高 帆， 楊 鵬， 王 飛， 徐 璐， 湯麗群

(1. 山西大學 生命科學學院， 太原 030006； 2. 山西大學教務處， 太原 030006；3. 山西大學生物技術研究所， 太原 030006； 4. 山西大學 體育學院， 太原 030006)

光照脅迫是植物界一類重要的非生物脅迫，對植物的光合作用、生長發(fā)育、呼吸作用具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。目前，光照脅迫的相關研究主要集中在高等陸生植物，尤其是農(nóng)作物，對低等藻類植物的相關研究較少。從藻類中挖掘與光照脅迫響應緊密相關的調(diào)控因子及關鍵基因，并對其區(qū)別于高等植物的獨特調(diào)控方式進行分析，對藻類植物的適應性進化、生長發(fā)育及光合作用調(diào)控機制的研究很必要。

杜氏藻屬綠藻門，為單細胞真核微藻，無細胞壁，具鞭毛可游動，胞內(nèi)含較大的杯狀葉綠體能進行光合作用；可在含有0.05～5 mol/L NaCl的鹽水中生長，抗逆性極佳，是一種較為理想的抗逆境生物。杜氏藻中富含生物活性物質(zhì)和藻類色素等高附加值產(chǎn)物，如多糖、甘油、多不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素等[3]，在醫(yī)療保健、食品加工、生物柴油等領域具有廣闊的應用前景，是一類重要的特色經(jīng)濟微藻。多型杜氏藻(Dunaliellapolymorpha)是杜氏藻屬的一種[2]，目前該藻株多在內(nèi)陸鹽湖、近海海域發(fā)現(xiàn)。

隨著國內(nèi)外高通量測序技術的快速發(fā)展，先后出現(xiàn)了以Ion Torrent、Roche 454、Thermo Fisher、SOLiD、HiSeq、BGISEQ為代表的高通量測序平臺[4]。對杜氏藻株進行轉(zhuǎn)錄組測序，已成為獲取其在不同脅迫處理條件下關鍵基因、調(diào)控因子的重要手段之一。近年來，研究人員分別在高鹽、重金屬等非生物脅迫下對不同杜氏藻株進行了轉(zhuǎn)錄組測序，獲取抗逆響應相關基因[8-10]。然而，上述研究均基于杜氏藻屬的其他種類，對多型杜氏藻，目前僅限于其形態(tài)學鑒定及系統(tǒng)分類方面[2]，對該藻株光照脅迫下關鍵應答基因的篩選、光合調(diào)控機理機制的相關研究仍未有報道。光照是影響杜氏藻室內(nèi)培育、生物活性物質(zhì)富集、代謝產(chǎn)物提取重要的影響因素[5-7]。研究在細胞、生化、轉(zhuǎn)錄組水平上，對不同光強脅迫下多型杜氏藻株的形態(tài)、光合效率、基因表達及代謝通路進行分析，填補了該藻株光合作用機理機制研究的空白，研究結(jié)果為多型杜氏藻不同光強脅迫下分子應答機制的深入研究，高品質(zhì)優(yōu)勢藻株的遺傳改良奠定了理論基礎，同時也為其光脅迫響應緊密相關代謝產(chǎn)物的工業(yè)應用提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料搜集與培養(yǎng)

多型杜氏藻種(CCAP 19/14)購于英國CCAP藻種保藏中心，用優(yōu)化的D.m培養(yǎng)基配方[11]進行光照靜態(tài)培養(yǎng)，溫度為25 ℃±5 ℃，光周期為16 h∶8 h，培養(yǎng)室無菌通風。起始光照強度設置為5 000 lx，光源采用白熾燈，每隔10 d采樣進行顯微鏡檢，確保無染菌。根據(jù)實驗室前期對杜氏藻生長周期的測定，第60天進入成熟期，此時將培養(yǎng)藻株平均分為3份，一份進行暗室遮光處理(0 lx)，另兩份分別進行中強度(10 000 lx)和高強度(20 000 lx)光照脅迫處理，處理時間均為30 min，遮光處理作為對照組(DP_CO)、中強度光照和高強度光照脅迫分別作為實驗組DP_ML和DP_HL。

1.2 形態(tài)學觀察與葉綠素熒光參數(shù)測定

利用D-SW50光學顯微鏡(光學儀器一廠，中國上海)觀察處理后的多型杜氏藻單細胞顯微形態(tài)。利用FMS-2葉綠素熒光測定儀(Hansatech公司，美國諾?？?對處理后的多型杜氏藻液的PSII原初光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)和潛在光合活性(Fv/Fo)進行測定，測定方法參照儀器使用說明及文獻[12]的方法進行。

1.3 總RNA提取、文庫構(gòu)建及測序

分別取處理后的樣本300 mL，每份樣本再平均分為3份(進行3個生物學重復)，低溫離心后用液氮速凍并快速研磨，按InvitrogenTRIzol試劑盒[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，中國上海]說明分別提取藻株的總RNA，Agilent 2100 Bioanalyzer[安捷倫生物(杭州)有限公司，中國杭州]對其質(zhì)量和濃度進行評估，質(zhì)量檢測合格(OD260/OD280比值在1.8～2.0，RIN值>7.0)的RNA樣本[13]用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒[普洛麥格(北京)生物技術有限公司，中國北京]進行反轉(zhuǎn)錄(操作步驟按照說明書進行)，按照SMART cDNA文庫構(gòu)建試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司，中國大連]說明書分別對樣本進行文庫構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫在BGISEQ-500測序平臺(華大基因，中國深圳)進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.4 測序質(zhì)量分析及片段組裝

利用SOAPnuke2.0軟件[14]刪除低質(zhì)量reads，即測序片段5′和3′端含接頭，測序片段上poly結(jié)構(gòu)中N占比大于5%(N表示未確定堿基)，篩選獲得的clean reads(Q20值>95%，Q30值>85%)，利用Trinity2.4.0軟件對clean reads進行denovo從頭組裝。利用Bowtie2.0軟件[15]預測clean reads中的Unigene，利用Tgicl 2.1軟件[16]分析Unigene的數(shù)量和長度，利用BUSCO 4.0.2軟件[17]評估組裝質(zhì)量。

1.5 數(shù)據(jù)注釋

將Unigene與Gene ontology(GO)、RefSeq nonredundant protein(NR)、Nucleotide sequence(NT)、SwissPort、Pfam、Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)及euKaryotic orthologous group(KOG)數(shù)據(jù)庫分別進行數(shù)據(jù)比對，參數(shù)設置：E值≤1.00E-15，查詢序列長度百分比≥90%。比對獲得的數(shù)據(jù)在Linux系統(tǒng)下運行uniq命令，對其中的重復序列進行去冗余處理。去冗余后的數(shù)據(jù)在UNIX系統(tǒng)下執(zhí)行HMMER程序，查詢Pfam和COG數(shù)據(jù)庫，預測Unigene功能及潛在的轉(zhuǎn)錄因子[18]。

1.6 基因表達分析

Fragments per kilobase of transcript per million fragments(FPKM)計算Unigene表達量[19]，RSEM軟件篩選差異表達基因(Differentially expressed gene，DEG)，DEseq2軟件構(gòu)建DEGs分布火山圖(Fold change≥|5.00|，Q值≤ 0.05)[20]，顯著差異基因采用Fold change≥|25|，Q值≤0.01的標準進行篩選；相同標準下，用Limma/voom軟件再次統(tǒng)計DEGs數(shù)量，比較分析兩者共有DEGs篩選結(jié)果及其基因表達相關性；利用層次聚類法構(gòu)建不同處理組間的DEGs聚類熱圖[21]。

1.7 GO和KEGG通路富集

運行Blast2GO對Unigene進行GO分析，并對GO條目進行富集(FDR≤0.01)。運行KAAS程序?qū)nigene進行KEGG通路分析，并對KEGG通路進行富集(FDR ≤0.01)[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻細胞形態(tài)與PSII光化學效率分析

由圖1(a)可知，遮光處理后的成熟期藻細胞呈球狀，淺綠色，有鞭毛，細胞直徑為(16±2)μm；中強度光照處理后的藻細胞呈橢球狀，深綠色，有鞭毛，細胞直徑為(23±1.5)μm；高強度光照處理后的藻細胞呈橢球狀，黃綠色，有鞭毛，細胞直徑為(24±2)μm。表明隨著光刺激的加強，藻細胞色素尤其是葉綠素的合成加強，細胞形態(tài)也發(fā)生了變化。由圖1(b)可知，遮光處理后的多型杜氏藻光合效率較低，F(xiàn)v/Fo和Fv/Fm的變化趨勢均是先降低后逐漸升高，這表明遮光處理極大地影響藻株的光化學效率，但隨著光照的恢復，光化學效率逐漸增強。中光強處理后的多型杜氏藻光合效率最高，F(xiàn)v/Fo和Fv/Fm的變化趨勢均是先降低后升高，后趨于平穩(wěn)，表明中光強(10 000 lx)適合該類型藻株進行光合作用，當光照強度降低后，光化學效率也降低，但隨著藻株的生理適應，效率又逐漸恢復。高光強處理后的多型杜氏藻光合效率低于中光強組，F(xiàn)v/Fo的變化趨勢是先降低后升高，再降低，而后趨于平穩(wěn)；Fv/Fm的變化趨勢是先降低后升高，這表明強光(20 000 lx)不利于該藻株進行光合作用，影響了其光化學效率的提高，但隨著光強的降低及藻株的生理適應，其光化學效率雖得以恢復，但仍然無法達到原始水平。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序及組裝分析

多型杜氏藻總RNA平均濃度為95 ng/μL，OD260/OD280在1.9～2.0(平均值為1.93)，RIN平均值為7.2，符合轉(zhuǎn)錄組測序標準。由表1和圖 2(a)可知，3個實驗處理組DP_CO(0 lx)、DP_ML(10 000 lx)、DP_HL(20 000 lx)共9個測序文庫中共鑒定到52 853條Unigenes，共檢測到282條完整的Contig片段(完整度占比約92.01%，contig總長約4.25×107bp，平均長度約804 bp)。N50長1 072 bp(N70長785 bp，N90長396 bp)，GC占比約52.25%。Unigene中共預測到29 025條CDS(總長為2.05×107bp)，14 220條SSR(總長為18 643 bp)。由圖2(b)可知，9個測序樣本的Q20和Q30百分比平均值分別為98.95%和89.72%。Denovo組裝的BUSCO質(zhì)量評估結(jié)果顯示，組裝完整的測序片段、單拷貝及雙拷貝片段總占比大于90%，組裝質(zhì)量較高。

(a)藻細胞光脅迫處理30 min后的形態(tài)觀察(放大倍數(shù)20×)；(b)藻液光脅迫處理30 min后的Fv/Fo及Fv/Fm比值。圖1 多型杜氏藻形態(tài)學觀察及PSII潛在光合效率及原初光能轉(zhuǎn)化率Figure 1 Morphology of D. polymorpha and potential PSII acitivityand its primary light energy conversion efficiency

表1 多型杜氏藻轉(zhuǎn)錄組測序de novo組裝基本信息Table 1 D. polymorpha transcriptome assembly information

(a)Unigene長度分布；(b)基于BUSCOs的de novo組裝質(zhì)量評估。圖2 轉(zhuǎn)錄組測序Unigene長度及組裝質(zhì)量分析Figure 2 Analysis of transcriptomic unigenes length and de novo assembly quality

2.3 基因注釋與功能預測

52 853條Unigenes在7大生物信息數(shù)據(jù)庫中的交集注釋數(shù)為21 980，占比41.59%(并集注釋數(shù)為30 873，占比68.42%)，見表2，平均49.71%的基因在上述數(shù)據(jù)庫中有注釋信息?；贜R數(shù)據(jù)庫的多型杜氏藻Unigne注釋物種的分類結(jié)果顯示[圖3(a)]，約35.33%的Unigene可在藻類(Chlamydomonaseustigma，Goniumpectorale和Volvoxcarteri)和陸生植物(Dorcocerashygrometricum和Ricinuscommunis)中被注釋到，剩余64.67%的數(shù)據(jù)未在已知植物物種基因庫中檢測到。由圖 3(b)可知，COG分類中最多的10 377條Unigene功能與催化活性有關(占比20.22%)，其次為生物學調(diào)控功能(9 339條Unigene，占比18.20%)。由圖3(c)可知，基因所屬轉(zhuǎn)錄因子家族分類結(jié)果中預測最多的轉(zhuǎn)錄因子家族是MYB(31條Unigene，占比10.58%)。

(a)多型杜氏藻Unigene物種分類注釋；(b)多型杜氏藻Unigene的COG分類；(c)多型杜氏藻Unigene的轉(zhuǎn)錄因子家族分類。圖3 多型杜氏藻Unigene注釋Figure 3 Unigene annotation of D. polymorpha

表2 多型杜氏藻轉(zhuǎn)錄組Unigene注釋信息

2.4 基因表達分析

基于多型杜氏藻3個處理組Unigene表達的FPKM值，構(gòu)建基因表達聚類圖譜[圖4(a)]。多型杜氏藻中光強處理組(DP_ML)和高光強處理組(DP_HL)的基因集可聚為一類，表明兩者具有相似的基因表達趨勢，遮光處理組(DP_CO)的基因集單獨聚為一類，所有Unigene可劃分為兩大簇。

以DP_CO為對照，共檢測到18 053條DEGs，其中顯著差異表達基因1 005條。如圖4(b)和(c)所示，DP_ML vs DP_CO共檢測到上調(diào)基因5 825條，下調(diào)基因6 250條，非差異表達基因212條；DP_HL vs DP_CO共檢測到上調(diào)基因2 221條，下調(diào)基因3 135條，非差異表達基因410條。如圖4(d)所示，兩對比較組間的共有DEGs 3 123條。如圖 4(e)和(f)所示，DEseq2分析獲得的差異基因結(jié)果穩(wěn)定(Limma/voom與DEseq2分析獲得的共有DEGs達17 849條，占比分別為98.86%和99.01%；兩款軟件獲得的DEGs表達水平相關性較高，R2=0.987 6)。

(a)基因表達聚類熱圖；(b)DP_ML vs DP_CO DEGs火山圖；(c)DP_HL vs DP_CO DEGs火山圖；(d)兩對比較組間共有DEGs維恩圖；(e)Limma/voom與DEseq2分析所得共有DEGs維恩圖；(f)Limma/voom與DEseq2分析所得共有DEGs表達相關性。圖4 多型杜氏藻不同比較組間的DEGs分析Figure 4 Analysis of differentially expressed genes among different D. polymorpha comparison groups

2.5 GO與KEGG通路分析

多型杜氏藻組間共有DEGsGO分類結(jié)果，見圖 5(a)，在生物學過程類別中，GO條目最多的是細胞過程(235條)；在細胞組分類別中，GO條目最多的是細胞(208條)；在分子功能類別中，GO條目最多的均是催化活性(320條)。圖 5(b)所示組間共有DEGsGO富集top20結(jié)果，富集程度最高的GO條目是光合作用-天線蛋白(基因數(shù)量：119條，Q值：1E-120)。

多型杜氏藻組間共有DEGsKEGG通路分類結(jié)果，見圖 5(c)，所有的通路可劃分為細胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、新陳代謝和有機體系統(tǒng)等5類。其中，通路條目最多的是新陳代謝(148條)。組間共有DEGsKEGG通路富集top20結(jié)果，見圖 5(d)，富集程度最高的KEGG通路是光脅迫應答(基因數(shù)量：38條，Q值：1E-40)。

(a)組間共有DEGs GO分類；(b)組間共有DEGs GO富集；(c)組間共有DEGs KEGG通路分類；(d)組間共有DEGs KEGG通路富集。圖5 多型杜氏藻組間的差異表達基因GO及KEGG分類與富集Figure 5 GO and KEGG classification and enrichment of the common DEGs among different D. polymorpha comparison groups

3 討論

利用BGISEQ-500測序平臺[21]對不同光強脅迫下的多型杜氏藻進行轉(zhuǎn)錄組測序，測序結(jié)果可靠。單藻株clean reads的GC百分比(51.93%)高于Panahi等[22]利用Illumina GAIIx測序平臺獲得的鹽生杜氏藻(D.salina)數(shù)據(jù)(clean reads GC%：50%)。多型杜氏藻單藻株測序文庫質(zhì)量指標Q20和Q30平均值高于Polle等[23]報道的鹽生杜氏藻CCAP 19/18轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量。多型杜氏藻中預測的CDS數(shù)(29 025條)低于He等[10]在Illumina HiSeq 2000測序平臺獲得的鹽生杜氏藻CCAP 19/30CDS數(shù)(49 751條)。多型杜氏藻轉(zhuǎn)錄片段從頭組裝后的N50長度(1 072 bp)短于Hong等[13]從鹽生杜氏藻435所得N50長度(1 727 bp)。

多型杜氏藻Unigene中僅有35.33%可在已報道植物基因庫中注釋到，相較于其他藻類植物如萊茵衣藻，基因的物種注釋信息量較低(一般高于45%)[24]。推測有兩方面原因：(1)綠藻的系統(tǒng)進化時間早于高等陸生植物，晚于藍細菌，甚至與某些原生動物系統(tǒng)進化關系較近[25]；未將該藻基因的物種注釋范圍擴大到細菌及原生動物，導致可比對數(shù)據(jù)范圍縮小。(2)研究測序獲得的多型杜氏藻Unigene數(shù)據(jù)未經(jīng)開放型閱讀框整合處理，造成非功能測序片段對物種注釋結(jié)果的干擾。

多型杜氏藻PSII光合效率指標顯示，盡管中高強度光照脅迫后的藻株Fv/Fo及Fv/Fm均有波動，但中強光脅迫組的光合效率在短期內(nèi)可實現(xiàn)平穩(wěn)增加，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示DP_ML vs DP_CO的DEGs數(shù)量較高(12 075條)，這暗示隨著光強的增加，藻株光合作用也逐漸增強，相關功能基因表達出現(xiàn)波動。然而，多型杜氏藻高強度光照脅迫組的PSII光合效率在短期內(nèi)無法達到原初水平，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，DP_HL vs DP_CO的DEGs數(shù)量較低(5 356條)，這暗示當光強達到一定閾值(～20 000 lx)，藻株可能出現(xiàn)了代謝廢物與有毒物質(zhì)積累，甚至細胞凋亡，為調(diào)控外界刺激的影響，DEGs數(shù)明顯下降，部分基因沉默，這可能是藻株為應答不利環(huán)境而做出的響應。此外，相對遮光處理組，多型杜氏藻中高光強脅迫組下調(diào)基因數(shù)均高于上調(diào)基因數(shù)，表明對該藻株光合作用、生長發(fā)育及新陳代謝等過程起關鍵作用的光脅迫響應基因，其總體調(diào)控方式是負向的。該結(jié)果與杜氏藻在其他非生物脅迫下(如高鹽脅迫、高溫脅迫、強酸強堿等)的響應基因調(diào)控方式不同(一般為正向調(diào)控)[10,26]。

多型杜氏藻組間共有DEGsGO分析表明，與光照脅迫響應相關基因功能可能主要與藻細胞內(nèi)與光合作用相關功能組分的信號識別、催化過程有關(GO富集分類結(jié)果最高的分別是細胞過程、細胞和催化活性，GO富集程度最高的是光合作用-天線蛋白)，光脅迫下藻細胞的形態(tài)變化(球形延展為橢球形，葉綠素含量增加)也暗示了上述預測結(jié)果[27]。多型杜氏藻組間共有DEGsKEGG通路分析表明，與光脅迫響應相關基因的功能可能主要參與了與光合調(diào)控相關的代謝通路(KEGG分類結(jié)果最高的是新陳代謝，通路富集程度最高的是光脅迫應答)。

4 結(jié)論

多型杜氏藻在受到外界環(huán)境變化刺激后，會啟動自身內(nèi)在調(diào)控機制來適應新環(huán)境。研究基于多型杜氏藻轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，分析其在不同光照強度脅迫下的差異表達基因及其代謝通路，結(jié)合其形態(tài)與光合效率指標，進一步分析該藻株潛在的光脅迫應答過程。研究結(jié)果為該藻株光脅迫響應過程中關鍵調(diào)控基因的挖掘與功能驗證及光合調(diào)控分子機制的研究奠定基礎，同時也為特色藻株的分子改良及其工業(yè)應用提供借鑒。