吳雄健，朱海燕，胡 瀅，黃子倩，劉曉平

(贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 1.消化內(nèi)科、2.藥學部、3.普外五科，江西 贛州 341000)

炎癥目前被認為是惡性腫瘤的診斷和評估治療方案效果的重要標志，在腫瘤的起始、進展、轉(zhuǎn)移和抗腫瘤治療的抵抗等不同階段起決定性作用[1]。多種腫瘤相關(guān)炎癥細胞會增加各種炎癥產(chǎn)物在癌變部位的釋放和積累，這些產(chǎn)物反饋性地激活腫瘤相關(guān)信號級聯(lián)反應(yīng)，如信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, Stat3)、核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)和p38絲裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)，它們介導大量炎癥細胞的募集和促炎因子的分泌，促進及加速腫瘤細胞增殖[2]。結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CC)是一種與局部慢性炎癥廣泛相關(guān)的疾病[3]。盡管手術(shù)及術(shù)后輔助放化療在治療結(jié)直腸癌方面取得了明顯的改善，但腫瘤發(fā)病機制較復雜導致的耐藥性給治療帶來較大的障礙，尋找新的治療靶點是治療結(jié)直腸癌乃至所有存在耐藥性的惡性腫瘤的一個重要的研究方向。靶向炎癥對于結(jié)直腸癌的防治來說是一種有吸引力的潛在策略。人們逐漸將研究方向轉(zhuǎn)至中藥，已有大量的中藥或中藥提取物被確認具有確切的抗炎抗腫瘤的效果[4]。

貓眼草是大戟科大戟屬貓眼草(EuphorbiaesulaL.)的全草，因含有內(nèi)酯、萜類、黃酮類、類固醇、苯丙烷、酚類和其他化學成分，廣泛用于治療痰、咳、喘、水腫、疥癬等[5]。現(xiàn)代藥理研究表明，貓眼草具有多種活性，如抗腫瘤、抗菌和抗氧化活性[6]。大量研究已經(jīng)證實，貓眼草提取物具有較高的抗腫瘤活性，但較少研究評估貓眼草在結(jié)直腸癌中炎癥相關(guān)的抗腫瘤作用。miR-30a-5p表達上調(diào)可抑制結(jié)直腸癌細胞的活力和侵襲，miR-30a-5p在增強結(jié)直腸癌耐藥細胞對化療藥5-氟尿嘧啶的敏感性具有重要意義。報道顯示，中藥內(nèi)酯及萜類成分可通過調(diào)節(jié)miR-30a-5p表達導致結(jié)直腸癌細胞的化療耐藥性，含有內(nèi)酯成分的貓眼草但miR-30a-5p是否可作為貓眼草治療結(jié)直腸癌的潛在靶點尚未可知。因此，本研究建立了結(jié)直腸癌的白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)炎癥模型，檢查貓眼草對結(jié)直腸癌的影響并探索了潛在的抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 材料結(jié)直腸癌細胞HT29(美國ATCC，貨號HTB-38)，miR-30a-5p mimic、mimic對照(miR-NC)、miR-30a-5p inhibitor(anti-miR-30a-5p)、inhibitor對照(anti-miR-NC)(上海吉瑪)，細胞計數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)(日本Dojindo，貨號CK04)，兔抗人細胞周期蛋白D1(CyclinD1)抗體 (貨號ab16663)、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)2抗體(貨號ab92536)、兔抗人MMP9抗體(貨號ab76003)、兔抗人磷酸化p65(phospho-p65，p-p65)抗體(貨號ab 83559)(美國Abcam)，RIPA裂解緩沖液(北京陽光，貨號C190419)。貓眼草藥材(亳州中藥飲片廠)以1 ∶14的比例加入50%乙醇，回流提取1 h，重復2次。合并2次濾液，濃縮并干燥，即得貓眼草提取物。將貓眼草提取物以培養(yǎng)基稀釋成2.5、5和10 mg·L-1的濃度備用。

1.2 細胞培養(yǎng)與IL-1β?lián)p傷結(jié)直腸癌細胞HT29在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)箱飽和濕潤、含95%空氣、5% CO2，溫度為37 ℃。由預實驗和文獻[7]得出，100 μg·L-1IL-1β作用結(jié)直腸癌細胞HT29 24 h，以誘導IL-1β?lián)p傷。

1.3 實驗分組將對數(shù)生長期的結(jié)直腸癌細胞HT29分為：NC組(對照)、IL-1β組(IL-1β?lián)p傷)、低劑量(2.5 mg·L-1貓眼草提取物)+IL-1β組、中劑量(5 mg·L-1貓眼草提取物)+IL-1β組、高劑量(10 mg·L-1貓眼草提取物)+IL-1β組、miR-NC(轉(zhuǎn)染miR-NC)+IL-1β組、miR-30a-5p(轉(zhuǎn)染miR-30a-5p mimic)+IL-1β組、anti-miR-NC(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)+高劑量+IL-1β組、anti-miR-30a-5p(轉(zhuǎn)染miR-30a-5p inhibitor)+高劑量+IL-1β組。轉(zhuǎn)染時，結(jié)直腸癌細胞HT29以5×105/孔的密度接種在6孔板中并培養(yǎng)至50%～60%的匯合度，然后使用Lipofectamine 2000進行miR-NC、miR-30a-5p mimic、anti-miR-NC、miR-30a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染。8 h后根據(jù)分組進行IL-1β?lián)p傷或/和10 mg·L-1貓眼草提取物處理。其中，貓眼草提取物作用時間為48 h。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖活性將細胞以5×103/孔的密度接種在96孔板中，并在d 2測量細胞增殖活性。每孔加入CCK-8試劑(10 μL)，37 ℃持續(xù)2 h。使用Bio-Rad酶標儀測量450 nm處的吸光度A值，細胞的增殖活性表示為A值。

1.5 克隆形成實驗檢測細胞克隆將不同組別結(jié)直腸癌細胞HT29(500個)接種到6孔板中并培養(yǎng)15 d。然后用甲醇固定細胞并用0.5%結(jié)晶紫染色30 min。在光學顯微鏡下計數(shù)超過50個細胞的克隆數(shù)。

1.6 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲結(jié)直腸癌細胞HT29經(jīng)不同處理后，將溶于無血清培養(yǎng)基的1×105個細胞鋪在24孔、8 μm Transwell板上室(侵襲測定時每孔加入40 μg Matrigel并在37 ℃下保持1 h)，下室加入500 μL含血清培養(yǎng)基進行遷移測定。48 h后，通過包被膜遷移(或侵襲)到下室的結(jié)直腸癌細胞HT29用甲醇固定，用1%結(jié)晶紫染色，并通過顯微鏡對每個膜的3個視野進行計數(shù)獲得遷移和侵襲數(shù)量。

1.7 Western blot檢測CyclinD1、MMP2、MMP9、p-p65蛋白表達水平結(jié)直腸癌細胞HT29經(jīng)不同處理后，使用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，使用10% SDS-PAGE分離不同分子量的蛋白(30 μg/泳道)，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜與5%脫脂牛奶在室溫下孵育2 h，與CyclinD1、MMP2、MMP9、β-actin抗體(稀釋度均為1 ∶1 000)在4 ℃下過夜，然后與辣根過氧化物酶標記的二抗在37 ℃下孵育1 h，在凝膠成像系統(tǒng)上用增強型化學發(fā)光試劑檢測蛋白信號。同法測定NC組、IL-1β組、高劑量+IL-1β組、anti-miR-NC+高劑量+IL-1β組、anti-miR-30a-5p+高劑量+IL-1β組p-p65蛋白的表達水平，p-p65抗體稀釋度為1 ∶1 000。

1.8 qRT-PCR檢測miR-30a-5p表達水平采用TRIzol法提取結(jié)直腸癌細胞HT29總RNA，使用Nano-100微型分光光度計測量RNA濃度，收集A260/A280比為1.8～2.0的樣品進行逆轉(zhuǎn)錄。按照Taqman MicroRNA Reverse Transcription試劑盒中規(guī)定的說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)Taqman Universal Master Mix II試劑盒的手冊，在ABI 7500實時PCR系統(tǒng)進行PCR反應(yīng)，測定miR-30a-5p的表達。U6作為miR-30a-5p的內(nèi)參。通過比較CT值法(即2-△△CT法)對miR-30a-5p基因的相對表達進行歸一化。引物序列(5′-3′)：miR-30a-5p F: ACTCAGCTGGTGTAAACATCCTCGAC，R:TGGTGTC GTGGAGTCG，U6 F: CGCTTCGGCAGCACATATACT A，R: CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA。

Fig 1 Cell clone formation experiment

2 結(jié)果

2.1 不同濃度貓眼草提取物對IL-1β誘導的結(jié)直腸癌細胞HT29增殖活性、遷移和侵襲的抑制作用與NC組比較，IL-1β組結(jié)直腸癌細胞HT29的增殖活性升高，細胞克隆數(shù)增多，細胞遷移和侵襲數(shù)量增多(均P<0.01)。與IL-1β組比較，低劑量+IL-1β組、中劑量+IL-1β組、高劑量+IL-1β組結(jié)直腸癌細胞HT29的增殖活性降低，細胞克隆數(shù)減少，細胞遷移和侵襲數(shù)量降低(均P<0.01)。見Tab 1、Fig 1。

Tab 1 Inhibitory effects of different concentrations of Enphorbia lunulata Bge extract on proliferation, migration and invasion of HT29 cells induced by IL-1β n=9)

2.2 不同濃度貓眼草提取物對CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平的影響IL-1β組結(jié)直腸癌細胞HT29的CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平比NC組升高(均P<0.01)。低劑量+IL-1β組、中劑量+IL-1β組、高劑量+IL-1β組結(jié)直腸癌細胞HT29的CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平比IL-1β組降低(均P<0.01)。見Tab 2、Fig 2。

2.3 不同濃度貓眼草提取物對miR-30a-5p基因表達水平的影響IL-1β組結(jié)直腸癌細胞HT29中miR-30a-5p表達水平低于NC組(P<0.01)。低劑量+IL-1β組、中劑量+IL-1β組、高劑量+IL-1β組結(jié)直腸癌細胞HT29中miR-30a-5p表達水平高于IL-1β組(均P<0.01)。見Tab 3。

Fig 2 Expression of cyclinD1, MMP2 and MMP9 detected by Western blot

Tab 2 Effects of different concentrations of Enphorbia lunulata Bge extract on expression of CyclinD1,

##P<0.01**P<0.01vsNC；#P<0.01vsIL-1β

Tab 3 Effects of different concentrations of Enphorbia lunulataBge extract on expression of miR-30a-5p gene n=9)

2.4 miR-30a-5p對IL-1β誘導的結(jié)直腸癌細胞HT29增殖、遷移、侵襲的影響miR-30a-5p+IL-1β組結(jié)直腸癌細胞HT29的miR-30a-5p表達水平比miR-NC+IL-1β組增加約1.05倍，而CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平、增殖活性、細胞克隆數(shù)、遷移和侵襲數(shù)量卻比miR-NC+IL-1β組降低(均P<0.01)。見Tab 4、Fig 3。

Tab 4 Effects of miR-30a-5p on IL-1β-induced proliferation, migration, invasion and apoptosis of HT29 n=9)

Tab 5 Anti-miR-30a-5p reversed effects of Enphorbia lunulata Bge extract on proliferation, migration and invasion of HT29 induced by n=9)

Fig 3 Expression of CyclinD1, MMP2, MMP9 detected by Western blot

2.5 anti-miR-30a-5p可以逆轉(zhuǎn)貓眼草提取物對IL-1β誘導的結(jié)直腸癌細胞HT29增殖、遷移、侵襲的影響anti-miR-30a-5p+高劑量+IL-1β組結(jié)直腸癌細胞HT29的miR-30a-5p表達水平比anti-miR-NC+高劑量+IL-1β組減少約0.55倍，而CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平、增殖活性、細胞克隆數(shù)、遷移和侵襲數(shù)量比anti-miR-NC+高劑量+IL-1β組升高(均P<0.01)。見Tab 5、Fig 4。

2.6 NF-κB信號通路蛋白表達情況結(jié)直腸癌細胞HT29內(nèi)NF-κB信號通路蛋白p-p65表達水平在IL-1β組中高于NC組；在高劑量+IL-1β組中低于IL-1β組；且p-p65表達水平在anti-miR-30a-5p+高劑量+IL-1β組中高于anti-miR-NC+高劑量+IL-1β組(均P<0.01)。見Tab 6、Fig 5。

3 討論

IL-1β是IL-1細胞因子家族的成員。多項研究已確定，IL-1β在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要地位，IL-1β具有多效性，通常通過作用于癌細胞增殖和侵襲、新血管生成或腫瘤浸潤性免疫細胞而成為癌癥的啟動子[8]。IL-1β表達上調(diào)與結(jié)直腸癌患者的不良生存相關(guān)[9]。在結(jié)直腸癌中，IL-1β通過增加鋅指綁定增強蛋白1的表達來誘導細胞遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[10]。本研究中，IL-1β可誘導結(jié)直腸癌細胞HT29增殖、遷移和侵襲能力的增加，表明了IL-1β對結(jié)直腸癌的致癌作用，與前述報告吻合。

Fig 4 Expression of CyclinD1, MMP2, MMP9 detected by Western blot

Fig 5 Expression level of p-p65 protein detected by Western blot

Tab 6 Expression level of p-p65 protein detected by

研究表明，貓眼草提取物通過時間和濃度依賴性方式抑制人肝癌HepG2細胞的增殖[11]。貓眼草的乙酸乙酯提取物可以抑制ZR-75-30乳腺癌細胞的生長，其中抑制率隨著藥物濃度的增加而增加[12]。我們當前的分析旨在確定貓眼草提取物對IL-1β誘導的結(jié)直腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的影響。細胞增殖失調(diào)是癌癥的標志之一，異常持續(xù)的活躍增殖信號傳導是人類腫瘤(包括結(jié)直腸癌)發(fā)展過程中經(jīng)常發(fā)生的事件。本研究中，我們證明貓眼草提取物可降低IL-1β誘導的結(jié)直腸癌細胞增殖活性、克隆形成能力，并下調(diào)增殖相關(guān)蛋白CyclinD1水平。結(jié)直腸癌患者預后差和死亡率高是結(jié)直腸癌細胞高度惡性的結(jié)果[13]。因此，抑制癌癥轉(zhuǎn)移可能是改善結(jié)直腸癌患者預后的關(guān)鍵。在此，我們的結(jié)果表明，貓眼草提取物顯著抑制了IL-1β誘導的結(jié)直腸癌細胞的遷移和侵襲能力，并下調(diào)MMP2、MMP9表達。本研究初步表明，貓眼草提取物可以抑制IL-1β誘導的結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，因此，貓眼草提取物能抑制結(jié)直腸癌中IL-1β的炎癥性致癌作用，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。

研究表明，與正常對照相比，結(jié)直腸癌患者的血清miR-30a-5p水平下調(diào)，能降低結(jié)直腸癌細胞的增殖和遷移[14]。miR-30a-5p上調(diào)可以抑制卵巢癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲[15]。表明miR-30a-5p可能是治療結(jié)直腸癌等腫瘤的有希望的靶點。與這些報道類似，本研究發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p的過表達可以抑制IL-1β誘導的結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。此外，根據(jù)報道，姜黃醇處理可增加miR-30a-5p的表達并激活Hippo信號通路，進而抑制結(jié)直腸癌細胞的侵襲和遷移[16]。本研究調(diào)查了貓眼草提取物對IL-1β誘導的結(jié)直腸癌細胞中miR-30a-5p表達的潛在影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，貓眼草提取物增加了IL-1β誘導的結(jié)直腸癌細胞中miR-30a-5p的表達。而anti-miR-30a-5p可以逆轉(zhuǎn)貓眼草提取物對IL-1β誘導的結(jié)直腸癌細胞HT29增殖、遷移、侵襲的影響。提示貓眼草提取物抑制IL-1β誘導的結(jié)直腸癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的功能與上調(diào)miR-30a-5p有關(guān)。

NF-κB是一種已知參與調(diào)節(jié)癌癥發(fā)展的轉(zhuǎn)錄因子，尤其是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。腫瘤中NF-κB的激活驅(qū)動腫瘤細胞增殖、存活和侵襲。此外，NF-κB的激活主要是由腫瘤微環(huán)境中的炎性細胞因子(如IL-1、TNF-α等)驅(qū)動的。根據(jù)報道，IL-1β/NF-κB信號通過miR-181a/PTEN軸促進結(jié)直腸癌細胞生長[18]?？梢奍L-1β能激活NF-κB通路，與本研究中IL-1β提高p-p65蛋白表達水平一致，但貓眼草提取物拮抗這種作用。此外，anti-miR-30a-5p逆轉(zhuǎn)了貓眼草提取物對p-p65蛋白表達的抑制作用?？梢?，貓眼草提取物通過上調(diào)miR-30a-5p并抑制NF-κB信號通路活性來抑制IL-1β誘導的結(jié)直腸癌細胞生長和轉(zhuǎn)移。

總之，這些結(jié)果表明貓眼草提取物通過上調(diào)miR-30a-5p、下調(diào)NF-κB信號通路活性，來抑制IL-1β誘導的結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。這些發(fā)現(xiàn)提供了對貓眼草提取物在抑制結(jié)直腸癌生長中作為炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的中心功能的新理解，為貓眼草應(yīng)用于結(jié)直腸癌治療提供了基礎(chǔ)。