李宇剛

（山東省威海市環(huán)翠區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東 威海 264200）

0 引言

血凝抑制試驗(yàn)中主要使用4單位抗原（4HAU）作為診斷液，4HAU的配置自然就成為了整個(gè)試驗(yàn)中的重要環(huán)節(jié)之一，并且精確性對(duì)血凝抑制試驗(yàn)的結(jié)果會(huì)造成直接影響，往往4HAU的濃度與HI抗體效價(jià)成反比。使用血凝試驗(yàn)檢測的準(zhǔn)確性會(huì)對(duì)4HAU配置的準(zhǔn)確性造成直接的影響，為避免血凝試驗(yàn)檢測的不準(zhǔn)確，需要進(jìn)一步使用回歸檢驗(yàn)試驗(yàn)對(duì)血凝試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。也正是因?yàn)楝F(xiàn)存的檢測方式需要對(duì)血凝試驗(yàn)、回歸檢測試驗(yàn)進(jìn)行多次驗(yàn)證才造成診斷禽流感、新城疫的效率低下。

1 目的

希望通過本次研究設(shè)計(jì)一種禽流感和新城疫的血凝試驗(yàn)檢測方法，有效避免現(xiàn)如今檢測技術(shù)存在的不足，不再使用常規(guī)的血凝試驗(yàn)方式，改用回歸檢測試驗(yàn)的方式在觀察血凝效價(jià)的基礎(chǔ)上對(duì)禽流感、新城疫血凝效價(jià)進(jìn)行計(jì)算，并且最終獲得的結(jié)果是完全一致的[1]。實(shí)踐證明，使用本次設(shè)計(jì)的禽流感和新城疫的血凝試驗(yàn)檢測方法可以提升禽流感、新城疫血凝試驗(yàn)的診斷效率，并且成本更低、時(shí)間更短。

2 技術(shù)方案

2.1 禽流感和新城疫血凝試驗(yàn)檢測方法步驟

（1）將禽流感血凝試驗(yàn)的參照血凝效價(jià)設(shè)計(jì)為9log2，將新城疫血凝試驗(yàn)的參照血凝效價(jià)設(shè)計(jì)為10log2。

（2）配置禽流感4HAU抗原時(shí)測參考《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》，血凝效價(jià)為9log2，新城疫4HAU抗原血凝效價(jià)為10log2，搖勻后開始回歸檢測試驗(yàn)，對(duì)紅細(xì)胞凝集孔數(shù)量進(jìn)行觀察。

（3）計(jì)算禽流感血凝效價(jià)：以上一步得出的回歸檢測實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果作為依據(jù)，在紅細(xì)胞凝集孔數(shù)量大于2的X個(gè)時(shí)，此時(shí)的禽流感血凝效價(jià)為（9＋X）log2。在在紅細(xì)胞凝集孔數(shù)量小于2的X個(gè)時(shí)，此時(shí)的禽流感血凝效價(jià)為（9－X）log2，X取值為0、1、2。

（4）新城疫血凝效價(jià)計(jì)算：同樣結(jié)合回歸檢測試驗(yàn)結(jié)果，在紅細(xì)胞凝集孔數(shù)量大于2的X個(gè)時(shí)，此時(shí)新城疫血凝效價(jià)為（10＋X）log2。在在紅細(xì)胞凝集孔數(shù)量小于2的X個(gè)時(shí)，此時(shí)新城疫血凝效價(jià)為（10－X）log2，X取值為0、1、2。

2.2 回歸檢測試驗(yàn)步驟

（1）使用微量移液器在96孔V型微量反應(yīng)板的1～4中加入0.025 mL PBS，形成4個(gè)平行樣本并更換滴頭。

（2）吸取經(jīng)過均勻混合的4HAU抗原0.025 mL加入第1孔，再次搖勻。從第1孔中吸取0.025 mL滴入第2孔中，再次搖勻，從第2孔中同樣吸取0.025mL加入到第3孔中，一直到第4孔放棄，并更換滴頭。

（3）將體積分?jǐn)?shù)1%的雞紅細(xì)胞懸液或者也可使用體積分?jǐn)?shù)為0.75%的雞醛化紅細(xì)胞懸液0.025 mL加入到第1孔中。

（4）充分搖勻后，在20～25 ℃室溫環(huán)境下靜置20min以后進(jìn)行觀察，傾斜放置反應(yīng)板，對(duì)紅細(xì)胞凝集孔的數(shù)量進(jìn)行觀察并記錄[2]。

3 實(shí)施方法

3.1 制備體積分?jǐn)?shù)1%的雞紅細(xì)胞懸液

（1）抗凝劑使用阿氏液，選擇使用大于等于3只的SPF公雞或者是沒有禽流感、新城疫抗體的雞抗凝血液，置于離心管中，并在離心管中加入體積3-4倍的PBS充分搖勻，離心速度控制在2 000 r/min，時(shí)間持續(xù)5～10 min，離心后，血漿、白細(xì)胞層都會(huì)被去除。重復(fù)上述步驟并反復(fù)清洗血漿、白細(xì)胞層3次，再次以離心速度2 000 r/min，時(shí)間持續(xù)10 min[3]。完成后吸取壓積紅細(xì)胞，并使用PBS配置體積分?jǐn)?shù)為1%的懸液，在恒溫4 ℃的條件下保存。

（2）配置阿式液：選擇2.05 g葡萄糖、0.8 g檸檬酸鈉、0.055 g檸檬酸、0.42 g鹽，將這些物質(zhì)加入到100 mL蒸餾水中，經(jīng)過散熱溶解后調(diào)整至pH為6.1，在氣壓6KPa條件下開始高溫滅菌持續(xù)15 min，完成后在恒溫4℃的條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 配備體積分?jǐn)?shù)為0.75%的雞醛化紅細(xì)胞懸液

（1）使用0.1 mol/L PBS液充分清洗新鮮紅細(xì)胞5次，離心速度控制在3 000 r/min，時(shí)間持續(xù)4 min，使用壓縮紅細(xì)胞體積10倍的PBS液最后清洗，離心速度控制在3 000 r/min，時(shí)間持續(xù)10 min，去除上清液。

（2）以沉積紅細(xì)胞8倍加入體積分?jǐn)?shù)36%甲醛溶液并且于恒溫4 ℃、體積分?jǐn)?shù)為36%甲醛溶液充分混合均勻，恒溫4 ℃條件下保持24 h，并在24 h期間需要不斷振蕩。

（3）取出后，以沉積紅細(xì)胞1倍的體積作為標(biāo)準(zhǔn)，添加2倍體積分?jǐn)?shù)為30%的甲醛溶液在恒溫4℃條件下進(jìn)行，保持24 h，再使用PBS溶液反復(fù)沖洗5次，制備體積分?jǐn)?shù)為0.75%的醛化紅細(xì)胞液，隨后加入到體積分?jǐn)?shù)為0.1%的疊氮鈉中，在恒溫4 ℃的條件下保存。

3.3 檢測禽流感血凝試驗(yàn)的方法

（1）材料。設(shè)備：96孔V型微量反應(yīng)板、帶有滴頭的微量移液器、一次性移液槽；溶液：體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液或者是體積分?jǐn)?shù)為0.75%的雞醛化紅細(xì)胞懸液；原料：禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制試驗(yàn)抗原。

（2）方法。禽流感血凝試驗(yàn)參照血凝效價(jià)9log2；以《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》為參考依據(jù)，制備禽流感4HAU抗原血凝效價(jià)為9log2，充分混合均勻，對(duì)紅細(xì)胞凝集孔數(shù)量進(jìn)行觀察：①在反應(yīng)板1～4孔加入0.025mL的PBS，構(gòu)成4個(gè)平行樣本，完成后更換滴頭；②取出0.025 mL的4HAU混勻的抗原液加入到1孔中并充分混合均勻；③從1孔取出0.025 mL的4HAU混勻的抗原液加入到2孔中，經(jīng)過充分均勻混合以后同樣取出0.025 mL的4HAU混勻的抗原液加入到4孔中，再從4孔中取出0.025mL的4HAU混勻的抗原液丟棄，更換滴頭；④在每一個(gè)孔當(dāng)中都加入體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液0.025 mL；⑤充分混合均勻，在室溫條件20～25 ℃環(huán)境下靜置20 min觀察結(jié)果。觀察到的最終結(jié)果為紅細(xì)胞凝集孔數(shù)量為1。

（3）計(jì)算禽流感血凝效價(jià)。根據(jù)上述步驟觀察到的結(jié)果，如果在紅細(xì)胞凝集孔數(shù)量與2相比小于1時(shí)，可以得出最終的禽流感血凝效價(jià)=（9-1）log2=8 log2；結(jié)果：使用檢測禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制試驗(yàn)抗原最終的血凝效價(jià)為8log2。

4 結(jié)論

設(shè)計(jì)一種禽流感和新城疫的血凝試驗(yàn)檢測方法，目的是更加準(zhǔn)確地檢測禽流感、新城疫血凝試驗(yàn)檢測，彌補(bǔ)現(xiàn)階段使用的常規(guī)方式存在的一些不足。在試驗(yàn)開始之前需要明確禽流感、新城疫的血凝效價(jià)，分別確定為9log2、10log2。以《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》作為參照標(biāo)準(zhǔn)觀察紅細(xì)胞凝集孔數(shù)量。計(jì)算得到禽流感、新城疫的血凝效價(jià)以后開始回歸檢測，分別制備體積分?jǐn)?shù)1%的雞紅細(xì)胞懸液、體積分?jǐn)?shù)為0.75%的雞醛化紅細(xì)胞懸液。隨后使用禽流感病毒抗原是禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制試驗(yàn)抗原與禽流感4HAU抗原血凝效價(jià)為9log2，充分混合均勻后，觀察實(shí)際的紅細(xì)胞集孔數(shù)量。經(jīng)過計(jì)算，最終得出禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制試驗(yàn)抗原最終的血凝效價(jià)為8log2。