稈還田、輪作制度和極端天氣影響，赤霉病對我國小麥主產區(qū)的威脅逐漸北移。小麥赤霉病的發(fā)生不僅影響其產量和品質，一旦毒素累積量超標喪失商品價值等于絕收，嚴重威脅人民生命健康和國家糧食安全?？苟舅胤e累在很多歐美國家的小麥赤霉病育種中越發(fā)受到重視，在加拿大用于評估赤霉病抗性品種的公式中，DON含量已經占據了最高的權重[15]，然而在我國還沒有引起足夠的重視。小麥的病情指數與籽粒毒素累積量分別是抗擴展(TypeⅡ)和抗毒素累積(Type Ⅲ)抗性的評價指標，本研究結果表明二者存在一定的相關性，但又有各自的遺傳特征。徐飛等的研究表明，不同小麥品種的平均病害嚴重度與籽粒中毒素含量存在極顯著正相關[16]。陳懷谷等研究認為，病小穗率和毒素含量具有一定的相關性，但在不同年度間表現不同，也初步證明二者可能不是由同種基因所控制的[17]。鞏性濤等發(fā)現，小麥中赤霉病粒含量和DON含量不存在完全對應的線性關系，不能以赤霉病粒含量的多少來預測籽粒中DON含量[18]。在我國的西北地區(qū)氣候干燥，赤霉病很少發(fā)生，但2018年的一項調查表明，在這些地區(qū)82.9%的小麥樣品被DON污染，平均濃度為0.5 mg/kg，10%的樣品DON含量高于我國規(guī)定的限量值[19]。有些小麥的毒素含量高可能是存在晚期感染的可能性，有研究表明，晚期感染通常不會引起明顯的赤霉病癥狀，但會導致DON的高積累量[20]。

小麥的基因組較為龐大，以往關聯分析多采用簡單重復序列(SSR)標記，隨著高通量測序技術的發(fā)展，SNP標記的分布更廣且定位精度較好，逐漸成為QTL定位的主流。本研究將親緣關系納入到混合線性模型中，采用MLM+Q+K相結合的方法，即使群體的數量不大，也可以表現出較好的關聯能力，增加了關聯結果的準確性。小麥赤霉病抗性由主效基因和微效基因共同控制，是極為復雜的數量性狀。本研究在2年間定位到的位點不完全一致，可能存在環(huán)境條件的影響，一些抗性基因在特定的情況下能夠表達，同時還會受到關聯群體大小、分子標記密度等多種因素影響。本研究中，關于病情指數共檢測到30個顯著相關的SNP位點，其中2D染色體上的QFhb.ahau-2D在2年被重復檢測到，且表型貢獻率達16.82%～17.47%；關于DON累積量的顯著關聯位點56個，其中QFhb.ahau-1A-2、QFhb.ahau-4A、QFhb.ahau-6A和QFhb.ahau-6B位點在2年中均被檢測到。Semagn等在染色體1AL、1BL、6BS和7AL上發(fā)現了與赤霉病抗性相關的QTL，同時還可以減少DON的含量，其中1AL上的標記位置與本研究的QFhb.ahau-1A-1位置較為接近[21]。Fhb.ahau-2A在3個性狀中都能關聯到，與鄭彤整理的高置信度一致性數量性狀位點(meta quantitative trait loci，簡稱MQTL)區(qū)間hcMQTL-12屬同一位置[22]，且該位點也與TypeⅡ和TypeⅢ抗性關聯。He等在3BL和3DL染色體上發(fā)現了2個對減少DON含量有顯著作用的QTL[15]，前者對TypeⅡ和Type Ⅳ型抗性影響較小，后者則沒有影響；雖然全球范圍內關于赤霉病抗性QTL的研究較多，但由于試驗材料和研究方法的不同，共同定位的標記較少且不穩(wěn)定，因此挖掘和鑒定QTL在目前的條件下仍然是必要的。

本研究根據中國春參考基因組注釋信息，預測了穩(wěn)定關聯位點區(qū)段內的候選基因。其中TraesCS2A01G633200LC和TraesCS6D01G380900編碼谷胱甘肽S-轉移酶T3，它在生物體的防御機制中具有解毒的功效[23]。Fhb7編碼的蛋白能使DON的環(huán)氧基團打開，并催化其形成谷胱甘肽加合物(DON-GSH)，從而產生解毒效應[24-25]。編碼糖基轉移酶的TraesCS2A01G474700等3個基因可能在毒素解毒和赤霉病抗性中發(fā)揮關鍵作用[26]。Li等研究發(fā)現，在大麥中表達的UDP-葡萄糖基轉移酶HvUGT13248當在轉基因小麥中表達時，可以使DON、NIV解毒且明顯提高了NIV的抗性，提出可以將該基因作為抗赤霉病的候選基因[27]。TraesCS2B01G040000編碼的12-氧代植物二烯酸還原酶可能參與信號分子氧化脂質的合成與代謝。植物氧化脂質中的茉莉酸對禾谷鐮刀菌的生長有抑制作用，其啟動相應的防衛(wèi)反應，從而提高小麥赤霉病抗性[28]。TraesCS6D01G383700編碼受體激酶蛋白，在識別病原體相關分子模式和調節(jié)植物入侵真菌的免疫反應(包括谷物對真菌疾病的防御)中發(fā)揮重要作用，據報道可以響應DON以及抗赤霉病擴展[29]。TraesCS2A01G476500等基因編碼病程相關蛋白PR1，AtNPR1在易感病小麥中表達時，調節(jié)系統(tǒng)獲得抗性的激活，可以提高小麥抗赤霉病擴展能力[30]。TraesCS6D01G383000編碼的葡聚糖內切-1，3-β-葡萄糖苷酶在溫室和大田條件下均能增強小麥對赤霉病的抗性并減少DON積累量[31]。防衛(wèi)素以及其他一些富含半胱氨酸的蛋白可以與磷脂質和鞘脂互相作用，破壞真菌的細胞膜[32]，阻止病原菌入侵。