李銀霞，盛云華，胡 玥，唐黎明

(1. 復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203；2. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 201210； 3. 上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院，上海 201203)

呼吸道細(xì)胞每天暴露在各種氣體、氣溶膠、粉塵顆?；蚴撬幬镏?，是吸入毒理和藥物遞送等研究的重點(diǎn)對(duì)象[1]。用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的呼吸道細(xì)胞類型有很多，如A549(人肺癌細(xì)胞)、Calu-3(人肺腺癌細(xì)胞)、BEAS-2B (人支氣管上皮樣細(xì)胞)、hAELVi(永生化的人類肺泡上皮細(xì)胞)、NCI-H460(人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞)、WI-38(人胚胎肺細(xì)胞)等細(xì)胞系細(xì)胞，還有原代細(xì)胞[2]。不同部位的細(xì)胞其功能也不相同，用于實(shí)驗(yàn)的目的也不盡相同，支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B用作篩選具有潛在肺毒性或致癌的化學(xué)品、納米金屬顆粒等的細(xì)胞模型[3]。A549細(xì)胞形成的融合單層，具有II型肺泡上皮的特征形態(tài)，有助于研究肺泡II型細(xì)胞對(duì)肺上皮藥物遞送機(jī)制的代謝和大分子加工[4]。Calu-3細(xì)胞作為肺上皮細(xì)胞的代表，具有細(xì)胞通透性、緊密連接以及蛋白表達(dá)的特點(diǎn)[5]。體外-體內(nèi)相關(guān)性研究表明，Calu-3細(xì)胞培養(yǎng)模型是預(yù)測(cè)吸入給藥候選藥物的潛在模型[6]，建議將Calu-3細(xì)胞作為篩選呼吸道刺激和空氣中化學(xué)物質(zhì)毒性的合適細(xì)胞株[7]，且Calu-3細(xì)胞在氣液界面培養(yǎng)時(shí)仍可存活數(shù)周、屏障能保持完整性、不會(huì)過(guò)度生長(zhǎng)、并且易于培養(yǎng)和維護(hù)[8]；Grainger等[9]通過(guò)比較液體覆蓋培養(yǎng)(LCC)和空氣液體界面培養(yǎng)(air-liquid interface，ALI)對(duì)Calu-3細(xì)胞層形態(tài)和滲透性的影響得出結(jié)論，使用ALI培養(yǎng)的細(xì)胞生成的模型在形態(tài)學(xué)上更能代表氣道上皮，細(xì)胞呈更明顯的柱狀上皮、有微絨毛和更多的糖蛋白分泌，細(xì)胞的滲透性也強(qiáng)于液體覆蓋培養(yǎng)的細(xì)胞；Ji等[10]建立了Calu-3細(xì)胞模型證實(shí)了Calu-3細(xì)胞在氣液界面培養(yǎng)下的形態(tài)和生物電學(xué)特征以及蛋白特性的表達(dá)，模型中Calu-3細(xì)胞上皮表現(xiàn)出明顯的分化、緊密連接形成和微絨毛樣結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生更多的粘液。因此，本論文主要研究Calu-3細(xì)胞模型。

在傳統(tǒng)的吸入毒理研究中，大多染毒方式采用浸沒(méi)式暴露方式，即將受試物溶解在細(xì)胞的培養(yǎng)液中進(jìn)行暴露，隨后觀察細(xì)胞的后續(xù)變化，這種暴露方式難以避免受試物與培養(yǎng)基的相互作用，且難以反映實(shí)際吸入暴露的情況。隨著氣液界面培養(yǎng)方式的推行發(fā)展出新型暴露系統(tǒng)，可以將氣溶膠直接暴露于細(xì)胞表面，不僅解決了上述問(wèn)題，還更接近人體生理實(shí)際暴露情況。VITROCELL云系統(tǒng)在煙草吸入毒理、藥物遞送方向應(yīng)用較多，云系統(tǒng)和連續(xù)流暴露系統(tǒng)區(qū)別在于受試物沉降機(jī)制和暴露時(shí)長(zhǎng)，云暴露系統(tǒng)的沉降機(jī)制是云沉降，連續(xù)流暴露系統(tǒng)的沉降機(jī)制是擴(kuò)散和沉降[11]；云暴露系統(tǒng)大多在5 min內(nèi)完成受試物的暴露，而連續(xù)流系統(tǒng)則可以在細(xì)胞耐受范圍內(nèi)持續(xù)暴露，對(duì)比云暴露系統(tǒng)，連續(xù)流暴露系統(tǒng)更適用于環(huán)境毒理學(xué)以及吸入毒理學(xué)的研究。本研究采用細(xì)胞氣液界面培養(yǎng)方式結(jié)合VITROCELL連續(xù)流暴露系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行細(xì)胞氣液界面暴露實(shí)驗(yàn)，此系統(tǒng)可以將受試物以氣溶膠的形式均勻且連續(xù)地暴露于細(xì)胞表面，氣溶膠混合物通過(guò)VITROCELL喇叭形管口垂直輸送到細(xì)胞表面(Fig 1)，在暴露細(xì)胞的小室中氣溶膠混合物的流動(dòng)是平滑的和層狀的，很大程度限制了可能會(huì)損害細(xì)胞的剪切力和潛在的水分損失，保證了濕度，通過(guò)VITROCELL體外暴露系統(tǒng)再現(xiàn)人體呼吸道細(xì)胞在接觸外界時(shí)的真實(shí)情況，比傳統(tǒng)的浸沒(méi)式暴露更具有說(shuō)服力。此系統(tǒng)(Fig 1)由3部分組成，形成氣溶膠的發(fā)生裝置、可以定量的稀釋系統(tǒng)模塊和可以溫控的暴露模塊，在系統(tǒng)的暴露模塊中，有3孔是空氣暴露對(duì)照組，9孔是實(shí)驗(yàn)受試物暴露組，受試物暴露組又可以細(xì)分為高中低3個(gè)劑量組。暴露時(shí)長(zhǎng)是評(píng)價(jià)化合物吸入毒性的1個(gè)基本影響因素，本文主要通過(guò)潔凈空氣暴露后細(xì)胞的活性和電阻值的考察，確定細(xì)胞的單次最長(zhǎng)暴露時(shí)間，為后續(xù)化合物體外吸入毒性評(píng)價(jià)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株Calu-3細(xì)胞株(北納生物，編號(hào)2017033104，通過(guò)STR基因型檢測(cè)，與ATCC數(shù)據(jù)庫(kù)完全匹配，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞代數(shù)均在20代之內(nèi))。

1.2 主要儀器Heracell VIOS 160i CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司，德國(guó))；BCM-1300A層流超凈臺(tái)(Airtech公司)；Vi-cell XR細(xì)胞活力測(cè)定儀(Beckman counter公司，德國(guó))；EVOM 2上皮電阻儀和STX2電極(世界精密儀器公司，美國(guó))；VITROCELL?12/12暴露染毒系統(tǒng)(型號(hào)VITROCELL?12/12 CF，VITROCELL，德國(guó))；SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；THUNDER Imager 3D Live Cell(德國(guó)Leica公司)。

Fig 1 VITROCELL12 in vitro inhalation exposure system

1.3 主要試劑與耗材MEM培養(yǎng)基(批號(hào)2192541，Corning)；胎牛血清(FBS，批號(hào)DBC0520，Hyclone)；PBS緩沖液(批號(hào)21020007，Corning)；青霉素-鏈霉素(雙抗，批號(hào)10378016，Thermo)；胰蛋白酶-EDTA(批號(hào)10165921001，Gibco)；CCK-8試劑(日本同仁化學(xué)研究所)；抗體ZO-1(Cell Signaling Technology，貨號(hào)：#3195)；Anti-Rabbit IgG(Cell Signaling Technology，貨號(hào)：#4412)；牛血清蛋白(BSA，批號(hào)abs9157，absin)；抗熒光淬滅封片液(批號(hào)P0126，Beyotime)；DAPI(批號(hào)C1006，Beyotime)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25 cm2，Corning，美國(guó))；Transwell-12孔板(面積為1.12 cm2，孔徑為0.4 μm，Corning公司，美國(guó))。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1Calu-3細(xì)胞ALI培養(yǎng) Calu-3細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增，培養(yǎng)液為5 mL的完全培養(yǎng)基(MEM，10% FBS，1%雙抗)，細(xì)胞置于37°、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。經(jīng)過(guò)傳代3次之后將細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使細(xì)胞的密度約為2×108個(gè)·L-1，以每孔500 μL的細(xì)胞混懸液接種在Tranwell小室中，底室中加入1 mL完全培養(yǎng)基。顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞在Transwell膜中長(zhǎng)滿則棄去Transwell小室中的培養(yǎng)基，之后只在底室供給培養(yǎng)液，開(kāi)始?xì)庖航缑媾囵B(yǎng)，記作ALI d 0，隔天換1次培養(yǎng)液。

1.4.2Calu-3細(xì)胞電阻值測(cè)量 在Transwell小室中加入500 μL的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中平衡20至30 min，連接電阻儀，在Transwell小室中插入電極頭，開(kāi)始測(cè)量、讀數(shù)，每孔測(cè)定3個(gè)不同位置，求平均值，減去空白孔的值后，與Transwell膜表面積(1.12 cm2)的乘積即是該孔的跨上皮電阻(trans-epithelium electrical resistant,TEER)[12]。測(cè)量完成之后，棄去小室和底室的培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，加入新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。Calu-3細(xì)胞ALI培養(yǎng)0～24 d內(nèi)隔天測(cè)1次電阻值，暴露實(shí)驗(yàn)在暴露完成24 h后測(cè)量電阻值。

1.4.3免疫熒光標(biāo)記方法 將氣液界面培養(yǎng)d 1、4、8、16的Calu-3細(xì)胞用PBS清洗細(xì)胞3次；加入4%多聚甲醛固定20 min，完成后PBS清洗3次；加入0.2% Triton破膜15 min，結(jié)束后PBS清洗3次；加入5% BSA封閉、搖晃1 h，完成后PBS清洗3次；將Transwell濾膜裁剪下來(lái)，放在合適容器中，加入按比例稀釋好的一抗，4 ℃搖床搖晃過(guò)夜；d 2取出濾膜，PBS清洗3次；避光加入按比例稀釋好的二抗，搖床孵育2 h，結(jié)束后PBS清洗3次；加入DAPI染核10 min，完成后PBS清洗3次；將濾膜放到載玻片上，滴加抗熒光淬滅封片液，蓋上蓋玻片，制片完成，使用熒光微鏡進(jìn)行觀察拍照。

1.4.4Calu-3細(xì)胞吸入暴露 在VITROCELL體外暴露系統(tǒng)(Fig 1)中進(jìn)行潔凈空氣暴露。提前打開(kāi)VITROCELL暴露系統(tǒng)的溫控和水浴裝置，等待升溫，達(dá)到37 ℃之后，底室各加入3 mL預(yù)熱的37 ℃ MEM培養(yǎng)液(不含F(xiàn)BS)，將ALI d 11的Calu-3細(xì)胞放入其中進(jìn)行潔凈空氣暴露1、2、3、4、5、6 h，潔凈空氣流速為5 mL·min-1，與此同時(shí)對(duì)照組細(xì)胞的培養(yǎng)液也換成不含F(xiàn)BS的MEM培養(yǎng)液在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 h，第2次暴露實(shí)驗(yàn)取ALI 3 d的細(xì)胞，第3次暴露實(shí)驗(yàn)取ALI- d 16的細(xì)胞，隨機(jī)抽取1至18 d內(nèi)的細(xì)胞。

1.4.5Calu-3細(xì)胞暴露后活性測(cè)定 在VITROCELL體外暴露系統(tǒng)中暴露1、2、3、4、5、6 h后，將帶有Calu-3細(xì)胞的Transwell小室回收，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后在Transwell小室中加入CCK-8混合液(CCK-8 ∶MEM=1 ∶10)110 μL，培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，將反應(yīng)液加入96孔板，每孔110 μL，酶標(biāo)儀于450 nm處讀取吸光度值，細(xì)胞活性的計(jì)算公式如下：

其中，Aexposure為暴露組吸光度值，Acontrol為對(duì)照組吸光度值，Ablank為空白孔(無(wú)細(xì)胞，只有CCK-8和MEM)的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 ALI培養(yǎng)的Calu-3細(xì)胞

2.1.1細(xì)胞轉(zhuǎn)為ALI培養(yǎng)天數(shù) Calu-3細(xì)胞從液液培養(yǎng)模式轉(zhuǎn)為氣液培養(yǎng)模式的標(biāo)準(zhǔn)是Transwell膜上的細(xì)胞長(zhǎng)滿(Tab 1)，細(xì)胞需要約(8±1) d的時(shí)間從液液培養(yǎng)轉(zhuǎn)為ALI培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)天數(shù)取整數(shù))。

Tab 1 Days of conversion of Calu-3 cells to ALI

2.1.2細(xì)胞電阻值 Calu-3細(xì)胞的電阻值測(cè)量結(jié)果如Fig 2所示，Calu-3細(xì)胞在氣液界面培養(yǎng)后的1～18 d內(nèi)，細(xì)胞TEER ≥ 500 Ω·cm2，細(xì)胞間緊密連接形成總體穩(wěn)定，細(xì)胞的狀態(tài)可以用于后續(xù)暴露實(shí)驗(yàn)。

2.1.3免疫熒光標(biāo)記 使用ZO-1抗體對(duì)氣液界面d 1、4、8、16的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，結(jié)果如Fig 3所示，細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)明顯，細(xì)胞排列緊密，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，細(xì)胞生長(zhǎng)的數(shù)量越來(lái)越多，細(xì)胞逐漸堆積，在氣液界面培養(yǎng)1～18 d內(nèi)細(xì)胞間的緊密連接完整且穩(wěn)定，細(xì)胞屏障形成，細(xì)胞狀態(tài)可以用于氣液界面暴露。

Fig 2 Changes of TEER value of Calu-3 cells

Fig 3 Expression of tight junction protein ZO-1 in Calu-3 cells in different stages of ALI culture(scale bar=50 μm)

2.2 細(xì)胞暴露后的活性檢測(cè)取ALI-3、11、16 d的Calu-3細(xì)胞暴露1、2、3、4、5、6 h，暴露結(jié)束后培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，通過(guò)CCK-8方法測(cè)定細(xì)胞活性，結(jié)果如Fig 4所示。潔凈空氣暴露6 h細(xì)胞的活性明顯低于培養(yǎng)箱對(duì)照組(P<0.01)，其中潔凈空氣暴露1、3、4、5 h后細(xì)胞活性下降但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，潔凈空氣暴露2 h細(xì)胞活性上升。根據(jù)暴露后細(xì)胞活性結(jié)果顯示，在連續(xù)潔凈空氣暴露下Calu-3細(xì)胞的單次最長(zhǎng)暴露時(shí)間不宜超過(guò)5 h。

Fig 4 Calu-3 cell viability changes with **P<0.01 vs control

2.3 細(xì)胞暴露后電阻值檢測(cè)Calu-3細(xì)胞結(jié)束暴露之后培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h測(cè)定電阻值，測(cè)定培養(yǎng)箱對(duì)照組的電阻值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)單獨(dú)設(shè)置對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 5所示。Calu-3細(xì)胞潔凈空氣暴露之后的電阻值對(duì)比培養(yǎng)箱對(duì)照組細(xì)胞的電阻值均有所下降，且空氣暴露4、5、6 h后細(xì)胞電阻值對(duì)比培養(yǎng)箱對(duì)照組細(xì)胞有顯著性差異(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。根據(jù)連續(xù)潔凈空氣暴露后Calu-3細(xì)胞電阻值結(jié)果顯示，單次最長(zhǎng)暴露時(shí)間不宜超過(guò)3 h。

Fig 5 Changes of resistance value of Calu-3 cells with increasing air exposure

3 討論

成熟的細(xì)胞模型以及可控的體外暴露系統(tǒng)可以極大地促進(jìn)細(xì)胞體外暴露實(shí)驗(yàn)發(fā)展，體外細(xì)胞培養(yǎng)不僅解決了動(dòng)物倫理的問(wèn)題，使用人源細(xì)胞也可以減少種屬間的差異，更大程度上的還原了人在暴露時(shí)的真實(shí)情況，研究結(jié)果更具說(shuō)服力。相應(yīng)的細(xì)胞暴露方式也在進(jìn)一步發(fā)展，從簡(jiǎn)單的浸沒(méi)式暴露方式到現(xiàn)在的氣液界面暴露，模擬了外界化合物進(jìn)入人體呼吸道的過(guò)程，使得體外吸入毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)更完善。

TEER是表示Calu-3細(xì)胞屏障功能完整性的一個(gè)重要指標(biāo)[13]，值越高細(xì)胞間的連接越緊密，實(shí)驗(yàn)研究證明，當(dāng)ALI培養(yǎng)的Calu-3細(xì)胞的TEER值達(dá)到500～800 Ω·cm2時(shí)[14]，已經(jīng)形成緊密連接的上皮；緊密連接是粘膜上皮物理屏障的重要結(jié)構(gòu)，緊密連接蛋白ZO-1是其重要組成蛋白之一[15]。本研究采用氣液界面培養(yǎng)Calu-3細(xì)胞，通過(guò)培養(yǎng)期間的細(xì)胞電阻值和緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)判斷細(xì)胞屏障是否形成，以確定細(xì)胞狀態(tài)是否可以用于暴露實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞在氣液界面培養(yǎng)1～18 d電阻值穩(wěn)定且 ≥ 500 Ω·cm2，緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)明顯，成功培養(yǎng)出具有完整屏障功能的Calu-3細(xì)胞模型。成熟的Calu-3細(xì)胞模型還可以應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)[16]、肺部藥物遞送[17]等研究，期待更進(jìn)一步的探索。

VITROCELL體外暴露系統(tǒng)于體外暴露評(píng)價(jià)化合物吸入毒性來(lái)說(shuō)，需要解決暴露時(shí)長(zhǎng)、受試物暴露劑量的準(zhǔn)確性、受試物的沉積量和暴露的均一性等一系列問(wèn)題。本研究將Calu-3細(xì)胞僅暴露于潔凈空氣中，探索細(xì)胞在VITROCELL?12連續(xù)流暴露系統(tǒng)中的單次最長(zhǎng)暴露時(shí)間，ALI培養(yǎng)1至18 d的Calu-3細(xì)胞可以用于氣液界面暴露實(shí)驗(yàn)，綜合分析Calu-3細(xì)胞潔凈空氣暴露之后的細(xì)胞活性和電阻值變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Calu-3細(xì)胞在VITROCELL?12體外暴露系統(tǒng)中的單次最長(zhǎng)暴露時(shí)間為3 h。本文后續(xù)此系統(tǒng)相關(guān)條件的摸索提供了參考條件，具有重要意義，這只是初步的一個(gè)探索，此系統(tǒng)在吸入毒理學(xué)的應(yīng)用研究則期待更深入的探索。