劉華彬 王 玲 杜展顏 王 松

（安徽科技學院生命與健康科學學院 安徽鳳陽 233100）

植物學實驗技術是開展植物生長發(fā)育相關研究的重要工具。在遺傳學研究中，植物有性雜交技術被廣泛應用于科學研究和生產實踐中。植物的雜種優(yōu)勢是自然界普遍存在的生物學現(xiàn)象，即利用具有不同遺傳組成（基因組）的同種或不同種生物個體，通過雜交以獲得具有父本和母本優(yōu)勢性狀的子代個體。在生物遺傳育種、農業(yè)生產及遺傳分析中具有重要意義。

擬南芥（Arabidopsis thaliana）作為經典的模式植物，具備模式生物的重要特征，例如，生長周期較短、結實率高、基因組小、易于培養(yǎng)與轉化等，是第1種完成全基因組測序的植物[1]，因此，被廣泛應用于科學研究之中。在遺傳學實驗中，利用擬南芥生長周期短的特征，可在較短的時間內獲得所需的實驗材料。植物有性雜交技術是經典的生物學實驗技術之一，是研究植物的遺傳機制和作物遺傳育種的重要工具。

1 實驗原理

植物雜交是基因重新組合的過程，通過有性雜交將親本雙方控制不同性狀的基因整合至雜交子一代個體中，從而使子代獲得雙親的優(yōu)良性狀，在植物個體的生長、產量、品質、抗性和適應環(huán)境能力等方面表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢的特點，最終獲得符合生產需求的新品種。植物雜交也是植物進行有性生殖的過程，雙受精是被子植物所特有的生殖現(xiàn)象[2]。在這一過程中，成熟的花粉通過昆蟲、風力或其他外界條件影響，傳送至柱頭上并與之相互識別進而完成授粉[3]。在一些自然授粉效率較低的植物中或在作物遺傳育種中，常需要進行人工授粉，即通過人工操作將植物的花粉傳送至柱頭上以幫助其授粉[4-7]。在植物遺傳分析和作物育種過程中，通過有目的地選擇親本進行雜交實驗以實現(xiàn)方向性改變植物的遺傳特征[6-7]?；ǚ圩鳛楦副具z傳信息的攜帶者，授粉成功后形成的子一代繼承了雙親的遺傳性狀[8-10]。在植物雜交育種實驗中，可通過表型觀察或遺傳信息鑒定F1代雜合植株。

2 教學安排與實驗設計

2.1 教學目的 掌握種子植物的人工授粉技術，了解種子的形成過程；掌握雜種植株鑒定技術。

2.2 教學重點與難點

1）重點：父本和母本的選擇，人工授粉。

2）難點：去雄操作，F(xiàn)1雜合植株鑒定。

2.3 實驗設計

2.3.1 實驗材料準備

植物材料：生長5～6周的擬南芥植株，處于旺盛的開花期。

實驗器具：正置熒光顯微鏡、光照培養(yǎng)箱、雜交鑷子、保鮮膜。

2.3.2 實驗內容 以突變體擬南芥（mutant，m）為母本，攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標簽的轉基因擬南芥（A-GFP）為父本，進行雜交實驗。

2.4 教學安排

本實驗共分為5個階段：1）植物的培養(yǎng)（實驗教師完成）；2）父本和母本的選擇，以及人工去雄（2學時）；3）人工雜交（2學時）；4）實驗結果觀察（2學時）；5）F1雜合植株鑒定（2學時）。

實驗中2～3位學生為一組，每位組員都要進行一次完整的實驗操作過程，積極分享和討論實驗中的技術要點，共同觀察實驗結果，并對失敗的實驗進行分析和總結。

3 實驗過程及結果觀察

3.1 實驗材料的準備 培養(yǎng)5～6周的擬南芥，處于旺盛的開花期（圖1）。

圖1 實驗材料和器具的準備

3.2 父本、母本的選擇 父本選取開花旺盛的13～14期的擬南芥花[11]，花瓣完全舒展開，呈十字形（圖2A）。每朵花中包含6枚雄蕊，4長2短，雄蕊位于雌蕊的周圍、花瓣的內部，花藥呈黃色，表明此時期的花粉已成熟。若雄蕊已成熟，而雌蕊尚未發(fā)育或雌蕊狀態(tài)不佳，可先將取下的花藥置于保鮮袋或無菌的離心管中，4℃低溫冰箱內密封保存3～5 d。待母本花期適宜時，選取生長狀態(tài)較好的花蕾進行去雄，然后即可進行人工授粉。

母本的選擇應確保雌蕊尚未進行授粉。選取未開放的9～12期的花[12]，花蕾較多的分枝或主枝，此時，整朵花被白色的花瓣和綠色的萼片緊緊包住，在花的頂端只露出一點白色（圖2B）。用75%乙醇對鑷子進行消毒，將選定的母本花蕾進行人工去雄，并用保鮮膜包裹，光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d，等待柱頭長大呈現(xiàn)毛茸茸的狀態(tài)（圖2C）。

圖2 擬南芥人工授粉

3.3 擬南芥有性雜交 待雌蕊的柱頭呈現(xiàn)肉眼可見毛茸茸的狀態(tài)（圖2C），此時進行授粉的成功率顯著提高。首先，用75%乙醇對鑷子進行消毒；用消過毒的鑷子夾住成熟雄蕊的花絲，將花藥在雌蕊的柱頭上來回摩擦、涂抹幾次（圖2D）。人工授粉后，用保鮮膜將雌蕊套袋，防止外界的花粉落到柱頭上干擾實驗。授粉時間一般在上午9∶00—11∶00之間為佳。

在對雜交的父本、母本進行標記時，母本（雌蕊）一般用F（female）或♀表示，父本（雄蕊）一般用M（male）或♂表示。例如，突變體（mutant）作母本，轉基因擬南芥A-GFP作父本，則標簽上應記錄為m（F）×A-GFP（M）-F1，F(xiàn)1代表雜交產生的第1代種子。

3.4 雜交后實驗觀察 人工授粉后1～2 d，觀察柱頭的生長情況。如果柱頭長大，花柱伸長，則表明雜交成功；如果柱頭未發(fā)育長大，則說明雜交失?。▓D2E）。此時，要仔細觀察柱頭的形態(tài)，如果柱頭仍為毛茸茸的狀態(tài)，可再進行一次人工授粉；如果柱頭出現(xiàn)萎蔫或干枯，則表明雜交失敗，需要重新進行實驗。將植株置于光照培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)，一般3～7 d，角果即可顯著伸長（圖2E）。待種子成熟后即可收取F1種子，用于后續(xù)的實驗。

3.5 F1雜合植株鑒定 F1雜合植株繼承了雙親的遺傳信息，因此，雜合植株表現(xiàn)出親本的遺傳性狀。F1代雜合植株的鑒定，只需鑒定F1植株基因組是否含有父本的遺傳信息即可，這主要是由于來自父本的花粉傳粉至母本雌蕊的柱頭上，并成功完成授粉，則發(fā)育形成的種子及其F1代植株均含有來自于父本的遺傳信息。因此，可對F1代植株是否包含來自于父本的遺傳信息或表現(xiàn)出父本的遺傳性狀進行鑒定。

綠色熒光蛋白編碼基因是一種廣泛應用于生物學研究中的標記基因，GFP在波段為395～490 nm的激發(fā)光作用下發(fā)出獨特的綠色熒光[13-14]。在植物學研究和作物雜交等相關實驗中，?？衫肎FP作為父本遺傳信息的標記基因[14-15]。在對F1代雜合植株鑒定時只需對其進行GFP熒光觀察，如果F1代植株在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光則表明其為雜合植株；如果觀察不到綠色熒光則表明雜交失敗。

本實驗在對F1植株進行鑒定時，取雜交成功后的成熟種子，經消毒后在MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)并豎直培養(yǎng)7 d，待植物根系長至1.5～2.0 cm左右，將植物幼苗置于熒光顯微鏡下使用GFP激發(fā)光激發(fā)，進行觀察。實驗選用mutant（m）作為母本（無熒光標記基因，圖3A和3B），A-GFP作為父本的標記基因（圖3C），F(xiàn)1代（m×A-GFP）植株經過熒光顯微鏡觀察到綠色熒光（圖3D），表明雜交成功，即F1為雜合植株。

圖3 F1代雜合植株鑒定

4 討論

4.1 教學實驗開設的意義 擬南芥作為科學研究中的模式植物，被稱為植物界的“果蠅”。了解擬南芥植物的生長習性和繁殖器官的形態(tài)結構，掌握科學研究中的基本實驗技能，是培養(yǎng)大學生科研興趣和動手能力最好的實驗教學。通過該實驗課程的學習，可使學生了解植物培養(yǎng)的基本方法、掌握雜交育種的基本原理和實驗技術。

4.2 實驗課程安排與教學計劃 該實驗技術成熟、穩(wěn)定，結果直觀可靠且易獲得。大多數(shù)高校實驗室都具有本實驗使用的實驗儀器，例如，正置熒光顯微鏡、植物光照培養(yǎng)箱或培養(yǎng)室等，具備開設本實驗的條件。

本實驗課程作為遺傳育種學實驗課或本科生科研專題訓練項目，建議4次實驗課（8學時）為宜；由實驗教師完成植物的培養(yǎng)，學生主要進行去雄、雜交與鑒定實驗。

4.3 實驗教學過程中注意事項 本實驗成功率的高低在于對母本的選擇及人工去雄的操作技巧。母本選擇尚未授粉的雌蕊，此時的花蕾處于發(fā)育早期，在花蕾的頂端剛好露出一點白色花瓣。在去雄操作中，一定注意動作的輕緩，不要觸碰或弄傷雌蕊。在雜交過程中，鑷子要保持干凈，每進行一次雜交實驗，都要清潔鑷子尖端殘存的花粉粒，以免其他花粉粒落到柱頭上干擾實驗結果。

4.4 本實驗課在高校教學中的應用 該實驗是認識植物生長繁育規(guī)律、掌握植物基本實驗技能的實踐課。要求教師將完整的知識體系、實驗原理、操作技巧、注意事項詳細地展現(xiàn)給學生，讓學生既能領會到植物世界的奧妙，又能學到科學知識和實驗技能。經過本實驗課的學習，學生既能了解植物生長發(fā)育和繁育后代的生命過程，又能掌握學科理論知識、實驗設計技巧和基本的實驗技術。