梁瑩，吳西雅，肖祖克

江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330000

肺癌系呼吸道惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率均處于第1位，現(xiàn)已成為全球主要健康問題[1]。據相關研究報道顯示，肺癌每年新發(fā)病例超210萬，且死亡人數(shù)超180萬[2]，而1/3新發(fā)病例和2/5死亡病例均來自中國，且近幾年來發(fā)病率有上升趨勢[3]。目前，肺癌治療以放化療手段為主，雖可較好改善患者生存質量，但5年生存期仍較低。隨著基因組時代及分子生物學的發(fā)展，表觀遺傳學已成為癌癥研究的新熱點，其調控機制包括DNA甲基化、非編碼RNA表達及組蛋白修飾等，其中DNA甲基化與腫瘤發(fā)生、進展密切相關[4]。經癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據庫篩選肺癌基因發(fā)現(xiàn)，組織因子途徑抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)啟動子區(qū)異常甲基化可導致TFPI-2表達下降，促進肺癌細胞生長、浸潤及轉移[5-6]。而啟動子異常甲基化于腫瘤早期或癌前便已出現(xiàn)，可較好預測腫瘤發(fā)生，具有較高特異性，基于此機制研發(fā)的靶向藥物5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)經美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)批準上市且推薦用于骨髓異常增生類疾病治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CdR在結腸癌[7]、口腔鱗狀細胞癌[8]、胰腺癌[9]及肺癌[10]等實體瘤治療中亦可發(fā)揮作用，但同樣也發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR具有不良反應，可引起嚴重的胃腸道反應及骨髓抑制等。研究表明，從莪術、姜黃等中草藥中提取出來的姜黃素可通過抑制腫瘤細胞增殖、血管生成、轉移及抗炎等多途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，且可調控DNA甲基化，但相關機制尚未闡明[11-13]。基于此，本文以TFPI-2及DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)、DNMT3a、DNMT3b等為切入點探討姜黃素對TFPI-2基因甲基化的作用。

1 材料

1.1 細胞人肺腺癌A549細胞株，由中國科學院上海細胞生物學研究所提供，貨號：ZQ0003。

1.2 藥物與試劑姜黃素(美國Sigma公司，批號：C1386-10G)；DMEM培養(yǎng)基(美國Thermo fisher scientific公司，貨號：11966025)；MagicPure?Cell-Free DNA Kit II(含Magnetic Stand) DNA提取試劑盒、MagicPure?Simple Viral DNA/RNA Kit(含Magnetic Stand)RNA提取試劑盒、PerfectStart?Taq DNA Polymerase(含2.5 mM dNTPs)擴增試劑盒(北京全式金生物技術有限公司，貨號：EC211、EC311、AP401)；引物合成委托美國Invitrogen公司完成。

1.3 儀器Applied Biosystems Veriti型PCR儀(美國Thermo fisher scientific公司)；Ts2型倒置相差顯微鏡(日本NIKON公司)；MDF-382E(N)型-86 ℃超低溫冰箱(日本SANYO公司)；3-18KS型低溫高速離心機(德國Sigma公司，離心半徑：16 cm)；Gel Dox XR型凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；SW-CJ-2F型超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)、分組及干預將含細胞的凍存管投入37 ℃水溫箱中迅速解凍，自主晃動待其完全融化后轉移細胞懸液至含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，混勻后1 000 r·min-1離心5 min，棄上清后將其接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待80%～90%細胞貼壁生長時，棄除舊培養(yǎng)液，采用PBS緩沖液沖洗細胞，并用0.25%胰酶消化后進行觀察，當發(fā)現(xiàn)細胞質濃縮、圓潤時添加 2 mL 培養(yǎng)基。將貼壁細胞作離心處理后，將1個培養(yǎng)瓶中的白色沉淀細胞均勻接種至3個新的培養(yǎng)瓶中并放于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取長勢良好的對數(shù)生長期細胞，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細胞分別設置為姜黃素低劑量組、姜黃素中劑量組、姜黃素高劑量組及空白對照組?？瞻讓φ战M細胞采用30 mL完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，姜黃素各劑量組分別采用30 mL含20 μmol·L-1、40 μmol·L-1及80 μmol·L-1的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，24 h后棄除培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗細胞，收集處理后的A549細胞以待進一步實驗。

2.2 MTT法檢測A549細胞的增殖情況將2.1項下處理后的A549細胞依次加入96孔板內，細胞密度為4×104mL，每孔接種200 μL，設置3個復孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入10 μL MTT試劑，培養(yǎng)4 h后每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)培養(yǎng)15 min，使用振蕩器震蕩10 min使其充分混勻，采用酶標儀檢測各孔490 nm處光密度(optical density，OD)值，計算細胞抑制率。實驗重復進行3次，取平均值。

細胞抑制率=(OD空白對照組-OD處理組)/OD空白對照組×100%

2.3 RT-PCR檢測TFPI-2、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的mRNA表達水平使用RNA提取試劑盒將2.1項下處理后的A549細胞總RNA提取出來，以1 μg RNA為模板，使用逆轉錄試劑逆轉錄合成cDNA，采取相應引物進行擴增。反應循環(huán)條件：95 ℃預變性5 min后，每周期：95 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共計循環(huán)40周期。對特異性曲線進行分析，以目的基因與內參基因的OD值分析TFPI-2、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的mRNA相對表達情況，以2-△△Ct表示，實驗重復進行3次，取均值。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2.4 甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)法檢測TFPI-2基因甲基化狀態(tài)使用DNA提取試劑盒提取2.1項下處理后的A549細胞中的DNA，以2 μg DNA為模板，使用重亞硫酸鹽處理，按說明書規(guī)范操作進行DNA純化，而后進行甲基化特異性擴增。反應體系：PCR buffer 2.0 μL，上、下游引物各0.2 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)1.6 μL，Taq酶0.1 μL，DNA模板2 μL，三蒸水 13.9 μL，共20 μL。反應循環(huán)條件：95 ℃ 預變性 5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，共計35個循環(huán)。取5 μL擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，采用溴化乙錠染色，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。以人類胎盤組織DNA經甲基化酶SssI轉化后產物作為甲基化的陽性對照，健康人淋巴細胞DNA作為陰性對照，雙蒸水作為空白對照。引物序列見表2。

表2 MSP引物序列

3 結果

3.1 姜黃素對A549細胞增殖情況的影響隨姜黃素濃度升高、干預時間延長，A549細胞OD值呈下降趨勢，于濃度40 μmol·L-1且處理細胞48 h時OD值為最低，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。細胞抑制率結果顯示：各劑量姜黃素處理細胞12 h、24 h及48 h后均可抑制細胞增殖。見表3、圖1。

表3 姜黃素對A549細胞增殖情況的影響

圖1 各組A549細胞抑制率變化

3.2 姜黃素對TFPI-2mRNA、DNMT1mRNA、DNMT3amRNA、DNMT3bmRNA相對表達情況的影響與空白對照組比較，姜黃素各劑量組TFPI-2mRNA相對表達水平升高，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的mRNA相對表達水平降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 姜黃素對TFPI-2 mRNA、DNMT1 mRNA、DNMT3a mRNA、DNMT3b mRNA相對表達情況的影響

3.3 姜黃素對TFPI-2甲基化的影響空白對照組未顯示甲基化及去甲基化產物，陰性對照組僅顯示去甲基化產物，陽性對照組僅顯示甲基化產物，姜黃素各劑量組除顯示甲基化產物外，亦可見去甲基化產物，尤以姜黃素中劑量組去甲基化產物條帶最為明顯。見圖2。

注：m：甲基化產物；u：去甲基化產物；0：空白對照組；1：陰性對照組；2：陽性對照組；3：姜黃素低劑量組；4：姜黃素中劑量組；5：姜黃素高劑量組

4 討論

TFPI-2已被證實為一類抑癌基因，可通過以下機制抑制腫瘤生長、浸潤及轉移[14]：①TFPI-2通過抑制MMPs在內的蛋白酶活性阻斷ECM重塑，進而維持ECM結構完整性；②上調Fas-α、TNF-α表達使Caspase-3、Caspase-9凋亡通路活性增強，進而誘使細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效果；③拮抗組織因子阻斷血管生成。當肺癌發(fā)生后，TFPI-2基因啟動子區(qū)的CpG島(鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū))甲基化使TFPI-2基因表達下降或者缺失，進而引起腫瘤浸潤及轉移。姜黃素是從中藥姜黃、莪術等中藥中提取出來的一類酸性多酚類物質，具有廣泛藥理作用，譬如抗凝、降脂、抗炎、抗腫瘤等，且有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過抑制DNMT1甲基轉移酶導致多種基因低甲基化[15]。He等[16]研究證實，姜黃素可抑制非小細胞肺癌中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉移酶的活性。此外，研究表明，5-Aza-CdR可通過與DNA甲基轉移酶共價結合使其活性受到抑制，進而使TFPI-2基因異常甲基化得以逆轉[17]?；诖?，本研究探討姜黃素是否可通過抑制DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉移酶活性來抑制TFPI-2基因甲基化，進而抑制A549細胞增殖。結果顯示：經不同濃度姜黃素處理后，A549細胞OD值均有所下降，可見姜黃素可對A549細胞增殖產生抑制作用，且與濃度、時間有一定依賴性，其中濃度40 μmol·L-1的姜黃素處理細胞48 h時抑制率最高，可見姜黃素對A549細胞的增殖抑制作用與濃度不呈線性依賴，這與陳馨等[18]認為姜黃素濃度在40～60 μmol·L-1時可發(fā)揮良好去甲基化效應有一定類似。

DNA甲基化主要由DNMT催化，目前已知的DNMT包括DNMT1、DNMT3a、DNMT3b，其中DNMT1可參與新合成單鏈DNA甲基化，并將甲基化信息傳遞給子代細胞，DNMT3a、DNMT3b則負責胚胎時期的DNA甲基化。已有研究證實，DNMT在細胞周期G0/G1期表達異常，可沉默抑癌基因，使阻斷信號消除，促進腫瘤發(fā)生、進展。因此，尋找一種可抑制DNMT活性的藥物逆轉抑癌基因沉默，可能為治療肺癌的新興靶點。而姜黃素已被證實可激活NRF2、WIF-1、PTEN等抑癌基因啟動子區(qū)DNA去甲基化過程[19]。現(xiàn)深入探討姜黃素對影響肺癌TFPI-2基因甲基化的DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的作用，結果顯示，與空白對照組比較，不同劑量姜黃素組TFPI-2mRNA相對表達水平均升高，而DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉移酶的mRNA相對表達水平則下降，提示不同濃度姜黃素處理均可通過抑制DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉移酶活性(主要為DNMT1)促進肺癌細胞TFPI-2基因表達，逆轉TFPI-2基因的DNA甲基化，且從TFPI-2基因甲基化狀態(tài)亦可準確反映姜黃素對肺癌細胞去甲基化作用。肖海勵等[20]研究認為，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等具備活性的DNA甲基轉移酶可參與DNA甲基化并維持過程，且在正常細胞中呈現(xiàn)共同表達的形式，進一步佐證本研究的正確性。研究發(fā)現(xiàn)，DNMT可升高癌細胞ROS水平引發(fā)線粒體和核DNA損傷發(fā)揮抗癌作用，且可通過P53-P21/GADD45A-cyclin/細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)-Rb/E2F-DNMT1軸介導去甲基化作用。而姜黃素與DNMT巰基共價結合使得轉移位點減少，從而對甲基化轉移及修飾產生阻礙，進而取得去甲基化作用[21-25]。Cao等[26]研究表明，賴氨酸特異性去甲基化酶2(histone lysine specific demethylase 2，LSD2)可通過調節(jié)TFPI-2表達促進小細胞肺癌增殖。

綜上所述，姜黃素可通過抑制DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉移酶活性來抑制TFPI-2基因甲基化，進而抑制A549細胞增殖，且濃度為 40 μmol·L-1時抑制效果最佳。該研究為后續(xù)肺癌臨床治療方案制定提供參考，但尚有以下不足，即體外腫瘤狀態(tài)與體內有所差異，因而姜黃素去甲基化作用還有待更多研究支持。且姜黃素生物利用度低，穩(wěn)定性差，機體代謝迅速等缺點可影響臨床應用，應著眼研究穩(wěn)定性更高的姜黃素系列衍生物的去甲基化作用，以使姜黃素成為肺癌治療的可靠靶向藥物。