閆明哲，王萍,2*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）(2.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040)

阿爾茲海默癥（Alzheimer’s Disease，AD）又稱原發(fā)性老年癡呆癥，是一種具有遺傳性和散發(fā)性且與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病[1]。其典型表現(xiàn)為遺忘性認(rèn)知障礙，具有不可逆性和致死性[2,3]。研究顯示，到2050年全球AD 患者將超1 億，亞洲地區(qū)AD 患者將達(dá)6 280 萬[4]。因此，尋找有效防治AD 的方法是人們亟待解決的問題。

乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是生物神經(jīng)信號傳導(dǎo)過程的關(guān)鍵酶，可將神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水解為膽堿和乙酸[5]。AChE 活性過度增加會降低乙酰膽堿水平，引發(fā)或加重AD 等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[6]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin Converting Enzyme，ACE）抑制劑可阻斷Ang I 轉(zhuǎn)變?yōu)锳ng II，同時阻斷Ang II作用于Ang II-1 型受體[7,8]，從而減少因神經(jīng)元凋亡引起的不良反應(yīng)，可有效延緩神經(jīng)退行性病變。此外，氧化應(yīng)激產(chǎn)生過多的活性氧會使神經(jīng)元發(fā)生不可逆損傷，減輕氧化應(yīng)激對防治神經(jīng)退行性疾病舉足輕重[9]。因此，在標(biāo)準(zhǔn)療法AChE 抑制劑的基礎(chǔ)上結(jié)合ACE 抑制劑和自由基清除劑可有效防治AD。但AChE 和ACE抑制劑類藥物存在副作用且價格高昂，人們開始關(guān)注通過攝入食物防治AD。此外，食物所含活性物質(zhì)易被人體代謝和耐受，減少副作用發(fā)生[10]，這對開發(fā)具有緩解AD 的功能性食品具有重要意義。

紅甜菜（Beta vulgarisL.）別名火焰菜、紫菜頭，屬于石竹目（Caryophyllales）藜科（Chenopodiaceae）甜菜屬（Genus beta）[11]，富含甜菜色素、酚類、黃酮類、皂苷等活性物質(zhì)[12]。紅甜菜在維持健康和預(yù)防疾病方面具備一定潛能，具有抗炎、抗氧化、降血壓等藥理作用[13]。紅甜菜被認(rèn)為具有神經(jīng)保護作用，治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，如AD[14]。目前關(guān)于紅甜菜防治AD 研究較少，且鮮有學(xué)者研究乳酸菌發(fā)酵紅甜菜汁對ACE 和AChE 的抑制作用。

乳酸菌是功能性益生菌的代表，在發(fā)酵代謝過程中會產(chǎn)生乳酸菌素、生物活性肽等活性物質(zhì)，上述化合物具有抗氧化、抗炎、抑菌、免疫增強和調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等作用，可緩解和防治多種疾病[14]。孫百虎[15]選用植物乳桿菌發(fā)酵桑葚汁，試驗表明經(jīng)乳酸菌發(fā)酵可使總酚、總黃酮含量、DPPH·清除率和FRAP 顯著提升，且乳酸菌發(fā)酵促進了花青素類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。Szutowska 等[16]研究表明乳酸菌發(fā)酵果蔬汁能夠降低血清膽固醇水平，改善腸胃功能并增強免疫系統(tǒng)。王惠等[17]使用乳酸菌發(fā)酵樹莓汁，試驗發(fā)現(xiàn)通過乳酸菌發(fā)酵的樹莓汁其抑制腫瘤細(xì)胞活性能力、促進乳酸酸脫氫酶釋放能力、促進細(xì)胞凋亡能力均顯著提高。Seelam 等[18]使用球形芽孢桿菌發(fā)酵胡蘿卜汁，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后胡蘿卜汁的抗氧化活性和感官品質(zhì)都得到提升。Ming 等[19]研究表明，紅甜菜中甜菜色素可減少β-淀粉樣蛋白沉積，延緩AD 患者病情發(fā)展。以上研究均表明以乳酸菌發(fā)酵為技術(shù)手段可以顯著提升植物基質(zhì)的功能特性，并對相關(guān)產(chǎn)品的感官品質(zhì)起到一定的改善作用。

本研究以紅甜菜為原料，旨在利用乳酸菌發(fā)酵改善紅甜菜汁口感風(fēng)味、豐富其營養(yǎng)價值并提升對AD的防治能力。主要研究了經(jīng)嗜酸乳桿菌發(fā)酵的紅甜菜汁在發(fā)酵過程中pH 值、活菌數(shù)、總酸、還原糖、甜菜色素、總酚和黃酮含量及其自由基（ABTS+·、·O2-、·OH）清除能力、酶（AChE 和ACE）抑制能力。旨在探究抗氧化、酶抑制能力變化規(guī)律及其與生物活性物質(zhì)的關(guān)系，為探尋食源性AChE、ACE 抑制劑來源、推進紅甜菜精深加工并針對AD 功能性食品開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐和理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

紅甜菜（品種為沃丹），吉林省長春市；雙碳白砂糖，南京甘汁園糖業(yè)有限公司；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，LA-5），丹麥科漢森公司。福林酚、ABTS，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；沒食子酸、蘆丁、無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、氯化硝基四氮唑藍(lán)、還原輔酶I、N-甲基吩嗪甲基硫酸鹽、乙酰膽堿酯酶（蒼蠅頭部，0.2 UN）、5,5-二巰基-2,2-二硝基苯甲酸、碘代硫代乙酰膽堿、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸，上海源葉生物科技有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（兔肺，0.1 UN）、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，西格瑪奧德里奇公司；MRS 肉湯、瓊脂粉，北京奧博星生物科技有限公司；甲酸、乙腈（色譜純），德國Meker 公司；其余試劑、藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple TOF 5600 Plus 四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜檢測器聯(lián)用儀、ExionLC? AD UHPLC 超高壓液相色譜系統(tǒng)（配備Analyst 1.6 和Peakview 2.0 分析軟件及數(shù)據(jù)庫），美國AB SCIEX 公司；SW-CJ-2D 無菌操作臺，上海尚道儀器制造有限公司；PHS-3E pH 計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SPX-50B 生化培養(yǎng)箱，北京市恒諾利興科技有限公司；721 可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；TG16G 離心機，常州金壇儀器制造有限公司；EPO CH2 全波長酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；5030-PVL 高壓滅菌鍋，長春百奧生物儀器有限公司；L18-YZ05 真空保鮮破壁調(diào)理機，九陽家電有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 嗜酸乳桿菌菌懸液的制備

取適量培養(yǎng)至24 h 經(jīng)活化、馴化的培養(yǎng)液，5 000 r/min 離心10 min，棄上清液并取底部沉淀轉(zhuǎn)移至無菌水中。根據(jù)先前已確定的基于稀釋涂布平板計數(shù)-分光光度法確定活菌數(shù)，在600 nm 下調(diào)整其吸光度值為1.42～1.45，此時活菌數(shù)約為6.00 lg CFU/mL，菌懸液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品制備

選用新鮮紅甜菜，洗凈、去皮并切塊，將紅甜菜與無菌水按照料液比為1:4 使用破壁調(diào)理機在低氣壓（30 kPa）、40 000 r/min 條件下打漿4.5 min，4 層紗布過濾，自然pH 值，濾汁4 ℃條件下備用；白砂糖添加量7.5wt%，攪勻后將其置于紫外照射20 min；按10%（體積比）接種量向100 mL 紅甜菜汁中接入菌懸液并密封，30 ℃恒溫發(fā)酵54 h。

1.3.3 紅甜菜接種發(fā)酵過程評價指標(biāo)及測定方法

每間隔6 h 取樣，立即測定pH 值和乳酸菌活菌數(shù)；對樣品進行5 000 r/min 離心15 min 取上清液，經(jīng)適當(dāng)稀釋后測定還原糖和總酸、總酚、黃酮、甜菜色素含量及抗氧化能力和酶抑制能力。

1.4 評價指標(biāo)測定方法

1.4.1 理化指標(biāo)

（1）pH 值測定：pH 計直接測定。

（2）乳酸菌活菌數(shù)測定：采用稀釋涂布平板計數(shù)法在MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h 后計數(shù)[20]。

（3）總酸含量測定：參照《GB/T 12456-2008 食品中總酸測定》[21]并結(jié)合文獻(xiàn)[22]，采用電位滴定法。

（4）還原糖含量測定：參照王俊麗等[23]的方法，采用3,5-二硝基水楊酸法。

1.4.2 活性成分

（1）總酚含量測定：參照李祎等[24]的方法，采用Folin-Ciocalteu 法。

（2）黃酮含量測定：參照Li 等[25]的方法，采用NaNO2-Al(NO3)3分光光度法。

（3）甜菜色素含量測定：參照李垚等[26]的方法，采用分光光度法。

1.4.3 自由基清除能力

（1）ABTS+·清除率測定：參照Garzón 等[27]的方法，采用分光光度法。

（2）·O2-清除率測定：參照Li 等[28]的方法，采用NADH-PMS-NBT 經(jīng)典法。

（3）·OH 清除率測定：參照馮雋野等[29]的方法，采用硫代巴比妥酸法。

1.4.4 酶活抑制

（1）ACE 抑制活性測定：參照郝心悅等[30]的方法，采用FAPGG 底物法。

（2）AChE 抑制活性測定：參照王微[31]的方法，采用改良的Ellman 法。

1.4.5 甜菜色素UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析條件

1.4.5.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；流量0.4 mL/min；檢測時間15 min，流動相A 為含0.1%甲酸的水溶液，流動相B 為純乙腈；洗脫程序為0 min～5 min，5%～95% B；5 min～11 min，95% B；11 min～12 min，95%～5% B；12 min～15 min，5% B。

1.4.5.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），采用正離子和負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)，一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜掃描范圍分別為100～1 200m/z、50～1 200m/z；掃描類型為TOF；一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜的離子化電壓均為5 500 V；各氣路均使用氮氣（噴霧氣、輔助加熱氣和氣簾氣分別為50 psi、50 psi 和35 psi）；錐孔電壓均為90 V；碰撞能量分別為10 V 和35 V（正負(fù)離子不同模式下碰撞能量有+/-不同）；二級質(zhì)譜碰撞能量為15 V。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

各試驗獨立重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用OriginPro 9.8.5 軟件進行繪圖，Excel 2020 軟件進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 26.0 軟件進行相關(guān)性分析（相關(guān)類型為Pearson）、主成分分析、聚類分析（聚類方法為類間平均連接法、距離類型為Euclidean 平方）和基于單因素方差分析（ANOVA）的統(tǒng)計學(xué)差異檢驗。顯著性差異分析結(jié)果在圖和表中以各數(shù)據(jù)點處小寫字母表示，字母相同則表示差異不顯著（p＞0.05），字母不同則表示差異顯著（p＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅甜菜汁發(fā)酵過程中乳酸菌活菌數(shù)、pH值、總酸及還原糖含量變化

紅甜菜汁發(fā)酵過程中乳酸菌活菌數(shù)、pH 值、總酸及還原糖含量變化如圖1所示。

圖1 紅甜菜汁發(fā)酵過程中活菌數(shù)、pH、總酸及還原糖含量變化Fig.1 Changes of viable bacteria,pH,total acid and reducing sugar content in red beetroot juice during fermentation

由圖1可知，發(fā)酵過程中pH 值、乳酸菌活菌數(shù)、總酸及還原糖含量顯著變化（p＜0.05）。0 h～18 h 發(fā)酵液乳酸菌活菌數(shù)及總酸含量均快速上升，分別由1.03×106CFU/mL（0 h）升至3.39×109CFU/mL（18 h）、4.53 g/kg（0 h）升至14.37 g/kg（18 h），同時活菌數(shù)在18 h 達(dá)到最大值。嗜酸乳桿菌的大量繁殖表明該菌種在發(fā)酵時具有較強的生長能力，Yoon 等[32]對紅甜菜作為嗜酸乳桿菌的潛在生長基質(zhì)進行評估時，發(fā)現(xiàn)該菌種可快速利用紅甜菜汁進行生長代謝和產(chǎn)生乳酸，在30 ℃發(fā)酵48 h 后發(fā)酵液中活菌數(shù)為6.70×108CFU/mL，pH 值由6.3 降至4.5，說明紅甜菜可作為該菌種生長的適宜基質(zhì)。0 h～18 h 發(fā)酵液pH 值及還原糖含量均呈斷崖式下降，分別由5.99（0 h）降至3.85（18 h）、113.48 mg/L（0 h）降至48.98 mg/L（18 h），下降了55.58%和56.84%。這是由于發(fā)酵液中嗜酸乳桿菌消耗大量碳源進行生長代謝致使還原糖含量減少[33]，同時伴隨著發(fā)酵基質(zhì)中有機酸溶出及菌種產(chǎn)生大量有機酸使pH 迅速下降[34]。

18 h～54 h發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)先緩慢下降后逐漸平穩(wěn)，由3.39×109CFU/mL（18 h）降至6.29×108CFU/mL（54 h）。主要原因是發(fā)酵過程中菌種產(chǎn)酸量增加使得發(fā)酵液pH 值較低，與嗜酸乳桿菌最適生長pH 值5.5～6.5 相差較大，在偏酸性環(huán)境下其生長繁殖受到限制導(dǎo)致活菌數(shù)有所下降[35]。隨后，該菌種逐漸對環(huán)境產(chǎn)生耐受使得發(fā)酵后期活菌數(shù)略有上升且逐漸平穩(wěn)。此階段內(nèi)總酸含量增加、還原糖含量減少，分別由14.37 g/kg（18 h）升至18.22 g/kg（54 h）、45.34 mg/L（18 h）降至41.00 mg/L（54 h），分別增加了26.79%、減少了9.57%；pH 值持續(xù)降低，由3.85（18 h）降至3.35（54 h），降低了12.99%。與未發(fā)酵時相比，活菌數(shù)和總酸含量分別增加了6.27×108CFU/mL和302.21%，pH值和還原糖含量分別降低了44.07%和63.87%。李垚等[26]在乳酸菌發(fā)酵紅甜菜的過程中同樣觀察到相似結(jié)果，至發(fā)酵結(jié)束時pH 值呈顯著下降趨勢至3.94，乳酸菌活菌數(shù)呈增加趨勢至1.49×107CFU/mL，總酸含量呈上升趨勢至16.78 g/kg。

2.2 紅甜菜汁發(fā)酵過程中活性成分含量變化

2.2.1 紅甜菜汁發(fā)酵過程中總酚和黃酮質(zhì)量濃度變化

紅甜菜汁發(fā)酵過程中總酚和黃酮含量變化如圖2所示。

圖2 紅甜菜汁發(fā)酵過程中總酚和黃酮質(zhì)量濃度變化Fig.2 Changes of total phenols and flavonoids in red beetroot juice during fermentation

由圖2可知，發(fā)酵過程中總酚和黃酮質(zhì)量濃度顯著變化（p＜0.05），均呈先上升再下降的趨勢。0 h～6 h黃酮質(zhì)量濃度由8.34 mg/L（0 h）降至7.84 mg/L（6 h），下降了6.00%。其原因是發(fā)酵初期體系中O2含量和多酚氧化酶含量較高使得酚類物質(zhì)被氧化[36]，致使黃酮類物質(zhì)部分損失。此外，還與黃酮類物質(zhì)發(fā)生不同程度的水解和聚合作用有關(guān)[37]。6 h～24 h 黃酮質(zhì)量濃度由7.84 mg/L（0 h）升至9.56 mg/L（24 h），增加了21.94%。原因是在酸性環(huán)境中酸水解反應(yīng)將黃酮類聚合物轉(zhuǎn)化為單一的黃酮類物質(zhì)[38]；此外，微生物產(chǎn)生的酶類（如葡糖苷酶）可分解植物細(xì)胞壁，促進黃酮類物質(zhì)的釋放或合成[39]，使黃酮質(zhì)量濃度增加。0 h～18 h 總酚質(zhì)量濃度由1 153.29 mg/L（0 h）升至1 179.03 mg/L（18 h），增加了2.23%，這得益于微生物產(chǎn)生的酶類（如酚酸酯酶）利于結(jié)合酚水解釋放小分子游離酚[40,41]，使總酚質(zhì)量濃度增加。

18 h～54 h 總酚質(zhì)量濃度由1 179.03 mg/L（18 h）降至1 144.71 mg/L（54 h），減少了2.91%。原因是活菌數(shù)降低而減少酶類（如酚酸酯酶）的產(chǎn)生而難以將酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物并釋放新的酚類物質(zhì)[42]，且多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)結(jié)合或吸附，使其質(zhì)量濃度下降[43]。24 h～54 h 黃酮質(zhì)量濃度由9.56 mg/L（24 h）降至8.30 mg/L（54 h），減少了13.18%，這與引起總酚質(zhì)量濃度減少的原因相同。

2.2.2 紅甜菜汁發(fā)酵過程中甜菜色素含量變化

紅甜菜汁發(fā)酵過程中甜菜紅素、甜菜黃素及總甜菜色素含量變化如圖3所示。

圖3 紅甜菜汁發(fā)酵過程中甜菜紅素、甜菜黃素及總甜菜色素含量變化Fig.3 Changes of betacyanin,betaxanthin and total betalain content in red beetroot juice during fermentation

由圖3可知，發(fā)酵過程中色素含量顯著變化（p＜0.05）。0 h～54 h 甜菜黃素含量先下降后趨于穩(wěn)定，由1.23 mg/100 mL（0 h）降至0.70 mg/100 mL（54 h），下降了43.09%。0 h～6 h 其含量由1.23 mg/100 mL（0 h）升至1.33 mg/100 mL（6 h），增加了8.13%。原因是榨汁時紅甜菜組織纖維被機械力破壞，與液體接觸面積增大利于色素釋放；且在低酸環(huán)境中甜菜苷發(fā)生醛亞胺鍵斷裂生成甜菜醛氨酸，該物質(zhì)與氨基酸（或胺）進行分子縮合生成甜菜黃素[44]，使甜菜黃素含量增加。6 h～54 h 觀察到甜菜黃素含量呈下降趨勢，由1.33 mg/100 mL（6 h）降至0.70 mg/100 mL（54 h），減少了47.37%。其原因是受溫度影響，與甜菜紅素相比甜菜黃素對溫度更敏感，同溫度下易降解[45]。

甜菜紅素和總甜菜色素含量在0 h～54 h 均先上升后下降，分別由4.33 mg/100 mL（0 h）升至4.92 mg/100 mL（54 h）、5.56 mg/100 mL（0 h）升至5.61 mg/100 mL（54 h），增加了13.63%和0.90%。0 h～24 h 甜菜紅素和總甜菜色素含量整體呈上升趨勢，分別由4.33 mg/100 mL（0 h）升至5.29 mg/100 mL（24 h）、5.56 mg/100 mL（0 h）升至6.30 mg/100 mL（24 h），增加了22.17%和13.30%。因甜菜色素是一種水溶性色素，發(fā)酵過程中借助水的浸泡作用使色素溶出；且甜菜苷在酸性環(huán)境中會代謝產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的甜菜紅素，使甜菜紅素含量上升[46]。

24 h～54 h 觀察到甜菜紅素及總甜菜色素含量均為下降趨勢，分別由5.29 mg/100 mL（24 h）降至4.92 mg/100 mL（54 h）和6.30 mg/100 mL（24 h）降至5.61 mg/100 mL（54 h），減少了7.00%和10.95%。原因是在30 ℃的發(fā)酵溫度下受發(fā)酵容器中O2含量和降解酶[47]（如β-葡萄糖苷酶）的影響，甜菜苷在易發(fā)生化學(xué)變化位置發(fā)生脫糖基化、脫羧、脫氫作用等化學(xué)變化[46]加速代謝使其含量減少。此外，乳酸菌可將紅甜菜汁中的β-葡萄糖苷作為碳源進行生長代謝從而減少甜菜苷含量[48]。值得注意的是，甜菜紅素與總甜菜色素含量變化趨勢相似，原因是紅甜菜中甜菜紅素含量要遠(yuǎn)多于甜菜黃素含量，使得以甜菜紅素發(fā)生的化學(xué)變化占主導(dǎo)地位。Swaicki 等[49]在紅甜菜發(fā)酵過程中也觀察到甜菜紅素含量與未發(fā)酵時相比下降了30%～50%，其下降原因與上述原因相同。

2.3 基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS 對發(fā)酵液中甜菜色素組成及相對含量分析

2.3.1 紅甜菜汁發(fā)酵液中甜菜色素組成定性分析及代謝途徑分析

根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)[50-52]對發(fā)酵0 h～54 h 共10個樣品中的甜菜色素組成進行定性分析，在[M+H]+條件下所有樣品共鑒定出12 種甜菜色素，詳見表1。

如表1所示，12 種甜菜色素分別為2 種甜菜色素前體（Betalamic Acid、Cyclo-DOPA）、6 種甜菜紅素（ Betanin、Betanidin、17-Decarboxy-Betanidin、2-Decarboxy-Neobetanin、2-Decarboxy-2,3-Dehydro-Neobetanin、6ˊ-O-Feruloyl-Betanin）、4 種甜菜黃素（Indicaxanthin、Vulgaxanthin I、Miraxanthin V、Vulgaxanthin IV）。

表1 甜菜色素組成分析Table 1 Analysis of constituents of betalain

紅甜菜汁所含甜菜色素在發(fā)酵過程中受發(fā)酵溫度、光照、氧氣、pH 值、酶等綜合因素影響產(chǎn)生以甜菜苷為主的代謝作用[53,54]，具體的代謝途徑和顏色變化見圖4。

由圖4可知甜菜苷（Betanin）的代謝途徑及其產(chǎn)物，鑒定出的12 種甜菜色素有7 種是由甜菜苷（Betanin）在代謝過程中產(chǎn)生，分別為Betanidin、17-Decarboxy-Betanidin、2-Decarboxy-Neobetanin、2-Decarboxy-2,3-Dehydro-Neobetanin、6ˊ-O-Feruloyl-Betanin 和Betalamic Acid、Cyclo-DOPA。

圖4 甜菜苷的代謝途徑及其代謝產(chǎn)物顏色變化Fig.4 Metabolic pathway of beet glycoside and color change of its metabolites

2.3.2 紅甜菜汁發(fā)酵液中甜菜色素組成相對定量分析

根據(jù)甜菜色素各成分質(zhì)譜峰進行峰面積積分并進行積分校正，計算甜菜色素各成分其相對含量，詳見表2。

由表2可知，與未發(fā)酵時相比，在發(fā)酵第6 小時和 24 小時共生成3 種新的甜菜紅素，分別為17-Decarboxy-Betanidin（6 h）、2-Decarboxy-Neobetanin（6 h）和6ˊ-O-Feruloyl-Betanin（24 h）。發(fā)酵過程中12 種甜菜色素成分按照上調(diào)和下調(diào)被分為2 類。第1類中共有7 種甜菜色素成分上調(diào)，即相對含量增加，分別為 5 種甜菜紅素（Betanin、Betanidin、17-Decarboxy-Betanidin、2-Decarboxy-Neobetanin、6ˊ-O-Feruloyl-Betanin）、甜菜黃素（Vulgaxanthin I）和甜菜色素前體物質(zhì)（Betalamic Acid），增加的甜菜色素成分占12 種甜菜色素成分的58.33%；第2 類中共有5種成分下調(diào)，即相對含量降低，分別為甜菜紅素（2-Decarboxy-2,3-Dehydro-Neobetanin）、3 種甜菜黃素（Indicaxanthin、Miraxanthin V、Vulgaxanthin Ⅳ）和甜菜色素前體物質(zhì)（Cyclo-DOPA），降低的甜菜色素成分占12 種甜菜色素成分的41.67%。由此可見，在發(fā)酵過程中甜菜色素各成分相對含量變化以甜菜紅素上調(diào)為主。

表2 發(fā)酵過程中甜菜色素各成分相對含量Table 2 Relative content of betalain components in fermentation process

2.4 紅甜菜汁發(fā)酵過程中抗氧化能力變化

紅甜菜汁發(fā)酵液抗氧化能力如圖5所示。由圖5可知，發(fā)酵的紅甜菜汁與未發(fā)酵樣品相比，抗氧化能力顯著提升（p＜0.05），隨著發(fā)酵進行抗氧化能力整體呈上升趨勢?！2-清除率在發(fā)酵過程中顯著上升（p＜0.05），由42.90%（0 h）增至55.40%（54 h），增加了29.13%；在18 h 達(dá)到了最高點60.10%，與0 h 相比增加了40.09%?！H 清除率在發(fā)酵過程中顯著提升（p＜0.05），由38.50%（0 h）增至75.60%（54 h），增加了96.36%，且在54 h 達(dá)到了清除率最高點。ABTS+·清除率在發(fā)酵過程中顯著提升（p＜0.05），由43.10%（0 h）增至76.50%（54 h），增加了77.49%，且在54 h 達(dá)到了清除率最高點。相似的是，Sawicki 等[44]在發(fā)酵紅甜菜48 h 時發(fā)現(xiàn)ABTS+·清除率和DPPH·清除率與發(fā)酵初期相比分別提升0.16 和0.15 μmol Trolox/mL；De?irmencio?lu 等[55]對比了紅甜菜鮮汁與紅甜菜汁乳酸菌發(fā)酵液的抗氧化能力后得出同樣結(jié)論，經(jīng)發(fā)酵的紅甜菜汁ABTS+·清除率相比紅甜菜鮮汁顯著（p＜0.05）提升9.00%，具有更強的自由基清除能力。以上分析均表明經(jīng)發(fā)酵的紅甜菜汁具有較高的抗氧化能力并明顯高于未發(fā)酵樣品，且以發(fā)酵為技術(shù)手段可顯著提升并維持紅甜菜的抗氧化能力。

圖5 紅甜菜汁發(fā)酵液自由基清除能力Fig.5 Free radical scavenging ability of red beetroot juice fermentation broth

2.5 紅甜菜汁發(fā)酵過程中酶抑制能力變化

紅甜菜汁發(fā)酵液對ACE 和AChE 抑制能力如圖6所示。如圖6可知，與未發(fā)酵樣品相比，發(fā)酵液酶抑制能力顯著提升（p＜0.05）。隨著發(fā)酵的進行酶抑制能力呈先上升后逐漸下降、最后趨于穩(wěn)定的趨勢。AChE抑制率在發(fā)酵過程中顯著增加（p＜0.05），由38.60%（0 h）增至61.43%（54 h），增加了59.15%；在24 h達(dá)到了抑制率最高點77.18%，與0 h 相比增加了99.95%。ACE 抑制率在發(fā)酵過程中顯著提升（p＜0.05），由46.03%（0 h）增加至62.31%（54 h）增加了35.37%；在24 h 達(dá)到了清除率最高點70.38%，與0 h 相比增加了52.90%。雖然24～54 h 酶抑制能力有所下降，但仍高于未發(fā)酵樣品。Sawicki 等[56]經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)以發(fā)酵紅甜菜汁為主的處理方式其ACE 抑制率顯著優(yōu)于未發(fā)酵、真空切片和煮沸等加工方式，經(jīng)發(fā)酵后其ACE 抑制率顯著（p＜0.05）增加了31.00%。以上分析表明，紅甜菜汁發(fā)酵液不僅具有較強的AChE 抑制能力，還是一種具有中樞作用的ACE 抑制劑，即可通過增強AChE和ACE抑制能力延緩AD所引起的神經(jīng)退行性變[57,58]。

圖6 紅甜菜汁發(fā)酵液血管緊張素轉(zhuǎn)化酶和乙酰膽堿酯酶抑制能力Fig.6 Inhibition of angiotensin converting enzyme and acetylcholinesterase in red beetroot juice fermentation broth

2.6 活性物質(zhì)與抗氧化能力、酶抑制能力相關(guān)性分析

2.6.1 甜菜色素、總酚、黃酮與抗氧化能力、酶抑制能力相關(guān)性分析

為探究發(fā)酵液抗氧化能力、酶抑制能力與活性物質(zhì)含量的關(guān)系，將上述功能指標(biāo)與甜菜紅素、甜菜黃素和總酚、黃酮含量進行Pearson 相關(guān)性分析，分析結(jié)果見表3。

由表3可知，甜菜紅素和甜菜黃素含量分別與上述功能指標(biāo)呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01）和不同程度的負(fù)相關(guān)。雖然總酚、黃酮含量與上述功能指標(biāo)均呈極低負(fù)相關(guān)或呈正相關(guān)（p＞0.05），但酚類物質(zhì)同樣具有抗氧化能力[59]，這表明上述功能應(yīng)是由所有物質(zhì)共同發(fā)揮作用。上述抗氧化能力與甜菜紅素呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），與另外3 種活性物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)或正相關(guān)不顯著，說明甜菜紅素是主要的抗氧化活性成分。同樣的，肖默艷等[60]研究了紅心火龍果果肉中甜紅色素、總酚、黃酮類物質(zhì)與其抗氧化能力的相關(guān)性，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)甜菜紅素在總抗氧化、清除DPPH·、NO2-·、ABTS+·和·OH 自由基能力時發(fā)揮了主要作用，與上述自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)（r=0.936～0.955）。其原因是甜菜紅素主要以糖苷形式存在，經(jīng)誘導(dǎo)之后能產(chǎn)生泛醌還原酶，其酚基和環(huán)胺基均為電子供體，可參與生物體的氧化還原反應(yīng)和自由基的清除過程[61]。

表3 甜菜黃素、甜菜紅素和總酚、黃酮含量與抗氧化能力、酶抑制能力相關(guān)性Table 3 Correlation between the contents of betaxanthins,betacyanins,total phenols,flavonoids and antioxidant capacity and enzyme inhibition capacity

2.6.2 甜菜色素各成分與抗氧化能力、酶抑制能力相關(guān)性分析

為深入探究甜菜色素與抗氧化能力、酶抑制能力的關(guān)系，對發(fā)酵液中甜菜色素各成分相對含量與功能指標(biāo)進行相關(guān)性分析，分析結(jié)果見表4。

表4 甜菜色素各成分相對含量與抗氧化能力、酶抑制能力相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of betalain with antioxidant capacity and enzyme inhibition capacity

由表4可知，抗氧化能力和酶抑制能力與甜菜紅素（Betanin、Betanidin、17-Decarboxy-Betanidin、2-Decarboxy-Neobetanin、6ˊ-O-Feruloyl-Betanin）、甜菜黃素（Vulgaxanthin I）和甜菜色素前體物質(zhì)（Betalamic Acid）均呈現(xiàn)不同程度的正向相關(guān)性。其中，甜菜紅素是以Betanin 和Betanidin 為清除自由基的主要基團，其功能性基團同時作為電子供體和電子受體，是氧化還原的中間體[62]。相似的是，肖默艷等[60]在研究紅心火龍果果肉中甜紅色素與其抗氧化能力關(guān)系的試驗中，經(jīng)液質(zhì)鑒定出果肉中甜菜紅素組分有Betanin、Isobetanin、Phyllocactin 和Isophyllocactin，其中Betanin是清除自由基的主要成分。此外，Sawicki 等[56]研究了紅甜菜汁發(fā)酵液中甜菜色素與ACE 抑制能力的關(guān)系，經(jīng)液質(zhì)分析鑒定后發(fā)現(xiàn) Betanin、Betanidin、6ˊ-O-Feruloyl-Betanin、2-Decarboxy-Neobetanin 是提升ACE 抑制能力的主要物質(zhì)，與本試驗分析結(jié)果相同。

2.7 甜菜色素各成分與抗氧化能力、酶抑制能力的主成分分析

為消除指標(biāo)間的信息重疊和多重共線性，并對相關(guān)性分析結(jié)果進行補充和解釋，將甜菜色素12 個成分、3 種抗氧化能力和2 種酶抑制能力共17 個指標(biāo)經(jīng)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化后進行主成分分析，選取特征值＞1 且各主成分總方差總貢獻(xiàn)率≥85%[63]的原則選擇主成分，分析結(jié)果如表5和圖7所示。

表5 主成分的特征值、貢獻(xiàn)率和累計貢獻(xiàn)率Table 5 The eigenvalue,contribution rate and the cumulative contribution rate of principal components

由圖7a 可知，前3 個主成分的特征值大于1，由表5可知前3 個主成分（分別用PC1、PC2、PC3 表示）的方差貢獻(xiàn)率累積達(dá)到90.63%，可保留90.63%的原始信息。由表5和圖7b 可知，第一主成分方差貢獻(xiàn)率為68.11%，主要包含3 種抗氧化能力、2 種酶抑制能力和甜菜色素（Betanin、Betanidin、17-Decarboxy-Betanidin、2-Decarboxy-Neobetanin、Betalamic Acid、Vulgaxanthin I、6ˊ-O-Feruloyl-Betanin）且12 個指標(biāo)且呈正相關(guān)；第二主成分的方差貢獻(xiàn)率為13.77%，主要包含·OH 清除率、ABTS+· 清除率和甜菜色素（ Betanin、2-Decarboxy-Neobetanin）且4 個指標(biāo)且呈正相關(guān)，還包含·O2-清除率、2 種酶抑制能力和甜菜色素（Miraxanthin V、cyclo-DOPA）且呈負(fù)相關(guān)；第三主成分的方差貢獻(xiàn)率為8.75%，主要包含·O2-清除率、2種酶抑制能力和甜菜色素Vulgaxanthin I 且呈正相關(guān)，還包含·OH 清除率、ABTS+·清除率和甜菜色素（Indicaxanthin、Miraxanthin V、Vulgaxanthin IV）且5個指標(biāo)且呈負(fù)相關(guān)。由主成分分析可知，主要的活性物質(zhì)為Betanin、Betanidin、17-Decarboxy-Betanidin、2-Decarboxy-Neobetanin、Betalamic Acid、Vulgaxanthin I、6ˊ-O-Feruloyl-Betanin，且主成分分析結(jié)果與相關(guān)性分析結(jié)果基本一致。

圖7 碎石圖(a)和主成分分析圖(b)Fig.7 Scree plot (a) and Principal component analysis diagram(b)

2.8 甜菜色素各成分與抗氧化能力、酶抑制能力的聚類分析

紅甜菜汁發(fā)酵過程中其抗氧化和酶抑制能力呈動態(tài)變化，為掌握發(fā)酵過程中功能性指標(biāo)變化、補充相關(guān)性分析和主成分分析結(jié)果，遂進行聚類分析。數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后采用聚類方法為類間平均連接法、距離類型為Euclidean 平方，對10 個發(fā)酵時間節(jié)點樣品的聚類采用Q 型聚類、對17 個指標(biāo)的聚類采用R 型聚類，結(jié)果如圖8所示。

圖8 不同發(fā)酵時間節(jié)點的Q 型聚類分析(a)和各指標(biāo)間的R 型聚類分析(b)譜系圖Fig.8 Q-type cluster analysis (a) of different fermentation time and R-type cluster analysis among indicators (b) pedigree

由圖8a 所示Q 型聚類分析可知，10 個發(fā)酵時間節(jié)點可聚為3 類，代表發(fā)酵過程中抗氧化能力和酶抑制能力的變化趨勢。第1 類聚集了0 h～18 h 4 個時間點，聚集了發(fā)酵過程初期（緩慢增長期）。與未發(fā)酵時相比，此時發(fā)酵液抗氧化能力和酶抑制能力得到提升。從發(fā)酵全過程來看，此階段內(nèi)發(fā)酵液抗氧化能力和酶抑制能力相對較低，處于緩慢上升階段。第2 類聚集了24 h～42 h 4 個時間點，聚集了發(fā)酵過程中期（顯著變化期），與未發(fā)酵時相比和發(fā)酵全過程來看，此階段內(nèi)發(fā)酵液抗氧化能力處于上升期，而酶抑制能力處于先上升后下降的動態(tài)變化趨勢。第3 類聚集了48 h～54 h 2 個時間點，聚集了發(fā)酵過程末期（平緩期）。與未發(fā)酵時相比和發(fā)酵全過程來看，此階段內(nèi)發(fā)酵液抗氧化能力處于整體處于上升期，而酶抑制能力處于先下降后穩(wěn)定的平緩趨勢。經(jīng)Q 型聚類分析可知，各階段內(nèi)發(fā)酵液抗氧化能力和酶抑制能力均有不同程度的提升。

由圖8b 所示R 型聚類分析可知，17 個指標(biāo)可聚為3 類，代表發(fā)酵過程中甜菜色素各成分與抗氧化能力、酶抑制能力的相關(guān)程度。第1 類聚集了甜菜色素（Betain、2-Decarboxy-Neobetanin）和·OH 清除率、ABTS+·清除率，且呈正相關(guān)。第2 類聚集了甜菜色素（Betanidin、17-Decarboxy-Betanidin、Vulgaxanthin I、6ˊ-O-Feruloyl-Betanin、Betalamic Acid）和·O2-清除率、2 種酶抑制能力，且呈正相關(guān)。第3 類聚集了剩余部分的甜菜色素成分，且與抗氧化能力和酶抑制能力呈負(fù)相關(guān)。經(jīng)R 型聚類分析可知，在聚為3 類的情況下，分析結(jié)果與相關(guān)性分析和主成分分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究選用的嗜酸乳桿菌LA-5在發(fā)酵末期活菌數(shù)在108CFU/mL 并保持穩(wěn)定，這有利于發(fā)揮其健康益處。發(fā)酵過程中pH 值和還原糖含量均顯著降低（p＜0.05），活菌數(shù)、甜菜紅素含量均顯著增加（p＜0.05），甜菜黃素和黃酮含量顯著下降（p＜0.05），總甜菜色素和總酚含量無顯著差異（p＞0.05）。各時間段發(fā)酵液中共鑒定出12 種甜菜色素，包括6 種甜菜紅素、4 種甜菜黃素和2 種甜菜色素前體；其中有3 種甜菜紅素是在發(fā)酵過程中新產(chǎn)生的，這表明益生菌發(fā)酵使甜菜色素成分更多樣。發(fā)酵后自由基（·O2-、·OH、ABTS+·）清除能力和酶（AChE、ACE）抑制能力顯著提升（p＜0.05），說明以發(fā)酵為技術(shù)手段發(fā)酵紅甜菜可減少氧化應(yīng)激和增強上述酶抑制能力從而對AD 病情起到緩解作用。

相關(guān)性分析表明，自由基（·O2-、·OH、ABTS+·）清除能力和酶（AChE、ACE）抑制能力的增強是由甜菜色素、總酚和黃酮共同作用的結(jié)果，且上述指標(biāo)與5種甜菜紅素（ Betanin、Betanidin、17-Decarboxy-Betanidin、2-Decarboxy-Neobetanin、6ˊ-O-Feruloyl-Betanin）、甜菜黃素（Vulgaxanthin I）和甜菜色素前體物質(zhì)（Betalamic Acid）含量呈正相關(guān)，說明甜菜紅素是主要的功能性成分。主成分分析表明，活性成分和功能指標(biāo)可轉(zhuǎn)化為3 個主成分，可保留全部信息的90.63%。Q 型聚類分析表明可將發(fā)酵過程聚為3 類，分別為緩慢增長期、顯著變化期和平緩期；R 型聚類分析表明活性成分和功能指標(biāo)可聚為3類，各個分類所涵蓋信息與相關(guān)性分析結(jié)果一致。

實驗表明經(jīng)嗜酸乳桿菌LA-5發(fā)酵的紅甜菜汁是一種優(yōu)質(zhì)的自由基（·O2-、·OH、ABTS+·）清除劑和酶（AChE、ACE）抑制劑，對AD 具有一定的防治作用，具有一定的開發(fā)空間和研究價值。未來的研究內(nèi)容包括乳酸菌發(fā)酵紅甜菜汁飲品制備和小膠質(zhì)細(xì)胞試驗，此系列研究旨在為乳酸菌發(fā)酵紅甜菜及防治AD 提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。