楊 鼎 呂鳳仙 李崇娟 徐學(xué)忠 胡靖鋒 楊紅麗 蘭梅 張麗琴 董相書 和江明*

（1 云南大學(xué)，云南昆明 650504；2 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，云南昆明 650205；3 國(guó)家蔬菜改良中心云南分中心，云南昆明 650205）

根腫病是一種世界性病害，主要危害十字花科作物，在我國(guó)北到黑龍江，南到廣東、廣西都有分布，而四川、山東、湖北、云南、重慶等地是我國(guó)根腫病發(fā)生重災(zāi)區(qū)（孫朝輝 等，2016）。結(jié)球甘藍(lán)（BrassicaoleraceaL.var.capitataL.）簡(jiǎn)稱甘藍(lán)，為兩年生十字花科蕓薹屬蔬菜作物，是我國(guó)重要的蔬菜作物之一，年種植面積約90 萬(wàn)hm2（楊麗梅等，2021）。近年來(lái)，甘藍(lán)根腫病發(fā)生面積急劇增加，導(dǎo)致其品質(zhì)和產(chǎn)量大幅度下降，甚至絕收（孫超 等，2016），急需育成抗病品種來(lái)解決困境。目前，結(jié)球甘藍(lán)抗病品種均為國(guó)外Ogura CMS 品種，轉(zhuǎn)育十分困難，不利于優(yōu)異種質(zhì)獲得、利用。因此，創(chuàng)制具有Ogura CMS 恢復(fù)基因的抗根腫病甘藍(lán)材料對(duì)于甘藍(lán)抗病聚合育種具有重大意義。前人通過(guò)對(duì)甘藍(lán)及其變種的抗性發(fā)掘，發(fā)現(xiàn)抱子甘藍(lán)和歐洲的各種野生甘藍(lán)抗性較強(qiáng)，但均存在抗性遺傳不穩(wěn)定、不易轉(zhuǎn)育的問(wèn)題（Crisp et al.，1989；陳欣 等，2015）。國(guó)外通過(guò)種間雜交等手段，將蘿卜中的抗性基因轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)中，獲得了一些抗病品種，如美國(guó)的先甘809、日本龍井275 等；但是國(guó)內(nèi)可以利用的甘藍(lán)根腫病抗源材料較少，并且存在抗性單一的問(wèn)題，例如CR49、CR52 等（司軍 等，2008）。

自O(shè)gura CMS不育胞質(zhì)轉(zhuǎn)育到蕓薹屬作物中，國(guó)內(nèi)外育種家通過(guò)體細(xì)胞融合、遠(yuǎn)緣雜交等方法將外源Rfo、Rfk1（Rfo基因的同源基因）育性恢復(fù)基因轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜中，使其育性得到恢復(fù)（Delourme et al.，1998；Niemel? et al.，2010）。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甘藍(lán)育種團(tuán)隊(duì)利用含有Rfo育性恢復(fù)基因的甘藍(lán)型油菜與Ogura CMS 芥藍(lán)遠(yuǎn)緣雜交，將甘藍(lán)型油菜中的Rfo育性恢復(fù)基因?qū)氲綐蛄翰牧辖嫠{(lán)中，再與芥藍(lán)進(jìn)行多代回交、標(biāo)記篩選、育性和細(xì)胞學(xué)觀察，獲得了結(jié)實(shí)性正常、育性恢復(fù)穩(wěn)定、形態(tài)與芥藍(lán)一致，染色體數(shù)為18 條（2n=18）的芥藍(lán)Ogura CMS 育性恢復(fù)材料（Yu et al.，2016，2017）；隨后將所獲得的芥藍(lán)恢復(fù)材料與Ogura CMS 抗根腫病甘藍(lán)材料進(jìn)行雜交，獲得了含有CRb抗性基因的甘藍(lán)材料（于海龍，2018），通過(guò)該材料進(jìn)行育性恢復(fù)-胞質(zhì)替換兩步法和多代回交、自交，最終獲得了CRb基因純合的根腫病抗性甘藍(lán)材料（Ren et al.，2020），成功以芥藍(lán)為橋梁獲得育性恢復(fù)的抗根腫病甘藍(lán)材料。

本試驗(yàn)以對(duì)根腫菌4 號(hào)生理小種有良好抗性的先甘336 作為母本，與甘藍(lán)型油菜Ogura CMS 恢復(fù)材料N21015 進(jìn)行種間雜交，通過(guò)甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜雜交復(fù)合種的獲得，以期將良好的根腫病抗性基因和恢復(fù)基因轉(zhuǎn)移到雜種中，獲得對(duì)根腫菌4 號(hào)生理小種具有抗性且攜帶恢復(fù)基因的種間材料，為從源頭上解決抗根腫病甘藍(lán)育種的難題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試甘藍(lán)品種先甘366 對(duì)根腫菌4 號(hào)生理小種具有良好抗性，購(gòu)自先正達(dá)公司；經(jīng)室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定和分子標(biāo)記鑒定確定不含根腫病抗性基因的甘藍(lán)材料GL21028，甘藍(lán)型油菜Ogura CMS 恢復(fù)材料N21015 和不含恢復(fù)基因的N160R均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所十字花科課題組提供。

供試菌種采集于云南省昆明市嵩明縣根腫病多發(fā)地區(qū)的甘藍(lán)腫根，經(jīng)Williams 鑒定系統(tǒng)鑒定為4號(hào)生理小種，甘藍(lán)腫根清洗后保存于-20 ℃冰箱中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料種植 2021 年種植在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院嵩明科研基地設(shè)施大棚內(nèi)，先甘366、GL21028、N160R 于3 月1 日播種，N21015 于4 月20 日播種；選取顆粒飽滿的種子，采用50 孔穴盤和育苗專用基質(zhì)進(jìn)行育苗，每份材料3 盤。

1.2.2 DNA 提取及含量測(cè)定 幼苗長(zhǎng)出第1 片真葉時(shí)，使用北京全式金生物技術(shù)股份有限公司的DNA 試劑盒提取DNA。分別取100 mg 子葉于-20℃冷凍，采用葉片研磨機(jī)研碎后參照試劑盒流程提取DNA；然后，使用1× TE 緩沖液溶解稀釋DNA至100 ng·μL-1，1%瓊脂糖凝膠電泳及核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA 的質(zhì)量。置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.3 甘藍(lán)根腫病表型鑒定 3 月15 日，先甘366和GL21028 幼苗長(zhǎng)出2 片真葉后，控水處理1 d，然后采用注射法分別接種根腫菌4 號(hào)生理小種菌液，接種濃度為1 × 108個(gè)·mL-1，每穴1 mL；以分別注射1 mL 蒸餾水作為空白對(duì)照，每處理1 盤。接種45 d 后，參考司軍等（2009）的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分別統(tǒng)計(jì)甘藍(lán)植株根腫病發(fā)病情況。

1.2.4 甘藍(lán)抗根腫病分子標(biāo)記篩選 利用孫超等（2016）、何海燕（2018）、劉笑顏（2020）、甘彩霞等（2022）設(shè)計(jì)的7 對(duì)與根腫病相關(guān)抗性基因連鎖的分子標(biāo)記（表1），以不含根腫病抗性基因的GL21028 為對(duì)照，參照蘭梅等（2021）的方法對(duì)先甘366 進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定。分別以先甘366、GL21028 的DNA 作為模板，依次采用7 對(duì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；然后取PCR 產(chǎn)物1 μL，250 V、30 min 條件下使用1.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在Bio-rad 凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行觀察并拍照，篩選出適合本試驗(yàn)的抗根腫病分子標(biāo)記，即在先甘366中具有條帶而在GL21028 中無(wú)條帶的引物。

表1 甘藍(lán)根腫病抗性基因引物序列

1.2.5 甘藍(lán)型油菜Ogura CMS 恢復(fù)基因分子標(biāo)記篩選利用Primard-Brisset 等（2005）、Hu 等（2008）、楊其東等（2016）設(shè)計(jì)的7 對(duì)與Ogura CMS 恢復(fù)基因相關(guān)的分子標(biāo)記（表2），以不含恢復(fù)基因的N160R 為對(duì)照，對(duì)N21015 進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，方法同1.2.4。篩選出適合本試驗(yàn)的恢復(fù)基因分子標(biāo)記，即在N21015 中具有條帶而在N160R中無(wú)條帶的引物。

表2 甘藍(lán)型油菜恢復(fù)基因引物序列

1.2.6 種間雜交胚挽救 4 月1 日，將6 片真葉的先甘366 幼苗轉(zhuǎn)移至人工冷庫(kù)，4 ℃條件下春化75 d，然后定植于單獨(dú)隔離的大棚內(nèi)，常規(guī)管理；N21015 同時(shí)定植。雜交前摘除父、母本開放花朵，套袋隔離，父本開花1～2 d 進(jìn)行雜交，取母本3 mm 長(zhǎng)的花蕾剝蕾授以父本花粉，配制先甘366 × N21015 雜交組合。授粉后套袋隔離，防止其他花粉污染。雜交12 d 后，取莢進(jìn)行胚挽救。參照姜嬌（2018）的胚挽救培養(yǎng)基研究結(jié)果，配制種間雜交胚挽救培養(yǎng)基E（MS+0.5 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1 mg·L-1AC +5 g·L-1CH），挑選綠色、飽滿的胚珠接種到該培養(yǎng)基上，在（25 ± 2）℃、光照12 h·d-1、光照強(qiáng)度1 500 lx 的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；成功分化的胚珠轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基D（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1 g·L-1AC+3 g·L-1CH）上，繼續(xù)培養(yǎng)；分化至具有完整植株形態(tài)后，轉(zhuǎn)接到1/2 MS 培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。待植株生根并長(zhǎng)出1 對(duì)真葉后，將根長(zhǎng)3 cm 左右的幼苗定植于蛭石基質(zhì)中，在（25 ± 2）℃、光照12 h·d-1、光照強(qiáng)度2 000 lx、相對(duì)濕度65%條件下進(jìn)行煉苗；成活植株于7 d 后室外常規(guī)管理，15 d 后移栽至大棚內(nèi)，常規(guī)水肥管理。

1.2.7 種間雜種人工誘導(dǎo)染色體加倍 8 月11 日，在移栽成活的種間雜種植株腋芽和生長(zhǎng)點(diǎn)處滴0.2%秋水仙素50 μL，每天1 次，連續(xù)處理3 d。待植株抽薹開花后，于盛花期對(duì)植株花粉進(jìn)行觀察，對(duì)花粉正常的植株進(jìn)行花粉育性檢測(cè)。于晴天上午11：00—12：00 采集具有正?；ǚ鄣幕ǘ?，使用亞歷山大染液進(jìn)行染色觀察，每朵花統(tǒng)計(jì)400 個(gè)花粉粒，計(jì)算花粉可育率，判斷植株是否恢復(fù)育性。

1.2.8 種間雜種鑒定 ①形態(tài)學(xué)觀察：成活后的雜種植株，在生長(zhǎng)茂盛時(shí)期觀察葉形、葉色、葉面特征、花器官的顏色大小等性狀，并分別與兩個(gè)親本進(jìn)行比較，判斷雜種真實(shí)性。

② 染色體分析：以父、母本及F1雜種植株為試材，參考Yang 等（2017）的方法進(jìn)行雌蕊染色體觀察，統(tǒng)計(jì)雜種雌蕊染色體數(shù)目，對(duì)經(jīng)染色體誘導(dǎo)加倍成功和未加倍處理的F1雜種植株進(jìn)行對(duì)比分析，并與父、母本進(jìn)行比較，判斷雜種倍性及其真實(shí)性。

③分子標(biāo)記鑒定：以F1雜種幼嫩葉片為試材，提取DNA，方法同1.2.2。利用1.2.4、1.2.5 篩選出來(lái)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使用1.8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，觀察條帶位置，分別與母本抗根腫病基因條帶和父本恢復(fù)基因條帶進(jìn)行對(duì)比，判斷雜種是否攜帶根腫病抗性基因和Ogura CMS 恢復(fù)基因。

④ 抗根腫病表型鑒定：以F1雜種植株為試材，接種根腫菌，方法同1.2.3，統(tǒng)計(jì)雜種植株根腫病發(fā)病情況，結(jié)合分子標(biāo)記鑒定結(jié)果，判斷雜種是否獲得抗性遺傳。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 檢測(cè)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，先甘366、GL21028、N21015、N160R 提取的DNA 均表現(xiàn)為條帶清晰、整齊，無(wú)拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明提取的DNA 質(zhì)量較好。核酸檢測(cè)儀檢測(cè)顯示，4 份材料單株DNA 樣品濃度在800～2 000 ng·μL-1之間，A260/A280在1.9～2.0之間，證明DNA 質(zhì)量可以滿足后續(xù)分子標(biāo)記鑒定要求。

2.2 甘藍(lán)根腫病表型鑒定結(jié)果

對(duì)先甘366 和GL21028 進(jìn)行室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定，結(jié)果如圖1 所示。不含根腫病抗性基因的GL21028 接種處理完全發(fā)病，發(fā)病級(jí)別最高達(dá)7 級(jí)；而先甘366 接種處理以及2 份材料的空白對(duì)照均未出現(xiàn)發(fā)病植株，說(shuō)明先甘366抗根腫病。

圖1 甘藍(lán)根腫病室內(nèi)苗期人工接種鑒定結(jié)果

2.3 甘藍(lán)抗根腫病分子標(biāo)記篩選結(jié)果

利用7 對(duì)已知與根腫病相關(guān)抗性基因連鎖的分子標(biāo)記引物對(duì)先甘366 和GL21028 進(jìn)行鑒定，凝膠電泳結(jié)果如圖2 所示。Crg-1 和Crg-2 在先甘366 中具有清晰條帶，而在GL21028 中沒(méi)有條帶或條帶不清；Crg-3、Crg-4、Crg-6 在先甘366 和GL21028中都沒(méi)有條帶；Crg-5 在GL21028 中有清晰條帶，但在先甘366 中條帶不清；Crg-7 在先甘366 和GL21028 中都有清晰條帶。綜上，Crg-1 和Crg-2 兩對(duì)引物可以鑒定出先甘366 攜帶抗性基因，適用于本試驗(yàn)，可以用作后續(xù)子代的抗性遺傳鑒定。

圖2 甘藍(lán)抗根腫病分子標(biāo)記篩選結(jié)果

2.4 甘藍(lán)型油菜Ogura CMS 恢復(fù)基因分子標(biāo)記篩選結(jié)果

利用7 對(duì)與Ogura CMS 恢復(fù)基因相關(guān)的分子標(biāo)記引物對(duì)N21015 和N160R 進(jìn)行鑒定，凝膠電泳結(jié)果如圖3 所示。Rfo-1、Rfo-4 和Rfo-6 在含有恢復(fù)基因的N21015 中具有清晰條帶，在不含恢復(fù)基因的N160R 中沒(méi)有條帶；Rfo-2、Rfo-7 在N21015和N160R 中均沒(méi)有清晰條帶；Rfo-3、Rfo-5 在N21015 和N160R 中均出現(xiàn)清晰條帶。綜上，引物Rfo-1、Rfo-4、Rfo-6 可以鑒定出N21015 攜帶恢復(fù)基因，適用于本試驗(yàn)，可以用作后續(xù)子代的恢復(fù)基因鑒定。

圖3 甘藍(lán)型油菜Ogura CMS 恢復(fù)基因分子標(biāo)記篩選結(jié)果

2.5 種間雜交胚挽救結(jié)果

先甘366 × N21015 種間雜交后，在母本植株上自然結(jié)實(shí)率為0，而雜種胚珠在培養(yǎng)基E 上成功萌發(fā)（圖4-A），獲得了種間雜種植株，證明甘藍(lán)×甘藍(lán)型油菜種間雜交后代不結(jié)實(shí)，需要通過(guò)人工胚挽救培養(yǎng)，才可以獲得雜種后代。

圖4 先甘366 × N21015 胚挽救過(guò)程

將增殖分化的胚珠轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基D 上，愈傷組織在該培養(yǎng)上增殖效果較好（圖4-B），表明該培養(yǎng)基適合用作先甘366 × N21015 雜種后代的增殖培養(yǎng)。將增殖后具有完整植株形態(tài)的幼苗轉(zhuǎn)接到1/2 MS 培養(yǎng)基上能夠很好地生長(zhǎng)，并形成良好的根系（圖4-C），表明1/2 MS 培養(yǎng)基適合雜種后代的生根培養(yǎng)。煉苗過(guò)程中，在（25 ± 2）℃、光照12 h·d-1、光照強(qiáng)度2 000 lx、相對(duì)濕度65%條件下幼苗生長(zhǎng)良好，移栽到田間后全部成活。

2.6 種間雜種染色體誘導(dǎo)加倍及育性鑒定結(jié)果

使用0.2%秋水仙素對(duì)移栽成活的幼苗連續(xù)處理3 次，成功獲得染色體加倍的F1雜種。由圖5-A、B 可見(jiàn)，染色體加倍成功的雜種植株莖葉比未加倍雜種植株肥大?；ǚ壅５幕ǘ浠ǚ塾詸z測(cè)結(jié)果表明，雜種植株花粉可育率為78.46%（圖5-C、D），育性正常，染色體誘導(dǎo)加倍成功，成功獲得可育的異源六倍體種間雜種。

圖5 種間雜交F1 染色體誘導(dǎo)加倍及花粉育性情況

2.7 種間雜種鑒定結(jié)果

2.7.1 形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 由圖6 可見(jiàn)，先甘366 ×N21015 種間雜種植株各性狀皆介于親本之間，葉片形狀為卵圓形，葉色墨綠，有少量蠟粉，與母本更為接近；葉柄著生3 對(duì)小葉，葉片生長(zhǎng)松散，植株形態(tài)與父本更為接近；花朵顏色為黃色，花瓣“十”字形，形狀近似圓形，更接近父本，花朵大小介于父、母本之間。綜上，可初步判斷所得雜種植株為先甘366 × N21015 種間雜交所得真雜種。

圖6 先甘366 × N21015 種間雜交植株及花器官形態(tài)

2.7.2 染色體分析 由圖7 可知，未加倍的種間雜交F1雌蕊染色體數(shù)目為28 條，加倍后的F1雌蕊染色體數(shù)目為56 條，是未加倍的2 倍，且為母本先甘366（2n=18）與父本N21015（2n=38）染色體數(shù)目之和。表明，雜種植株均為真雜種，且染色體誘導(dǎo)加倍成功，成功獲得異源六倍體種間雜種。

圖7 種間雜交F1 未加倍和加倍雌蕊染色體情況

2.7.3 分子標(biāo)記鑒定結(jié)果 對(duì)種間雜種進(jìn)行根腫病抗性基因分子標(biāo)記鑒定，結(jié)果如圖8 所示。利用Crg-1 和Crg-2 兩對(duì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，雜種條帶清晰，且均與母本先甘366 的條帶位置一致，表明雜種攜帶母本的根腫病抗性基因。

圖8 種間雜交F1 抗根腫病分子標(biāo)記鑒定結(jié)果

對(duì)種間雜種進(jìn)行Ogura CMS 恢復(fù)基因分子標(biāo)記鑒定，結(jié)果如圖9 所示。利用Rfo-1、Rfo-4、Rfo-6 等3 對(duì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，雜種均有與父本N21015 位置相同的條帶，表明雜種攜帶父本含有的Ogura CMS恢復(fù)基因。

綜上所述，先甘366 × N21015 種間雜交F1同時(shí)具有母本的根腫病抗性基因和父本的Ogura CMS恢復(fù)基因，所得雜種為真雜種。

2.7.4 抗根腫病表型鑒定結(jié)果 由圖10 可知，種間雜種接種處理、空白對(duì)照以及GL21028 空白對(duì)照均未出現(xiàn)發(fā)病植株，而GL21028 接種處理植株全部發(fā)病。參照司軍等（2009）的標(biāo)準(zhǔn)，雜種對(duì)根腫病表現(xiàn)為免疫，表明所得到的種間雜種具有母本的根腫病抗性基因，與分子標(biāo)記鑒定結(jié)果一致。

圖10 種間雜交F1 根腫病發(fā)病情況

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)抗病育種采用單一表型鑒定的方法，易受環(huán)境影響，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而通過(guò)表型鑒定結(jié)合分子標(biāo)記不但能夠快速進(jìn)行篩選，還能準(zhǔn)確鑒別出所期望性狀。司軍等（2011）、袁天成（2014）、梁峰豪等（2019）、李倩等（2021）通過(guò)室內(nèi)苗期人工接種和分子標(biāo)記輔助鑒定，篩選出對(duì)根腫病具有抗性的甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜材料，并構(gòu)建了相關(guān)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)采用室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定方法，參考司軍等（2009）的病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，成功對(duì)母本抗根腫病甘藍(lán)品種先甘366 和不抗根腫病甘藍(lán)材料GL21028 在表型上進(jìn)行了區(qū)分，確定先甘366對(duì)根腫病具有抗性。同時(shí)，使用何海燕（2018）設(shè)計(jì)的甘藍(lán)根腫病連鎖SCAR 分子標(biāo)記Crg-1、Crg-2，甘彩霞等（2022）設(shè)計(jì)的針對(duì)RsCr2的SSR 分子標(biāo)記Crg-7，孫超等（2016）設(shè)計(jì)的針對(duì)抗根腫病同源基因CRa、Crr1a的分子標(biāo)記Crg-3、Crg-4，劉笑顏（2020）設(shè)計(jì)的針對(duì)根腫病抗性基因CRd、CRb的分子標(biāo)記Crg-5、Crg-6，篩選出對(duì)本試驗(yàn)適用的2 對(duì)引物Crg-1 和Crg-2。對(duì)先甘366 × N21015 種間雜交F1進(jìn)行抗根腫病表型鑒定和分子標(biāo)記鑒定，結(jié)果表明獲得的種間雜種對(duì)根腫病表現(xiàn)為免疫，攜帶母本的根腫病抗性基因。

我國(guó)甘藍(lán)抗根腫病品種很少，且適應(yīng)范圍很窄，因此國(guó)內(nèi)對(duì)于根腫病的防治主要集中在物理和化學(xué)方法上，但防治效果均不理想，所以選育抗病品種是防治根腫病最根本的辦法。沈舒（2019）、曾愛(ài)松等（2021）通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交將白菜的根腫病抗性基因?qū)氲礁仕{(lán)中，獲得了抗根腫病的甘藍(lán)材料，種間雜種的遺傳背景與甘藍(lán)相似度較高于海龍（2018）以O(shè)gura CMS 芥藍(lán)為母本，以攜帶恢復(fù)基因的甘藍(lán)型油菜為父本，結(jié)合Ogura CMS 恢復(fù)基因分子標(biāo)記進(jìn)行背景篩選，成功將相關(guān)恢復(fù)基因?qū)氲侥副局?，獲得具有育性恢復(fù)的種間雜種，通過(guò)不斷回交獲得染色體為19 條且含有恢復(fù)基因的芥藍(lán)材料；姜嬌（2018）通過(guò)將于海龍（2018）獲得的含恢復(fù)基因的芥藍(lán)材料與抗根腫病的Ogura CMS 甘藍(lán)進(jìn)行雜交，獲得了含有根腫病抗性的種間雜種材料。石汶汶（2019）以O(shè)gura CMS 甘藍(lán)為母本，以攜帶恢復(fù)基因的甘藍(lán)型油菜為父本，通過(guò)胚挽救成功創(chuàng)制出甘藍(lán)Ogura CMS BC1四倍體雜種育性恢復(fù)材料。本試驗(yàn)利用Primard-Brisset等（2005）、Hu 等（2008）和楊其東等（2016）設(shè)計(jì)的針對(duì)Rfo恢復(fù)基因分子標(biāo)記的7 對(duì)引物，對(duì)N21015 和N160R 進(jìn)行初步篩選，篩選出了對(duì)本試驗(yàn)適用的3 對(duì)引物Rfo-1、Rfo-4 和Rfo-6。對(duì)先甘366 × N21015 種間雜交F1進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，結(jié)果表明成功獲得了含有Ogura CMS 恢復(fù)基因的種間雜種。

胚挽救可以解決遠(yuǎn)緣雜交不結(jié)實(shí)的問(wèn)題，姜嬌（2018）、石汶汶（2019）通過(guò)胚挽救成功獲得了甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜的種間雜種。本試驗(yàn)亦利用胚挽救對(duì)甘藍(lán)×甘藍(lán)型油菜種間雜種進(jìn)行培養(yǎng)，使用的培養(yǎng)基E（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg ·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1 mg·L-1AC+5 g·L-1CH）能夠?yàn)殡s種胚珠提供很好的生長(zhǎng)條件，獲得生長(zhǎng)良好的愈傷組織；而增殖培養(yǎng)基D（MS +0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1 g·L-1AC+3 g·L-1CH）對(duì)愈傷組織具有良好的誘導(dǎo)效果，能夠形成多個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)。表明增殖培養(yǎng)基添加水解酪蛋白（CH）和活性炭（AC）對(duì)種間雜種胚挽救增殖組織生長(zhǎng)有利，可以成功得到種間雜種，這與姜嬌（2018）的研究結(jié)果一致，但是在培養(yǎng)基植物激素添加的量上有所差別，可能是因?yàn)椴煌蛐退玫降姆N間雜種對(duì)不同植物激素的需求量有所不同。對(duì)增殖培養(yǎng)后具有植株形態(tài)的綠植體，使用1/2 MS 培養(yǎng)基對(duì)成苗和生根都具有良好的效果，這與呂鳳仙等（2021）生根培養(yǎng)基需要添加植物激素有所不同，表明不同雜種生根所需條件不一樣。因此，實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)該考慮不同品種的植物學(xué)特性，適當(dāng)選擇各種植物激素的配比濃度。

本試驗(yàn)得到的種間雜種為異源三倍體，減數(shù)分裂染色體無(wú)法正常聯(lián)會(huì)配對(duì)，從而不具有育性。人工誘導(dǎo)染色體加倍后植株恢復(fù)育性，花粉活力較好，植株形態(tài)偏向于甘藍(lán)型油菜，這與于海龍（2018）的研究結(jié)果相同，可能是因?yàn)楦仕{(lán)型油菜的遺傳背景在雜種中占比較大。本試驗(yàn)通過(guò)遠(yuǎn)緣種間雜交和胚挽救，在表型鑒定結(jié)合分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上，快速對(duì)親本和雜種進(jìn)行背景篩選和鑒定，成功獲得了同時(shí)攜帶根腫病抗性基因和Ogura CMS 恢復(fù)基因的甘藍(lán)×甘藍(lán)型油菜雜種F1，為后續(xù)甘藍(lán)抗性育種和恢復(fù)材料的創(chuàng)制奠定了基礎(chǔ)。