黃敏 張帥* 林詩(shī)堃 張?zhí)鞓?朱麗萍

（肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶 526000）

香蕉皮是香蕉加工產(chǎn)業(yè)中的主要副產(chǎn)物，約占香蕉總質(zhì)量的30%。目前，香蕉皮除少數(shù)被用于動(dòng)物飼料生產(chǎn)外，大多被廢棄。香蕉皮中除含有大量果膠、低聚糖、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等膳食纖維外，還富含多酚物質(zhì)。多酚是廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚類化合物，具有抗癌、抗菌、抗氧化和預(yù)防心腦血管疾病等多種生理活性。隨著香蕉深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對(duì)香蕉皮開展綜合利用研究，不僅能減輕環(huán)境污染，還可以創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益，帶動(dòng)產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展。

利用超聲波產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)能有效破壞植物細(xì)胞壁、加速胞內(nèi)成分溶出，而且超聲波可使介質(zhì)溫度瞬間升高，避免有效成分被破壞。目前將超聲波和纖維素酶聯(lián)合用于黃酮提取的研究較多，而用于香蕉皮多酚的提取研究則未見報(bào)道。本研究先采用超聲波輔助纖維素酶法提取香蕉皮多酚，然后設(shè)計(jì)均勻試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，并對(duì)香蕉皮多酚的抑菌作用進(jìn)行了測(cè)定。本研究可為進(jìn)一步挖掘香蕉皮利用價(jià)值以及開發(fā)香蕉皮多酚類產(chǎn)品提供技術(shù)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 原料試劑

香蕉，購(gòu)于本地超市，新鮮無腐爛，取皮備用；纖維素酶，食品級(jí)，酶活力3 萬(wàn)IU/g，北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；沒食子酸、福林酚試劑、乙醇、碳酸鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉等藥品試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

大腸桿菌（E.Coli）、金黃色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢桿菌（B.s），本院食品微生物實(shí)驗(yàn)室4 °C保存。

檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液：檸檬酸4.80 g，溶解后定容至250 mL（A 液，0.1 mol/L）；磷酸氫二鈉7.10 g，溶解后定容至250 mL（B液，0.1 mol/L）。

纖維素酶緩沖液：吸取25 mL 0.1 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶于50 mL 容量瓶，用蒸餾水將1.000 g纖維素酶溶解后移至50 mL容量瓶，定容。

1.2 儀器設(shè)備

UV/VIS 916 紫外可見分光光度計(jì)，GBC 科學(xué)儀器公司；PHS-3C 精密酸度計(jì)，上海大譜儀器有限公司；YXJ-2高速離心機(jī)、HH-6恒溫水浴鍋，金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；S-450D超聲波細(xì)胞破碎儀（350 W，20 kHz），必能信超聲有限公司；TDZ5-WS離心機(jī)，湖南省湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 香蕉皮多酚提取

香蕉皮切片，沸水熱燙5 min 以鈍化多酚氧化酶活性。冷卻后移至打漿機(jī)破碎，均質(zhì)勻漿1 min后移至100 mL 燒杯中，加入乙醇，調(diào)pH 值，加入纖維素酶于水浴鍋中浸提多酚，將其置于超聲波細(xì)胞破碎儀中繼續(xù)提取多酚，提取溫度45 °C，提取液4 500 r/min 離心15 min，上清液即為香蕉皮多酚溶液。

1.3.2 香蕉皮多酚含量測(cè)定

采用福林酚法測(cè)定香蕉皮多酚含量。吸取3 mL香蕉皮多酚提取液，加入3 mL 福林酚試劑，混勻，3 min 內(nèi)加入3 mL10%碳酸鈉溶液，充分混勻，40 ℃水浴鍋中避光放置1 h，在波長(zhǎng)760 nm 處測(cè)吸光度。以試劑溶液作空白對(duì)照，分別將測(cè)得的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到樣品液中多酚質(zhì)量濃度，按下列公式計(jì)算香蕉皮（樣品液）多酚得率（以干質(zhì)量計(jì)）：M=C×（V×k）/m×103。式中：M為多酚得率，mg/g；C為提取液中多酚質(zhì)量濃度（以沒食子酸計(jì)），mg/mL；V為提取液體積，mL；m為香蕉皮質(zhì)量，g；k為樣液稀釋倍數(shù)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

參考楊賢松等的方法，稱取50 mg 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于500 mL 容量瓶中溶解，振搖混勻后定容，即為0.1 mg/mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液；稱取20 g 碳酸鈉，加適量去離子水溶解，定容至200 mL，配制成10%碳酸鈉溶液。分別吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL于100 mL容量瓶中，加入3 mL福林酚試劑，搖勻；放置3 min 后加入3 mL 10%碳酸鈉溶液，搖勻；于40 °C 恒溫槽中遮光反應(yīng)1 h 后定容，各溶液沒食子酸含量分別為0.0 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、4.0 mg/L、5.0 mg/L、6.0 mg/L、7.0 mg/L，于波長(zhǎng)760 nm 處測(cè)吸光度，吸光度與沒食子酸質(zhì)量濃度之間的線性方程為：Y=0.114 3X+0.038 2，R2=0.991 9，該方程在1.0 mg/L～7.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)

在超聲時(shí)間20 min 條件下，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、纖維素酶添加量、酶解時(shí)間、酶解pH 值、酶解時(shí)間5 個(gè)因素對(duì)多酚得率的影響，根據(jù)結(jié)果確定適宜的提取條件。

1.4.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)

配制不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（20%、30%、40%、50%、60%、70%）的香蕉皮勻漿液，將pH 值調(diào)至5，纖維素酶添加量0.02%，酶解溫度45 °C，酶解時(shí)間1 h，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)香蕉皮多酚得率的影響。

1.4.1.2 pH值

配制乙醇體積分?jǐn)?shù)60%的香蕉皮勻漿液，分別調(diào)為不同pH 值（3、4、5、6、7、8），纖維素酶添加量0.02%，酶解溫度45 °C，酶解時(shí)間1 h，考察pH值對(duì)香蕉皮多酚得率的影響。

1.4.1.3 酶添加量

配制乙醇體積分?jǐn)?shù)60%的香蕉皮勻漿液，調(diào)pH 值為3，分別設(shè)定不同纖維素酶添加量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.06%、0.07%），酶解溫度45 °C，酶解時(shí)間1 h，考察酶添加量對(duì)香蕉皮多酚得率的影響。

1.4.1.4 酶解溫度

配制乙醇體積分?jǐn)?shù)60%的香蕉皮勻漿液，調(diào)pH 值為3，纖維素酶添加量0.02%，分別設(shè)定不同酶解溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），酶解時(shí)間1 h，考察酶解溫度對(duì)香蕉皮多酚得率的影響。

1.4.1.5 酶解時(shí)間

配制乙醇體積分?jǐn)?shù)60%的香蕉皮勻漿液，調(diào)pH 值為3，纖維素酶添加量0.02%，酶解溫度60 °C，分別設(shè)定不同酶解時(shí)間（60 min、80 min、100 min、120 min、140 min、160 min），考察酶解時(shí)間對(duì)香蕉皮多酚得率的影響。

1.4.2 均勻試驗(yàn)

以香蕉皮多酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)均勻試驗(yàn)優(yōu)化多酚提取工藝。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，用DPS 7.5軟件設(shè)計(jì)5因素6水平U6（65）均勻試驗(yàn)。

1.4.3 香蕉皮多酚提取物抑菌性測(cè)定

先將E.Coli、S.a和B.s接種于牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)。采用濾紙片擴(kuò)散法，將營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基溶化后傾入培養(yǎng)皿（20 mL/皿），待冷卻凝固后加入0.2 mL 供試菌懸液，然后用無菌刮棒涂勻，吸取1 mL 香蕉皮多酚提取液于濾紙片（d=6 mm）上，并使其完全均勻分散，貼到涂抹適宜濃度菌懸液的培養(yǎng)基平板上，每皿2 片并以無菌水作對(duì)照，重復(fù)3 次。最后將供試菌株在37 ℃培養(yǎng)24 h后按十字交叉法測(cè)定清晰抑菌圈直徑。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)做3次平行，用Excel 2010、Origin 8.0和DPS 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)香蕉皮多酚得率的影響

由圖1 可知，香蕉皮多酚得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而逐漸增大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，多酚得率最大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，多酚得率反而呈逐漸下降趨勢(shì)。這主要是因?yàn)楦邼舛忍崛?huì)引起細(xì)胞蛋白質(zhì)變性，間接影響多酚溶出，最終導(dǎo)致得率降低。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響

2.1.2 pH值對(duì)香蕉皮多酚得率的影響

由圖2 可知，pH 值改變會(huì)影響酶活性從而影響多酚得率。當(dāng)pH 值為3.0 時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值1.924 mg/g。當(dāng)pH值超過3.0時(shí)，得率反而下降，這可能與酶的最適酶解pH 值有關(guān)，當(dāng)酶解pH 值偏離最適pH 值時(shí)不利于酶的催化作用，酶活性下降會(huì)減弱對(duì)細(xì)胞壁的破壞效果，不利于多酚的提取。

圖2 pH值對(duì)多酚得率的影響

2.1.3 酶添加量對(duì)香蕉皮多酚得率的影響

由圖3 可知，在0.01%～0.02%添加范圍內(nèi)，隨著纖維素酶添加量的增加，多酚得率明顯提高。當(dāng)酶添加量為0.02% 時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值2.201%。此后繼續(xù)提高酶添加量，多酚得率反而降低。原因是當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，增大酶量可以提高反應(yīng)速度，從而提高得率；當(dāng)酶濃度達(dá)到足以使反應(yīng)迅速完成時(shí)，即為酶最大添加量，此時(shí)反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡；但當(dāng)酶添加過多時(shí)，則會(huì)打破動(dòng)態(tài)平衡而抑制反應(yīng)使得率下降。

圖3 酶添加對(duì)多酚得率的影響

2.1.4 酶解溫度對(duì)香蕉皮多酚得率的影響

由圖4 可知，隨著酶解溫度升高，香蕉皮多酚得率先升后降。當(dāng)酶解溫度為60 ℃時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值1.9%。繼續(xù)升溫，會(huì)導(dǎo)致纖維素酶變性失活，酶解度下降多酚得率減小。

圖4 酶解溫度對(duì)多酚得率的影響

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)香蕉皮多酚得率的影響

由圖5 可知，隨著酶解時(shí)間的增加，香蕉皮多酚得率逐漸增加，當(dāng)酶解時(shí)間為120 min 時(shí)，多酚得率最高為1.923%。超過120 min 后，多酚得率呈下降趨勢(shì)，原因可能是時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致纖維素酶活性降低或底物量不足導(dǎo)致反應(yīng)終止。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

2.2 均勻試驗(yàn)結(jié)果

均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如下頁(yè)表1 所示。用DPS 7.5 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸，建立回歸方程，并對(duì)模型作顯著性檢驗(yàn)分析，結(jié)果見表2。

表1 均勻設(shè)計(jì)和結(jié)果

表2 二次多項(xiàng)式逐步回歸分析結(jié)果

由DPS 7.5 軟件分析得回歸方程：Y=6.454 7-10.743 48X1+7.451 17X1X1-0.005 617 0X1X4+0.256 836X2X3。由表2可知，回歸模型極顯著（P=0.006 3<0.01），回歸方程的決定系數(shù)R2=0.999 98，說明該方程可以解釋99.998%的得率數(shù)據(jù)變異，方程擬合度非常好，可用于對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析預(yù)測(cè)。由表2中的t檢驗(yàn)值和P值分析可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，各因素對(duì)得率影響最大的為乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1），達(dá)到極顯著水平，其他單因素均不顯著。各因素的交互項(xiàng)顯著性表現(xiàn)為：X1X1、X1X4、X2X3的P值均達(dá)極顯著水平。由各變量顯著性P值可知對(duì)提取率影響的大小順序?yàn)閄1X4>X1>X1X1>X2X3。

方程求極值可得最優(yōu)工藝參數(shù)，即最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)45.0%，纖維素酶添加量0.06%，酶解pH值2.51，酶解時(shí)間108.42 min，酶解溫度69.28 ℃，多酚得率最大預(yù)測(cè)值為2.893 7 mg/g?？紤]到實(shí)際操作的方便性，將酶解pH 值、酶解時(shí)間及酶解溫度3 個(gè)變量的工藝參數(shù)修飾為：2.5、108 min、70 ℃，在此工藝條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，多酚得率平均為2.989 mg/g，相對(duì)誤差為0.89%。

2.3 香蕉皮多酚提取物的抑菌性試驗(yàn)結(jié)果

如表3 所示，香蕉皮多酚提取物對(duì)3 種病原菌均表現(xiàn)出抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果較強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌的抑菌作用較弱。由此推斷，香蕉皮多酚提取物可能對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的抑制作用。

表3 香蕉皮提取物對(duì)不同菌種的抑菌效果

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助纖維素酶法提取香蕉皮多酚，通過單因素試驗(yàn)和均勻試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝。最優(yōu)工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，纖維素酶添加量0.06%，酶解pH 值2.5，酶解時(shí)間108 min，酶解溫度70 ℃。在最優(yōu)條件下提取香蕉皮多酚，多酚得率為2.989 mg/g。羅蘭等采用螯合劑輔助提取香蕉皮多酚得率為1.614%，楊賢松等采用乙醇提取，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化香蕉皮多酚提取工藝，多酚得率為1.46%，吳德智等采用乙醇提取，利用Box-Behnken 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，多酚得率為1.97%，可見，與單一提取方法相比，超聲波輔助酶法提取可顯著提高多酚得率。對(duì)香蕉皮多酚提取物進(jìn)行了抑菌性測(cè)定，結(jié)果表明香蕉皮多酚提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果較好。下一步將開展香蕉皮多酚單體成分結(jié)構(gòu)和活性方面的研究。