郭瑞，付燕峰，婁亞坤，苗銀萍，瞿超杰，任寶紅

（鄭州中道生物技術(shù)有限公司 鄭州 450000）

鴨坦布蘇病毒（duck tembusu virus，DTMUV）是一種可以引起鴨坦布蘇病的單鏈RNA 蟲媒病毒，屬于黃病毒科（flaviviridae），黃病毒屬（flavivirus），恩塔亞病毒群（ntaya virus group）。該病毒最早在1955 年發(fā)現(xiàn)于東南亞地區(qū)，90 年代傳入我國(guó)，并在2010 年后，在我國(guó)東南部等地區(qū)大面積感染鴨類，發(fā)病率高達(dá)90%，死亡率為5%～30%[1,2]。該病毒傳播速度快，感染性強(qiáng)，不分日齡鴨均易感染，導(dǎo)致雛鴨生長(zhǎng)緩慢，蛋鴨產(chǎn)蛋下降或停產(chǎn)，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，鴨坦布蘇病毒病僅2010 年造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)數(shù)十億元。此外，還能引起雞和鵝的感染和發(fā)病[3,4]。

DTMUV 病毒具有一個(gè)約11kb 的單股正鏈RNA 基因組，它由一個(gè)單獨(dú)開放閱讀框（ORF）組成，兩側(cè)分別是5'端和3'端非編碼區(qū)（UTR）。5'端被一個(gè)m7GppAmpN2 結(jié)構(gòu)所覆蓋，3'端沒有poly A 尾巴[5,6]。ORF 共編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白：囊膜蛋白（E）、前膜蛋白（prM）和衣殼蛋白（C），以及七種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和NS5）。同其他黃病毒一樣，DTMUV 的E 蛋白為病毒最大的結(jié)構(gòu)蛋白和主要的抗原蛋白，同時(shí)在病毒復(fù)制過程中，對(duì)病毒吸附、膜融合以及受體結(jié)合等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，決定著病毒的細(xì)胞嗜性[7,8]。

目前，檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的實(shí)驗(yàn)室方法主要有病毒分離鑒定、血清學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)等。病毒分離鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于快速檢測(cè)；血清學(xué)檢測(cè)包括有瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、間接免疫熒光等，整體存在敏感性低、特異性弱、操作較困難，不適應(yīng)于臨床快速診斷等缺點(diǎn)；分子生物學(xué)檢測(cè)，熒光探針技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、無毒害、可數(shù)據(jù)化，同時(shí)操作簡(jiǎn)便、快速、應(yīng)用廣泛，儼然成為主流核酸檢測(cè)技術(shù)。因此，本研究基于熒光探針技術(shù)，擬建立一種特異、敏感、穩(wěn)定的鴨坦布蘇病毒核酸檢測(cè)方法，以推進(jìn)DTMUV 的早期、快速診斷，為養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展增添技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1）樣品及來源。DTMUV 靶基因質(zhì)粒pUC57-DTMUV-E，委托華大基因合成；DTMUV WF-100 株，購(gòu)自齊魯動(dòng)物保健品有限公司；DTMUV HB 株，購(gòu)自瑞普保定生物藥業(yè)有限公司；DTMUV FX2010-108P 株、鴨瘟病毒（DVEV）和新城疫-I 系（NDV），購(gòu)自吉林正業(yè)生物制品股份有限公司；番鴨呼腸孤CA 株（MDRV），購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司；雞傳染性法氏囊B87 株（IBD）、雞傳染性喉氣管炎（ILTV）和禽流感-H7 亞型（AIV-H7），購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司；健康鴨組織，購(gòu)自大型生活超市。

2）主要試劑和儀器。核酸提取試劑盒（柱膜法），由鄭州中道生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；5× Neoscript RT Premix-UNG（ProbeqRT-PCR），購(gòu)自珠海寶銳生物科技有限公司；Gentier 48E 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)，購(gòu)自西安天隆科技有限公司。

1.2 方法

1）引物、探針設(shè)計(jì)與合成?；贜CBI 收錄DTMUV E 基因序列（登陸號(hào)KY626659.1），利用DNAman 軟件分析比對(duì)E 基因的相對(duì)保守區(qū)域，再結(jié)合軟件BD 8.0 設(shè)計(jì)引物和探針（見表1），同步對(duì)應(yīng)的靶序列為靶基因；委托華大基因合成引物、探針、靶基因。

表1 DTMUV引物探針信息

2）鴨坦布蘇病毒熒光RT-PCR 核酸檢測(cè)方法的建立。以鴨坦布蘇病毒疫苗WF-100 株為樣品，按照核酸提取試劑盒（柱膜法）提取核酸作為陽(yáng)性核酸模板；對(duì)合成質(zhì)粒pUC57-DTMUV-E 測(cè)定濃度，并用TE 緩沖液稀釋至107copies/μ L 作為陽(yáng)性質(zhì)粒模板；以核酸模板和質(zhì)粒模板的CT 值最小為原則，對(duì)反應(yīng)程序、引物濃度、探針濃度等條件，采用矩陣法摸索，優(yōu)化調(diào)試以建立鴨坦布蘇病毒熒光RT-PCR 核酸檢測(cè)方法。

3）特異性驗(yàn)證。對(duì)DTMUV（WF-100 株、FX2010-108 株、HB株）、DVEV、NDV、MDRV、IBD、ILTV、AIV-H7、健康鴨組織等10 種樣品，按照核酸提取試劑盒（柱膜法）提取核酸作為特異性驗(yàn)證核酸模板；使用建立的鴨坦布蘇病毒熒光RT-PCR 核酸檢測(cè)方法，對(duì)特異性驗(yàn)證核酸模板進(jìn)行特異性檢測(cè)驗(yàn)證。

4）敏感性驗(yàn)證。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：將合成質(zhì)粒pUC57-DTMUV-E 用TE 緩沖液10 倍連續(xù)梯度稀釋，制備107～101copies/μ L 7 個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)濃度模板，同時(shí)設(shè)立TE 緩沖液為空白對(duì)照。

敏感性驗(yàn)證：使用建立的鴨坦布蘇病毒熒光RT-PCR 核酸檢測(cè)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線7 個(gè)梯度質(zhì)粒模板檢測(cè)，分析該方法敏感性情況。并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析線性關(guān)系。

5）重復(fù)性驗(yàn)證。使用建立的鴨坦布蘇病毒熒光RT-PCR 核酸檢測(cè)方法，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線7 個(gè)梯度質(zhì)粒模板，進(jìn)行3 次重復(fù)檢測(cè)。分別統(tǒng)計(jì)分析各梯度的CT 值平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV，%），驗(yàn)證所建立方法的重復(fù)性。

2 結(jié)果

2.1 鴨坦布蘇病毒熒光RT-PCR 核酸檢測(cè)方法的建立

本研究經(jīng)過一系列以鴨坦布蘇病毒疫苗WF-100 株陽(yáng)性核酸和合成基因的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，對(duì)反應(yīng)程序、引物濃度、探針濃度等條件優(yōu)化調(diào)試。最終確定鴨坦布蘇病毒熒光RT-PCR 核酸檢測(cè)方法的引物終濃度為500nM，探針終濃度為300nM；反應(yīng)體系為25μ L，其中模板添加量為5μ L；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃/15min；95℃/30s；94℃/10s，60℃/30s，40 個(gè)循環(huán)。

2.2 特異性驗(yàn)證

采用鴨坦布蘇病毒熒光RT-PCR 核酸檢測(cè)方法分別對(duì)DVEV、NDV、MDRV、IBD、ILTV、AIV-H7、健康鴨組織等提取核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示均為陰性，而對(duì)DTMUV 的WF-100 株、FX2010-108 株、HB 株三種疫苗的提取核酸樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。試驗(yàn)結(jié)果顯示該檢測(cè)方法與常見禽類病毒核酸無交叉反應(yīng)，特異性為100%（圖1）。

圖1 qRT-PCR 檢測(cè)DTMUV 特異性驗(yàn)證擴(kuò)增曲線

2.3 敏感性驗(yàn)證

DTMUV 陽(yáng)性質(zhì)粒pUC57-DTMUV-E 用TE 緩沖液10 倍連續(xù)梯度稀釋，制備107～101copies/μ L 的7 個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)濃度，模板檢測(cè)結(jié)果顯示，鴨坦布蘇病毒熒光RT-PCR 核酸檢測(cè)方法的敏感性10copies/μ L（見圖2）。根據(jù)以陽(yáng)性質(zhì)粒濃度的對(duì)數(shù)為X 軸，以Ct值為Y 軸，繪制回歸方程，可得到DTMUV qRT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），計(jì)算分析相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，回歸方程式y(tǒng)=-3.2871x+40.541，擴(kuò)增效率為99.0%。說明該方法擴(kuò)增效率高，梯度線性關(guān)系良好。

圖2 qRT-PCR 檢測(cè)DTMUV 敏感性驗(yàn)證試驗(yàn)擴(kuò)增曲線

圖3 qRT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 重復(fù)性驗(yàn)證

經(jīng)過對(duì)DTMUV 標(biāo)準(zhǔn)曲線7 個(gè)梯度質(zhì)粒模板（107～101copies/μ L）的三重復(fù)檢驗(yàn)，計(jì)算各梯度平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV，%），結(jié)果顯示，該方法各梯度CV 值在0.07%～0.65%區(qū)間，整體小于0.5%（見表2）。說明該方法重復(fù)性良好，多次檢測(cè)數(shù)據(jù)波動(dòng)小。

表2 qRT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 分析與討論

鴨坦布蘇病毒最早發(fā)現(xiàn)于東南亞地區(qū)的馬來西亞，近年來在東南亞的泰國(guó)、馬來西亞等地區(qū)仍比較流行[9]。從地理傳播路線是東南亞至我國(guó)東南部，并沿海向北至山東等地。我國(guó)與東盟之間的經(jīng)貿(mào)往來正在迅速增長(zhǎng)，也暗示著鴨坦布蘇病毒可能會(huì)在疫情傳播中增強(qiáng)，需要我們加強(qiáng)關(guān)注。

本研究針對(duì)鴨坦布蘇病毒E 基因的保守片段設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了一種基于熒光探針RT-PCR 技術(shù)的核酸檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的特異性、敏感性、標(biāo)準(zhǔn)曲線和重復(fù)性等進(jìn)行了充分的分析和驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法特異性100%，與家禽常見的新城疫病毒、番鴨呼腸孤病毒、鴨瘟病毒、傳染性腦脊髓炎病毒、傳染性法氏囊病毒、傳染性喉氣管炎病毒、禽流感病毒H7 亞型等均無交叉反應(yīng)。檢測(cè)敏感性為10copies/μ L；文獻(xiàn)顯示YAN L等[10]采用的熒光探針法建立的坦布蘇病毒敏感性為50copies/μ L，王巧萍等[11]建立的熒光定量RT-PCR 檢測(cè)方法敏感性為3× 102copies/μ L；對(duì)比可見，本法的敏感性優(yōu)異。同時(shí)在曲線的擴(kuò)增效率為99.0%，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.9995，且各質(zhì)粒梯度的重復(fù)性CV 值在0.07%～0.65%間，均小于1%，適宜于病原核酸的定量檢測(cè)分析。

綜上所述，本研究針對(duì)DTMUV 的E 基因保守序列，基于熒光探針RT-PCR 技術(shù)建立的核酸檢測(cè)方法，在特異性、敏感性、重復(fù)性等方面性能良好，可為DMTUV 的臨床診斷和流行性病學(xué)調(diào)查提供一種技術(shù)支撐。