李 言，楊署光，史敏晶，田維敏

橡膠樹ICE轉(zhuǎn)錄因子對鹽脅迫的響應及功能鑒定

李 言，楊署光，史敏晶，田維敏*

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，海南海口 571101

ICE（inducer of CBF expression）是類似MYC（myelocytomatosis）的bHLH（basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子，在植物應對低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫中起重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過qPCR分析橡膠樹ICE家族成員的表達模式。結(jié)果表明：5個ICE家族成員均響應鹽脅迫上調(diào)表達。在鹽脅迫2 h時，、、和顯著上調(diào)表達；在鹽脅迫4 h時，和的表達量達到最大值，其中的上調(diào)幅度最大；在鹽脅迫4 h內(nèi)無顯著變化，但在處理8 h時顯著上調(diào)表達。過表達這5個ICE家族成員均可不同程度地提高擬南芥的耐鹽性，其中過表達的植株對鹽脅迫的抗性最強，在鹽脅迫下，野生型擬南芥（WT）全部枯萎，而轉(zhuǎn)化植株的存活率為96.29%，平均單株鮮重為0.03 g，平均單株干重為0.0035 g，在HbICE家族成員轉(zhuǎn)化株系中均表現(xiàn)最高。在鹽脅迫下，WT和轉(zhuǎn)基因植株的電導率均顯著增加，葉綠素含量和相對含水量均顯著降低，其中轉(zhuǎn)化植株的相對電導率的增加幅度最小，葉綠素含量和相對含水量的降低幅度最小。因此，轉(zhuǎn)化植株的抗鹽性可能與增強膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性和減緩葉綠素降解和保持相對含水量有關(guān)。該研究結(jié)果對橡膠樹HbICE家族成員的生物學功能有了新的認識，有望為改良農(nóng)作物耐鹽性提供候選靶基因。

橡膠樹；ICE；耐鹽性；功能鑒定

植物在漫長的進化過程中形成了高效且復雜的生理生化機制，以適應低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫。這些生理和生化過程的改變涉及到基因轉(zhuǎn)錄的變化，如鹽脅迫下，ICEs的表達量發(fā)生變化[1]。ICE（inducer of CBF expression）是類似于MYC（myelocytomatosis）的bHLH（basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)植物應對低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫。ICE和MYC類轉(zhuǎn)錄因子均具有相似的結(jié)構(gòu)域，如富含S（serine）區(qū)、NLS（nuclear localization signal）區(qū)、bHLH結(jié)構(gòu)域、Zipper結(jié)構(gòu)域和二聚體化功能域[2-5]。但是，ICE轉(zhuǎn)錄因子不同于MYC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征在于其bHLH結(jié)構(gòu)域中含有一段高度保守的氨基酸序列：KMDRASILGDAI(D/E)YLKELL[4, 6]。

ICEs在植物激素介導的植物應對環(huán)境脅迫反應中起著非常重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[7-10]。在水稻[4]、西紅柿[11]、小麥[12]、結(jié)縷草[13]和擬南芥[1]等植物中的基因響應低溫、干旱和高鹽脅迫，能夠顯著提高植物的逆境脅迫抗性。正常條件下，ICE轉(zhuǎn)錄因子與JAZ互作處于無活性狀態(tài)；低溫脅迫下，植物快速合成活性形式茉莉酸（jasmonyl isoleucine, JA-Ile），且被茉莉酸（jasmonicacid, JA）受體COI1（coronatine-insensitive 1）感知，含有F-box蛋白COI1的復合物招募茉莉酸信號途徑抑制因子JAZ，然后泛素化被26S蛋白酶體降解，從而釋放出ICE轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子可特異性結(jié)合到CBF（C-repeat binding factor）啟動子的順式作用元件G-box（CANNTG）上，控制著CBF信號轉(zhuǎn)導途徑各組分的轉(zhuǎn)錄水平[14]，顯著提高植物的抗寒性。ICE不僅能夠提高植物的抗寒性，還能夠提高植物的耐旱、耐鹽等功能。在擬南芥中，轉(zhuǎn)錄因子能夠與基因的啟動子結(jié)合從而啟動基因轉(zhuǎn)錄，增強擬南芥的抗寒性[3]，過表達還能夠提高轉(zhuǎn)基因水稻的耐旱性和耐鹽性[1]。過表達結(jié)縷草同樣可以增強轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性和耐鹽性[13]。高鹽脅迫下，西紅柿極顯著上調(diào)表達，且能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性[11]。

橡膠樹（Muell. Arg.）是典型的熱帶經(jīng)濟作物，是世界天然橡膠的主要來源。我國植膠區(qū)處于熱帶北源，屬于非傳統(tǒng)植膠區(qū)。橡膠樹種植業(yè)除了遭受低溫和干旱脅迫外，還會受到高鹽脅迫。有些植膠區(qū)高溫干旱，降雨量少，土壤的風化淋溶程度較低，土壤鹽度較大，pH高于橡膠樹適宜生長的酸堿度（pH 4.5～5.5），如海南省昌江黎族自治縣的紅田植膠區(qū)，該地區(qū)的pH較高，土壤鹽度較大，影響土壤有機質(zhì)的分解和營養(yǎng)元素的釋放，從而抑制橡膠樹的生長發(fā)育[15]。另外，我國有1×108hm2鹽堿地，其中有3.33×107hm2具有開發(fā)利用潛力，如果鹽堿地作物發(fā)展起來，將對保障中國糧倉、端牢中國飯碗起到重大作用[16]。除了鹽堿地土壤治理外，推進耐鹽作物培育也是重要的治理措施。目前，通過轉(zhuǎn)基因手段創(chuàng)制出許多耐鹽植物種質(zhì)，其中農(nóng)作物就有26種[17]，這為鹽堿地的開發(fā)提供了良好的作物資源。研究表明，ICEs轉(zhuǎn)錄因子在植物的耐鹽脅迫調(diào)控中具有重要的作用。本研究通過qPCR分析橡膠樹ICE家族成員在鹽脅迫下的表達模式，借助遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)鑒定橡膠樹ICE家族成員的耐鹽功能，為解析ICE在橡膠樹應答鹽脅迫中的調(diào)控機制提供理論依據(jù)。同時也為培育耐鹽農(nóng)作物新品種提供優(yōu)質(zhì)的基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為橡膠樹無性系‘93-114’處于一蓬葉穩(wěn)定期的芽接苗，橡膠樹HbICEs家族成員轉(zhuǎn)基因株系種子和哥倫比亞野生型擬南芥種子為本實驗室保存。RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒和Fastking一步法出基因組cDNA第一鏈合成預混試劑購于天根生化科技有限公司，2×TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）購于大連寶生物公司，其他生化試劑及耗材均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 鹽脅迫處理需要的恒溫培養(yǎng)箱（PGR15，COVVILN，加拿大）條件設置為：光照強度為125 μmol/(m2·s)，16 h光照和8 h黑暗，相對濕度為80%，溫度為28℃。將30株生長一致的橡膠樹‘93-114’芽接苗置于培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)2 d，平均分為處理組和對照組，用400 mmol/L NaCl溶液澆灌處理組幼苗1次，用同樣體積的水澆灌對照組，然后繼續(xù)培養(yǎng)，分別在時間點0、2、4、8、12、24 h收集葉片，每個時間點采集5株幼苗各1片樹葉，等量制成1個混合樣，處理組和對照組各15株幼苗制成3個生物學重復[18]。將采集的樣品迅速置于液氮中，后續(xù)用于總RNA的提取。

1.2.2 總RNA提取和cDNA合成 通過RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取采集樣品的總RNA。利用Fastking一步法出基因組cDNA第一鏈合成預混試劑合成cDNA。

1.2.3 qPCR分析 采用CFX384實時熒光定量PCR系統(tǒng)（Bio-Rad，加利福尼亞，美國）進行qPCR分析。稀釋10倍的cDNA作為qPCR模板。反應總體系為10 μL，其中模板1 μL，2×TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ5 μL，正向和反向引物各0.3 μL，最后用無菌去離子水補足10 μL。和內(nèi)參基因、、的引物參照LI等[19]已發(fā)表的文獻。qPCR反應程序為：95℃預變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)后分析溶解曲線。相對表達量通過2–DDCT法進行計算。

1.2.4 耐鹽性分析 為了鑒定HbICEs家族成員的耐鹽性，待轉(zhuǎn)基因株系種子萌發(fā)后，移栽至基質(zhì)培養(yǎng)土中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件設置為：光照強度為200 μmol/(m2·s)，12 h光照和12 h黑暗，光照時溫度為23℃，黑暗時溫度為21℃，相對濕度為80%。用300 mmol/L氯化鈉溶液澆灌生長2周的野生型擬南芥（WT）和轉(zhuǎn)基因株系，5 d淋1次。統(tǒng)計鹽處理前每個株系的株數(shù)以及鹽處理后每個株系的存活株數(shù)、鮮重和干重等。

1.2.5 生理指標測定 相對葉綠素含量的測定：待培養(yǎng)土中的野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因株系生長4周時，用300 mmol/L氯化鈉溶液澆灌，5 d淋1次。鹽脅迫7 d后，使用SPAD-502 PLUS葉綠素儀測定每個株系的平均葉綠素含量（SPAD值）。相對含水量的測定：取鹽脅迫7 d的WT和各轉(zhuǎn)基因株系相同部位的葉片，測定葉片鮮重（1）；然后將葉片放入含有50 mL去離子水的離心管中，浸泡6 h，葉片吸水至飽和，取出葉片，用吸水紙吸干葉片表面殘留的水，再測定葉片的重量（2）；最后將葉片放入85℃的烘箱中，過夜烘干至恒重，稱烘干葉片的重量（3）。相對含水量=(1–3)/(2–3)×100%[5]。相對電導率的測定：用梅特勒FiveEasy plus電導率儀測定各樣品的相對電導率，取WT及各株系相同部位干凈的葉片0.2 g，剪成5 mm×5 mm的碎片，放入含有30 mL超純水的離心管中；置于真空干燥器中，抽真空10 min，葉片呈水漬狀；從真空干燥器中取出，置于室溫條件下30 min，每5 min震蕩1次，用準備好的電導率儀測定電導率L1；將離心管置入沸水中，水浴20 min，期間震蕩2次，取出冷卻至室溫后測定電導率L2；相對電導率= L1/L2×100%[5]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用T-test方法對基因相對表達量、生理指標等進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對橡膠樹ICEs基因表達的影響

在橡膠樹無性系‘93-114’葉片中，HbICEs家族成員均響應鹽脅迫的誘導，但是其表達量和響應鹽脅迫的時間有差異。在本底表達中，和的表達量較高，其次是，和的表達量最低（圖1）。在鹽處理8 h后，才響應脅迫顯著上調(diào)表達，上調(diào)表達趨勢持續(xù)至24 h。在鹽處理2 h時，的表達量極顯著上調(diào)表達，增至最高值，是本底表達量的2倍，然后表達量逐漸降低，在處理8 h和12 h恢復為本底表達水平，24 h時又上調(diào)表達。在鹽處理2 h時，的表達量極顯著上調(diào)表達，然后持續(xù)顯著下調(diào)表達。在鹽處理條件下，的表達量迅速極顯著上調(diào)表達，在處理4 h時表達量增至最高值，是本底表達量的2倍以上，然后表達量逐漸降低，在處理12 h恢復為本底表達水平，24 h時又上調(diào)表達。在鹽處理條件下，的表達量迅速極顯著上調(diào)表達，在處理4 h時表達量增至最高值，然后表達量逐漸降低，在處理8 h和12 h時表達量顯著低于本底表達水平，24 h時又上調(diào)表達（圖1）。

**和*分別表示差異極顯著（P<0.01）和差異顯著（P<0.05）。

2.2 過表達HbICEs對擬南芥耐鹽性的影響

將、、、和轉(zhuǎn)化的擬南芥株系和WT植株培養(yǎng)2周，然后用300 mmol/L氯化鈉溶液澆灌，鹽脅迫培養(yǎng)1周。表型鑒定結(jié)果顯示，WT植株全部枯死，轉(zhuǎn)化株系生長受到抑制，部分植株已枯死，存活率為62.96%。轉(zhuǎn)化株系部分植株已枯死，存活率與轉(zhuǎn)化株系的無顯著差異。轉(zhuǎn)化株系的枯死株數(shù)最多，存活率最低為39.50%。轉(zhuǎn)化株系的枯死株數(shù)最少，存活率最高為96.29%。轉(zhuǎn)化株系的部分植株枯死，存活率為73.59%（圖2A、圖2B）。存活的和轉(zhuǎn)化植株的平均單株鮮重最大，其次是和，轉(zhuǎn)化植株的平均單株鮮重最?。▓D2C）。不同轉(zhuǎn)基因平均單株間干重高低差異與鮮重的基本一致。和轉(zhuǎn)化植株的平均單株干重最高，其次是，和轉(zhuǎn)化植株的平均單株干重最低（圖2D）。表明HbICEs家族能夠增強轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性，但增強耐鹽的程度不同。

2.3 過表達HbICEs對擬南芥生理指標的影響

相對電導率測定結(jié)果顯示，在高鹽脅迫前，家族成員轉(zhuǎn)基因植株的相對電導率與WT無顯著差異。高鹽脅迫后，家族成員轉(zhuǎn)基因植株和WT植株的相對電導率大幅度上調(diào)，是處理前的2倍左右。但過表達、、、和的擬南芥轉(zhuǎn)化植株的相對電導率顯著低于WT植株（圖3A）。在5種類型的轉(zhuǎn)基因植株之間，、和的轉(zhuǎn)化植株的相對電導率較高，而和的轉(zhuǎn)化植株的相對電導率較低（圖3A）。值測定結(jié)果顯示，在高鹽脅迫前，家族成員轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量與WT無顯著差異（圖3B）。高鹽脅迫下，WT植株的葉綠素含量顯著下調(diào)，家族成員轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量也小幅度下調(diào)，但葉綠素含量仍顯著高于WT植株，其中以轉(zhuǎn)化的擬南芥植株葉綠素含量最高（圖3B）。相對含水量測定結(jié)果顯示，在高鹽脅迫前，家族成員轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量與WT無顯著差異。高鹽脅迫下，家族成員轉(zhuǎn)基因植株和的WT植株相對含水量不同幅度降低，但過表達、、和基因的擬南芥植株的相對含水量仍顯著高于WT植株，其中以轉(zhuǎn)化植株相對含水量較低，和轉(zhuǎn)化植株相對含水量較高（圖3C）。

不同大小寫字母分別表示差異極顯著（P<0.01）和差異顯著（P<0.05）。

3 討論

在橡膠樹基因組中有5個ICE家庭成員，它們不僅響應低溫和干旱的誘導，還能夠提高轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性和抗旱性[5]。本研究結(jié)果表明橡膠樹5個ICE家庭成員也響應鹽脅迫，參與橡膠樹鹽脅迫反應，但它們的表達模式和表達量各不相同。在鹽脅迫下，、和的表達量迅速上調(diào)，在處理2 h或4 h時達到最大值，然后表達量降低，在處理12 h時，和恢復本底表達，呈下調(diào)表達，在處理24 h時，3個基因的表達量又顯著上調(diào)。、和在鹽脅迫下的表達模式基本一致，推測它們具有耐鹽功能的冗余性。西紅柿響應鹽脅迫上調(diào)表達[11]。在高鹽脅迫下，水稻(OrbHLH001)[20]和結(jié)縷草[13]同樣上調(diào)表達，這就說明ICE對于植物調(diào)控鹽脅迫逆境反應可能具有保守性。

過表達水稻(OrbHLH2)基因上調(diào)、、和等脅迫相關(guān)基因的表達，從而顯著增強植株對鹽和滲透脅迫的耐受性[21]。鹽脅迫下，激活的OrICE1誘導基因的表達，并將信號向下轉(zhuǎn)導。特異性地與啟動子區(qū)域內(nèi)的DRE/ CRT元件相結(jié)合，從而調(diào)節(jié)、以及等基因表達，最終應答多種逆境脅迫[22]。（OrbHLH001）能夠特異性結(jié)合啟動子的E-box元件上，通過調(diào)控的表達維持細胞內(nèi)鈉離子和鉀離子的平衡[23]。本研究表明，過表達橡膠樹也能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性，5個橡膠樹HbICE成員可能與水稻一樣，通過調(diào)控下游基因、、、和的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)植物響應鹽脅迫。在5個橡膠樹HbICE成員中，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性最高，可能與增強膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性和滲透調(diào)節(jié)有關(guān)，其機制可能與油菜相似，通過激活抗氧化系統(tǒng)提高膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性[24]。此外，還可能通過提高脯氨酸、可溶性糖等物質(zhì)含量調(diào)節(jié)植物細胞滲透平衡[24-25]，維持細胞膜膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，降低電導率。葉綠素是植物光合色素，反映植物生長狀況，是耐鹽性指標之一。鹽脅迫導致植物葉綠體受到破壞，膜系統(tǒng)受損，促使葉綠素降解[26-27]。過表達的植株在鹽脅迫下的膜系統(tǒng)受損程度較輕，減緩了葉綠素的降解，所以它的葉綠素含量顯著高于WT，生長情況較好。該結(jié)果與油菜的功能一致，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量顯著高于鹽脅迫的對照[24]。另外，相對含水量反映植物逆境抗性的重要指標。過表達的植株在鹽脅迫下的膜系統(tǒng)受損程度較輕，膜的透性較低，水溶性物質(zhì)外滲較少，植物失水也較少，所以的植株在鹽脅迫下的相對含水量顯著高于鹽脅迫下的WT。轉(zhuǎn)化植株在鹽脅迫下含有更多的水，沖淡細胞內(nèi)鹽分的濃度，降低鹽脅迫的損害，這一結(jié)果與李光道等[26]闡述的“稀鹽”說法一致。

不同大小寫字母分別表示差異極顯著（P<0.01）和差異顯著（P<0.05）。

我國鹽堿地面積較大，可開發(fā)利用的鹽堿地就有3.33×107hm2，我國大力開展鹽堿地治理工作。培育耐鹽作物也是重要的治理措施。通過分子標記、基因編輯、基因過表達等生物技術(shù)培育了耐鹽水稻[28]、耐鹽大豆[29-30]、耐鹽油菜[31]等經(jīng)濟作物，為開發(fā)利用我國的鹽堿地提供了良好的作物資源。ICEs是重要的植物轉(zhuǎn)錄因子，參與各種非生物脅迫應答調(diào)控，其下游靶基因DREB同樣可以調(diào)控植物響應非生物脅迫反應。高表達DREBs可增強大豆、油菜等作物的耐鹽性[29-31]。橡膠樹ICEs不僅能夠提高轉(zhuǎn)基因植物的耐寒和耐旱性[5]，還能夠提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性，為培育抗逆農(nóng)作物新品種提供優(yōu)質(zhì)基因資源。

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Salt Stress Response and Functional Indentification offrom Rubber Tree

LI Yan, YANG Shuguang, SHI Minjing, TIAN Weimin*

Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Cultivation & Physiology of Tropical Crops, Haikou, Hainan 571101, China

ICE (inducer of CBF expression), the MYC (myelocytomatosis)-like bHLH (basic helix-loop-helix) transcription factor, plays an important role in regulating the responses of plants to abiotic stresses such as low temperature, drought, and high salt. In this study, the expression patterns of rubber tree ICE genes were analyzed by qPCR. The expression of fivewere up-regulated in rubber tree seedlings upon salt stress,andwere significantly up-regulated under salt stress for 2 h. At 4 h of salt stress, the expression ofandreached the maximum with the most up-regulated level of. Under salt stress for 4–24 h,was significantly down regulated. The expression ofhad no obvious change before 4 h of salt stress, but increased significantly after 8 h. Therefore, all fivegenes may participate in the salt stress response of rubber tree. Overexpression of, especially, led to an enhanced salt-tolerance of transgenicbased onsurvival rate, average fresh and dry weight per plant. Under salt stress, all wild-typewilted. The survival rate ofoverexpressingwas 96.29%, the average fresh weight per plant was 0.03 g, and the average dry weight per plant was 0.0035 g, the three growth parameters ofoverexpressing plants were the highest among the transformed strains of rubber treegenes. Compared with the physiological indexes before salt stress, the relative conductivity of WT andtransgenic plants increased significantly under salt stress, and the chlorophyll content and relative water content decreased significantly. Among them, relative conductivity increase oftransformedwas the smallest, and the decrease of SPAD value (chlorophyll content) and relative water content was the smallest. Therefore, the enhanced salt-tolerance was associated with lower relative conductivity, a physiological parameter for evaluating membrane system stability, as well as higher chlorophyll content and relative water content in comparison to those of WT. Salt stress leads to the damage of plant cell membrane system, resulting in the decrease of water content, the destruction of chloroplasts and the degradation of chlorophyll. The membrane system of plants overexpressingwas slightly damaged under salt stress, delaying the decrease of water content and the degradation of chlorophyll. Rubber tree HbICEs can not only improve the cold and drought tolerance of transgenic plants, but also improve the salt-tolerance of transgenic plants. This study would deepen the understanding of the biological function of rubber tree, and provide candidate target genes for improving salt-tolerance of crops.

Muell. Arg.; inducer of CBF expression; salt tolerance; functional identification

S794.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.003

2022-05-17；

2022-07-12

廣東省重點領(lǐng)域研發(fā)項計劃項目（No. 2020b020217002）；國家天然橡膠產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（No. CARS-33-YZ1）。

李 言（1982—），男，博士，助理研究員，研究方向：植物分子生物學。*通信作者（Correponding author）：田維敏（TIAN Weimin），E-mail：wmtian@163.com。