黃浩祺，劉志華，陳 潔，趙盼盼，張科平，崔 倩，林丹義，許 潔

間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphomakinase, ALK)基因融合在我國(guó)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中的發(fā)生率約5.6%[1]。《中國(guó)非小細(xì)胞肺癌ALK檢測(cè)臨床實(shí)踐專家共識(shí)》指出FISH是ALK基因易位檢測(cè)的經(jīng)典方法，在進(jìn)行FISH結(jié)果判讀時(shí)，對(duì)于存在不典型信號(hào)的病例，建議使用其他技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行復(fù)檢[2]。本文收集1 690例行ALK-FISH檢測(cè)的NSCLC福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本，并對(duì)其中ALK-FISH檢測(cè)出現(xiàn)不典型信號(hào)的病例行Ventana ALK免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)檢測(cè)及二代測(cè)序(next generation secjuencing, NGS)檢測(cè)，尋找最佳的復(fù)檢技術(shù)方案，以提高ALK基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料收集2018年1月～2021年6月廣東省人民醫(yī)院病理科存檔的1 690例行ALK-FISH檢測(cè)的NSCLC福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本。

1.2 主要儀器與試劑ALK BA探針(06N43-020，美國(guó)Vysis公司)，F(xiàn)ISH預(yù)處理試劑盒Paraffin Pretreatment Kit Ⅱ(07J02-002，美國(guó)Vysis公司)，抗ALK兔單克隆抗體(D5F3，Roche公司)，DNA提取試劑盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(56404，德國(guó)Qiagen公司)，人多基因突變檢測(cè)通用試劑盒(RS03F-12，燃石醫(yī)學(xué))，人多基因突變檢測(cè)捕獲探針-朗清(RS060-12，V4，燃石醫(yī)學(xué))；雜交儀(S500-24，美國(guó)ThermoBrite公司)，熒光顯微鏡(BX51，日本Olympus公司)，全自動(dòng)免疫組化染色儀(Ventana-Benchmark Ultra，羅氏公司)，高通量測(cè)序儀(illumina，MiSeqDx，美國(guó))。

1.3 FISH檢測(cè)切片應(yīng)用FISH預(yù)處理試劑盒Paraffin Pretreatment Kit Ⅱ進(jìn)行預(yù)處理，再滴加ALK BA探針，于雜交儀上80 ℃變性5 min，37 ℃孵育過夜，洗片后加入DAPI復(fù)染，即可在熒光顯微鏡下觀察信號(hào)。結(jié)果判讀在100×物鏡下觀察癌細(xì)胞胞核的FISH結(jié)果并進(jìn)行信號(hào)計(jì)數(shù)和比值計(jì)算(表1)。ALK-FISH切片由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判斷，所有病例判讀結(jié)果一致。

表1 ALK基因FISH結(jié)果判讀方法

1.4 Ventana ALK(D5F3) IHC檢測(cè)ALK-IHC檢測(cè)使用羅氏診斷公司的Ventana ALK(D5F3)抗體診斷試劑盒，選擇與ALK-FISH檢測(cè)出現(xiàn)不典型信號(hào)病例相同的腫瘤組織蠟塊，切片進(jìn)行全自動(dòng)IHC流程，顯微鏡下觀察結(jié)果，檢測(cè)過程中分別設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照。采用二元判別法，即ALK陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：無論著色細(xì)胞多少，只要腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)強(qiáng)染色顆粒，即判定為陽(yáng)性。ALK-IHC由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師采用雙盲法觀察判斷，所有病例判讀結(jié)果一致。

1.5 基因組DNA提取選擇與ALK-FISH檢測(cè)出現(xiàn)不典型信號(hào)病例相同的腫瘤組織蠟塊，切取10 μm厚組織8片，應(yīng)用石蠟組織DNA抽提試劑盒提取DNA。

1.6 二代測(cè)序(next generation secjuencing, NGS)文庫(kù)構(gòu)建應(yīng)用人多基因突變檢測(cè)通用試劑盒，將上一步提取的樣本DNA隨機(jī)打斷后連接上接頭，選擇人多基因突變檢測(cè)捕獲探針(朗清)進(jìn)行雜交后對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行捕獲，最后得到終文庫(kù)。

1.7 二代測(cè)序上機(jī)根據(jù)MiSeqDx高通量測(cè)序儀標(biāo)準(zhǔn)操作流程操作，終文庫(kù)變性后在測(cè)序儀上進(jìn)行高通量、高深度測(cè)序，生信人員對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析解讀。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行變量分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

ALK-FISH檢測(cè)1 690例NSCLC福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本，其中6例出現(xiàn)FISH信號(hào)不典型，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；5例ALK基因呈現(xiàn)出除融合和(或)斷裂分離信號(hào)外單獨(dú)存在一個(gè)綠色信號(hào)卻不伴有相應(yīng)的橙色(圖1)，其中1例經(jīng)NGS檢測(cè)存在EML4-ALK基因融合，且其ALK-IHC結(jié)果為陽(yáng)性；1例細(xì)胞核除了有融合信號(hào)之外，還有單獨(dú)的細(xì)小橙色信號(hào)(圖2)，即單獨(dú)橙色信號(hào)直徑較正常細(xì)胞信號(hào)直徑小，該例經(jīng)NGS檢測(cè)未檢出ALK基因重排/點(diǎn)突變/插入/缺失/拷貝數(shù)變異，且其ALK-IHC結(jié)果為陰性(表2)。

表2 ALK-FISH結(jié)果不典型病例Ventana ALK(D5F3)IHC及NGS檢測(cè)結(jié)果

圖1 FISH檢測(cè)ALK基因呈現(xiàn)出除融合和(或)斷裂分離信號(hào)外單獨(dú)存在1個(gè)綠色信號(hào) 圖2 FISH檢測(cè)ALK基因呈現(xiàn)出除融合和(或)斷裂分離信號(hào)外單獨(dú)存在1個(gè)細(xì)小橙色信號(hào)

3 討論

我國(guó)NMPA批準(zhǔn)了包括Ventana ALK(D5F3) IHC、FISH、RT-PCR、NGS 4個(gè)檢測(cè)平臺(tái)的ALK基因檢測(cè)伴隨診斷試劑。Ventana ALK(D5F3) IHC檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本較低，但結(jié)果判讀易受其他因素影響；NGS檢測(cè)可以利用少量樣本獲得多基因多位點(diǎn)的突變信息，并利用這些突變信息為患者選擇合適的靶向治療[3]，但NGS檢測(cè)成本高，不適合在臨床推廣；RT-PCR僅能檢測(cè)出已知突變；FISH檢測(cè)是ALK基因易位經(jīng)典的檢測(cè)方法，幾乎能夠檢測(cè)所有ALK基因重排，具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性，在針對(duì)ALK陽(yáng)性的NSCLC的臨床試驗(yàn)中，大部分研究檢測(cè)ALK融合均采用FISH技術(shù)。因此，F(xiàn)ISH一度被認(rèn)為是ALK基因融合檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，在許多醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)開展。出現(xiàn)FISH檢測(cè)信號(hào)不典型，實(shí)驗(yàn)室首先要排除實(shí)驗(yàn)問題，再針對(duì)具體病例進(jìn)行分析，選擇合適的方法進(jìn)行復(fù)檢驗(yàn)證。

本組6例ALK-FISH檢測(cè)信號(hào)不典型，應(yīng)用NGS和IHC復(fù)檢，兩種技術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致。2例復(fù)檢結(jié)果與FISH相反，1例ALK單綠信號(hào)經(jīng)IHC及NGS復(fù)檢均呈陽(yáng)性，另外1例多出細(xì)小橙色信號(hào)經(jīng)過ALK-IHC及NGS復(fù)檢均呈陰性。在臨床實(shí)踐中根據(jù)ALK-FISH試劑盒判讀標(biāo)準(zhǔn)，除了融合和(或)斷裂分離信號(hào)之外，還單獨(dú)存在1個(gè)綠色信號(hào)卻不伴相應(yīng)的橙色信號(hào)為陰性，主要原因可能是ALK抑制劑(已批準(zhǔn)的有克唑替尼、色瑞替尼、阿樂替尼等)作用的目標(biāo)區(qū)域位于橙色探針結(jié)合區(qū)域，當(dāng)這一部分缺失，判讀為陰性，但有文獻(xiàn)報(bào)道，部分該類型的病例經(jīng)其他技術(shù)平臺(tái)驗(yàn)證，存在ALK基因融合，且對(duì)ALK抑制劑治療有效，Takeuchi等[4]研究分析認(rèn)為，該類型的病例ALK探針橙色部分未完全缺失，剩余區(qū)域包括ALK激酶的結(jié)構(gòu)域由于太短，無法在福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本上清晰觀察到橙色的熒光信號(hào)。細(xì)胞核除有融合和(或)斷裂信號(hào)之外，還有單獨(dú)的橙色信號(hào)判讀為陽(yáng)性，當(dāng)出現(xiàn)多出的橙色信號(hào)點(diǎn)較正常信號(hào)點(diǎn)小的情況應(yīng)警惕，排除FISH實(shí)驗(yàn)操作原因，出現(xiàn)這種結(jié)果首先考慮有可能是該區(qū)域部分基因擴(kuò)增或細(xì)胞處于分裂間期染色質(zhì)螺旋松疏呈顆粒狀不均勻分布于細(xì)胞核中，由于切片原因，在不同斷層顯示信號(hào)彌散而非ALK基因發(fā)生斷裂重排。

綜上所述，對(duì)于ALK-FISH信號(hào)不典型病例，應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待，盡量選擇1～2種或以上技術(shù)進(jìn)行復(fù)檢，本實(shí)驗(yàn)選擇IHC及NGS法進(jìn)行復(fù)檢，獲得一致結(jié)果。Ventana ALK(D5F3) IHC操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本較低，建議首選IHC，但是當(dāng)標(biāo)本由于處理不當(dāng)或者保存時(shí)間過長(zhǎng)等出現(xiàn)質(zhì)量問題時(shí)，IHC染色易出現(xiàn)非特異性染色或者染色強(qiáng)度不足影響判讀[3]，所以有條件的單位可以選擇加做NGS或RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證，分析ALK基因的真實(shí)狀態(tài)，盡可能避免漏、誤診。