歐陽(yáng)晨捷 周東華 劉小燕 陳 瑩

廣東省佛山市婦幼保健院病理科 528000

在各國(guó)女性所罹患的惡性腫瘤中，目前宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的第二大“殺手”，據(jù)報(bào)道，在發(fā)達(dá)國(guó)家中宮頸癌5年存活率約為66%，而在發(fā)展中國(guó)家，甚至低于50%。而在我國(guó)女性所患宮頸癌中，每年新增人數(shù)約為9.89萬(wàn)，占世界宮頸癌總?cè)藬?shù)的17.4%，每年死亡的人數(shù)達(dá)到3.05萬(wàn)，有發(fā)病率不斷上升及發(fā)病年齡日趨年輕化的跡象[1]。宮頸鱗狀細(xì)胞癌是宮頸癌中最常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型。目前宮頸癌的病因尚未完全明確，與宮頸癌發(fā)病相關(guān)的因素錯(cuò)綜復(fù)雜，因此，提高宮頸癌的診治水平是當(dāng)下十分緊迫的任務(wù)。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶(Cathepsins)作為人體中重要的信號(hào)分子，占體內(nèi)酶的2%左右，有序地調(diào)節(jié)著人體的生命過(guò)程，并且受到嚴(yán)格的調(diào)控，一旦任何的失調(diào)，都會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。根據(jù)氨基酸活化部位的不同，Cathepsins家族有11個(gè)成員，分布于各種哺乳動(dòng)物組織的細(xì)胞溶酶體內(nèi)，是一組具有強(qiáng)效的溶酶體水解酶，是一類(lèi)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的酶[2]。Cathepsin D是Cathepsins家族中的一員，其基因定位于染色體11p15.5，是一種天冬氨酸溶酶體蛋白水解酶，在不同惡性腫瘤組織中呈差異性的表達(dá)，在胃癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中起到了促進(jìn)的作用[3-4]；但是，Cathepsin D在宮頸鱗癌中的表達(dá)情況鮮有相關(guān)報(bào)道。故本研究同時(shí)檢測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌和正常子宮頸組織中Cathepsin D蛋白的表達(dá)情況，分析Cathepsin D的表達(dá)水平與宮頸鱗狀細(xì)胞癌中患者各病理特征的關(guān)系，對(duì)Cathepsin D在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用做一初步探討，為提高宮頸癌的診治水平提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 本課題組收集了佛山市婦幼保健院病理科2018年1月—2020年8月由病理確診的40例子宮頸鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除的患者組織標(biāo)本及臨床資料，同時(shí)選取同期正常的宮頸上皮組織標(biāo)本28例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)有完整的臨床資料；(2)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌病例均為原發(fā)，取材前都未做過(guò)放、化療等任何特殊治療，也無(wú)特殊疾病史；(3)正常的宮頸上皮組織標(biāo)本來(lái)源于因子宮肌瘤和(或)子宮腺肌癥行子宮全切術(shù)的住院患者，術(shù)前常規(guī)行宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查，未見(jiàn)異常，并通過(guò)病理證實(shí)為慢性宮頸炎的組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他部位的惡性腫瘤；(2)正在參與其他課題組研究的病例。本實(shí)驗(yàn)中子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者共40例，患者年齡28～65歲，中位年齡45歲，其中<45歲13例，≥45歲27例；腫瘤直徑≤4cm 33例，>4cm 7例；組織學(xué)分級(jí)根據(jù)2014版世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)，其中高分化13例，中～低分化27例；臨床分期按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2009年修訂的標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ+Ⅱ期30例，Ⅲ+Ⅳ期10例；浸潤(rùn)深度<1/2肌層34例，≥1/2肌層6例；術(shù)中均進(jìn)行淋巴結(jié)清掃，并經(jīng)術(shù)后證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例。兩位病理醫(yī)師對(duì)所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象的病理診斷一致。本研究通過(guò)了我院倫理委員會(huì)的審批。

1.2 主要試劑 鼠抗人單克隆抗體Cathepsin D(D-7):sc-377299購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology,Inc，免疫組織化學(xué)Power Vision二步法試劑盒(PV-9000)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法 所有組織標(biāo)本切開(kāi)固定于10%的福爾馬林里，用石蠟包埋好的蠟塊連續(xù)切片2張，分別用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色，每張切片的厚度為4μm，使用環(huán)保透明劑脫蠟，梯度乙醇脫水。將處理好的組織切片用0.01mol/L的枸櫞酸緩沖液高壓修復(fù)10min，冷卻到室溫后，PBS沖洗3次，每次3min；3%H2O2室溫孵育10min，PBS沖洗3次，每次5min；滴加稀釋濃度為1∶50的Cathepsin D一抗后，按Power Vision二步法免疫組織化學(xué)試劑盒(PV-9000)的說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)，脫水，透明，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。以Cathepsin D抗體試劑盒說(shuō)明的涎腺組織作為陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本，同時(shí)采用PBS液取代一抗作為陰性對(duì)照標(biāo)本。

1.4 結(jié)果判定 Cathepsin D蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，但要考慮到著色的強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。本實(shí)驗(yàn)建立了一個(gè)分值累加的系統(tǒng)：(1)按著色強(qiáng)度打分：無(wú)著色0分，淡黃色顆粒1分，棕黃色顆粒2分，棕褐色顆粒3分；(2)在目鏡視場(chǎng)數(shù)為22的200倍顯微鏡下，隨機(jī)看5個(gè)視野，取平均值，按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例打分：<1%計(jì)為0分，1%～10%計(jì)為1分，>10%且≤50%計(jì)為2分，>50%且≤80%計(jì)為3分，>80%計(jì)為4分。將(1)(2)兩項(xiàng)分值相加為免疫組化最終評(píng)分，陰性：0～1分，陽(yáng)性：2～7分。全部實(shí)驗(yàn)對(duì)象的免疫組織化學(xué)染色切片由兩位病理醫(yī)師一致性雙盲觀察診斷完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)輸入SPSS25.0軟件并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析。各組間率的差異采用χ2檢驗(yàn)。兩組變量間的相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cathepsin D的免疫組織化學(xué)結(jié)果 應(yīng)用Power Vision二步法檢測(cè)結(jié)果顯示，Cathepsin D蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性顆粒為棕黃色或棕褐色。本組40例宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中38例為陽(yáng)性，2例為陰性，陽(yáng)性表達(dá)率為95.0%；28例正常子宮頸組織中4例為陽(yáng)性，24例為陰性，陽(yáng)性表達(dá)率為14.3%。兩組間Cathepsin D蛋白的表達(dá)不完全相同，且Cathepsin D蛋白的表達(dá)在宮頸鱗癌組織中的陽(yáng)性率顯著高于正常子宮頸組織(χ2=45.437，P<0.01)。

2.2 Cathepsin D在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系 如表1所示，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Cathepsin D蛋白的表達(dá)與宮頸鱗癌組織的分化程度、臨床分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與患者的年齡、腫瘤直徑的大小無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 Cathepsin D與宮頸癌組織中各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

3 討論

宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)循序漸進(jìn)的過(guò)程，從組織非典型增生到原位癌再到浸潤(rùn)癌，病因尚不完全清楚。目前對(duì)宮頸鱗癌的早期診斷及預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移也無(wú)統(tǒng)一的腫瘤標(biāo)志物。但是，宮頸癌的治療效果與是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。隨著近年來(lái)腫瘤研究的不斷深入和發(fā)展，有關(guān)Cathepsin D的分子生物學(xué)研究也得到了極大的發(fā)展。新近研究表明，Cathepsin D不僅在生理情況下起著至關(guān)重要的作用，而且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也關(guān)系密切。

Cathepsin D主要分布在細(xì)胞內(nèi)溶酶體、囊泡、吞噬體及次級(jí)內(nèi)涵體內(nèi)，最開(kāi)始是以天冬氨酸蛋白酶原(相對(duì)分子量為52000)的形式合成于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，接著被快速轉(zhuǎn)移到核內(nèi)體，具有活性，形成單鏈中間產(chǎn)物(相對(duì)分子量為48000)，并且在酸性環(huán)境中完全活化，形成有催化活性的重鏈(相對(duì)分子量為34000)和輕鏈(相對(duì)分子量為14000)蛋白，在生理情況下，Cathepsin D促進(jìn)正常細(xì)胞分裂、增殖和移動(dòng)[5]。

Cathepsin D的異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞分裂、增殖和移動(dòng)的異常，最終促使腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[6]。在腫瘤的酸性微環(huán)境中，Cathepsin D的高表達(dá)可作為一種絲裂原會(huì)引起有絲分裂時(shí)，有絲分裂原底物的調(diào)控失常引起細(xì)胞分化的缺乏，并且刺激細(xì)胞不斷迅速分裂、生長(zhǎng)，繼續(xù)分裂、生長(zhǎng)來(lái)達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)的失常引起克隆性無(wú)限增殖[7]。本研究檢測(cè)了Cathepsin D在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織和正常宮頸組織的表達(dá)，免疫組織化學(xué)法顯示Cathepsin D蛋白在癌組織和正常宮頸組織中均有表達(dá)，但是Cathepsin D在癌組織中的陽(yáng)性率顯著高于正常宮頸組織，符合宮頸鱗癌的進(jìn)展過(guò)程，可提示Cathepsin D的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了宮頸鱗癌的發(fā)生與發(fā)展。

Cathepsin D作為Cathepsins家族中的一員，是一種強(qiáng)效的溶酶體水解酶，在多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究表明，Cathepsin D的表達(dá)上調(diào)通過(guò)水解作用會(huì)促進(jìn)基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解[8]，導(dǎo)致細(xì)胞骨架的崩塌，引起細(xì)胞黏附性的下降，且對(duì)血管和淋巴管的基底膜有溶解作用，并在周?chē)纬扇芙鈪^(qū)域，成為腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)通道，促使腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長(zhǎng)。除此之外，Cathepsin D的過(guò)度表達(dá)還可激活溶酶體靶通道，讓Cathepsin D蛋白酶原及其他溶酶體酶不斷分泌和釋放[9]，進(jìn)一步促進(jìn)了周?chē)植咳芙鈪^(qū)域的形成，為腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移提供了非常便利的“綠色”通道，進(jìn)而激發(fā)了腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的潛能。本研究通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，Cathepsin D蛋白的表達(dá)與宮頸鱗癌組織的分化程度、臨床分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，支持宮頸鱗癌的進(jìn)展過(guò)程，可提示Cathepsin D的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了宮頸鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移。相關(guān)報(bào)道指出[10]，血清中Cathepsin D水平在宮頸鱗癌組是顯著高于不典型增生組和慢性宮頸炎組，與宮頸鱗癌臨床分期、分化程度、間質(zhì)浸潤(rùn)深度、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有不同程度相關(guān)，對(duì)宮頸鱗癌的診斷與轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)具有非常重要的價(jià)值，與本課題組在組織學(xué)上對(duì)Cathepsin D蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)相一致，并且在腫瘤的分化程度、臨床分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上都是密切相關(guān)的。

綜上所述，Cathepsin D在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表達(dá)逐漸升高，說(shuō)明Cathepsin D在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起到了一定的促進(jìn)作用，可能參與了宮頸鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，檢測(cè)其表達(dá)情況有可能為評(píng)估宮頸鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后提供參考依據(jù)。Cathepsin D促癌作用的機(jī)制可能與促進(jìn)有絲分裂、基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)降解和激活溶酶體靶通道等途徑有關(guān)，但這一推測(cè)需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討。