李雯鈺,魏守輝,黃紅娟,曹 藝,周欣欣,黃兆峰*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京 100193;2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,沈陽(yáng) 110886;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所,北京 100125)

狗尾草Setariaviridis(L.) Beauv.為禾本科狗尾草屬一年生雜草,為秋熟旱作田常見的惡性雜草,分布于全國(guó)各地。狗尾草根系發(fā)達(dá),能較快吸收土壤中的水分和養(yǎng)分,環(huán)境適應(yīng)能力極強(qiáng)。當(dāng)生長(zhǎng)旺盛繁殖過多時(shí)可形成優(yōu)勢(shì)種群密布田間,與作物爭(zhēng)奪水肥和光照,造成作物減產(chǎn)[1]。

除草劑憑借其高效、經(jīng)濟(jì)、省工等特點(diǎn)成為農(nóng)田雜草防除最有力的“武器”。但由于長(zhǎng)期使用同一種或同種作用機(jī)制的除草劑,導(dǎo)致抗藥性雜草不斷發(fā)生與發(fā)展。截至目前,全球已有266種(153種雙子葉,113種單子葉)雜草的509個(gè)生物型,對(duì)71個(gè)國(guó)家的95種作物田的164種除草劑產(chǎn)生了抗藥性[2]。其中抗乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase,簡(jiǎn)稱ALS)抑制劑的雜草占比最大,約占總量的1/3。ALS抑制類除草劑通過抑制雜草體內(nèi)ALS酶的活性,阻礙支鏈氨基酸合成,進(jìn)而殺死雜草[3]。該類除草劑具有活性高、選擇性強(qiáng)以及低毒、低殘留等優(yōu)點(diǎn),在全球廣泛應(yīng)用[4]。但由于作用位點(diǎn)單一,雜草易產(chǎn)生抗藥性[5]。

雜草對(duì)除草劑的抗藥性機(jī)理主要分為靶標(biāo)抗性和非靶標(biāo)抗性。其中,靶標(biāo)基因突變和對(duì)除草劑代謝作用增強(qiáng)是導(dǎo)致雜草抗藥性的主要原因[6]。研究表明,高等植物的ALS導(dǎo)致雜草抗藥性的主要有8個(gè)氨基酸突變位點(diǎn),分別為:Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653和Gly654[2,7-8]。

煙嘧磺隆是日本石原產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社于20世紀(jì)80年代末開發(fā)的磺酰脲類(sulfonylureas,SU)除草劑。在我國(guó),馬唐[9]和反枝莧[10]對(duì)煙嘧磺隆均產(chǎn)生了高水平的抗藥性。近年來(lái),有農(nóng)民反映我國(guó)吉林省玉米田煙嘧磺隆對(duì)狗尾草防效下降的現(xiàn)象,本研究通過對(duì)不同狗尾草種群進(jìn)行生物測(cè)定,明確其對(duì)煙嘧磺隆的抗性水平,并探究其對(duì)煙嘧磺隆的靶標(biāo)抗性機(jī)理,旨在為制定合理有效的抗性雜草防治策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

狗尾草種群:抗性狗尾草種群(R1,R2)采自吉林省白城市玉米田,煙嘧磺隆用藥史>5年。敏感種群(S)采自玉米田(同抗性種群)邊,無(wú)除草劑用藥史。將采集的顆粒飽滿的狗尾草種子自然風(fēng)干后,去除種皮,室溫避光保存于種子庫(kù),以備試驗(yàn)使用。

主要儀器:3WP-2000型噴霧塔,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南京農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所;臺(tái)式離心機(jī)Centrifuge5417R,德國(guó)Eppendorf;電泳儀,北京君意東方電泳設(shè)備有限公司JY600C;PCR儀,Bio-RAD公司;紫外凝膠成像分析儀,美國(guó)UVP。

藥劑及主要試劑:40 g/L煙嘧磺隆可分散油懸浮劑,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊農(nóng)藥中試廠;植物基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司;1×TaqMasterMix,北京博邁德生化科技有限公司;6×Loading Buffer、2000 DNA Marker,北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1狗尾草對(duì)煙嘧磺隆的敏感性測(cè)定

供試植株培養(yǎng):播種之前對(duì)種子進(jìn)行預(yù)處理。取不同種群狗尾草種子在800 mg/L的赤霉素溶液中浸泡12 h,以打破種子休眠。再用清水將種子沖洗干凈,晾干備用。將營(yíng)養(yǎng)土裝入邊長(zhǎng)8 cm,高為9 cm的塑料方盆中,將填好的基質(zhì)表面壓平。從方盆底部澆透水,使土壤吸水飽和后,選取大小一致的飽滿種子,均勻撒播到塑料方盆中(每盆20粒左右),覆土約0.5 cm。置于人工氣候室中培養(yǎng),溫度為25～35℃,光照14 h/d,相對(duì)濕度為 50%～60%。待植株長(zhǎng)到2～3葉期開始間苗至6株/盆,確保每盆保留的植株長(zhǎng)勢(shì)均勻,互不遮擋,并及時(shí)澆水、施肥。

生物測(cè)定:在狗尾草3～4葉期,以煙嘧磺隆有效劑量60 g/hm2為1倍劑量對(duì)各種群(每個(gè)種群21盆,每盆6株)進(jìn)行施藥,采用噴霧塔(3WPSH-500D,南京機(jī)械化研究所)噴施。S種群施藥量為0,1/16,1/8,1/4,1/2,1,2倍劑量;R1和R2種群施藥量為0,1,2,4,8,16,32倍劑量。噴藥后繼續(xù)放置人工氣候室統(tǒng)一培養(yǎng),觀察各種群劑量反應(yīng)情況。

施藥后21 d觀察各種群癥狀,調(diào)查記錄每個(gè)種群狗尾草在噴施煙嘧磺隆后的存活株數(shù),拍照并計(jì)算存活率。比較不同種群的存活率,評(píng)價(jià)其對(duì)煙嘧磺隆抗性水平,該試驗(yàn)重復(fù)2次,每個(gè)處理3盆,每盆6株。

1.2.2靶標(biāo)ALS基因序列分析

從狗尾草S、R1、R2種群中各取10株進(jìn)行ALS基因擴(kuò)增和序列分析。待植株生長(zhǎng)至3～4葉期時(shí),每株剪取約100 mg的葉片組織,采用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。參照已報(bào)道的狗尾草ALS基因序列(GenBank編號(hào):KX652140)和擴(kuò)增含所有已知抗性突變位點(diǎn)的引物[11],進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25 μL(基因組DNA 1 μL,正反向引物各0.5 μL,1×PCR Mix 23 μL)。

將反應(yīng)體系混勻,95℃預(yù)變性5 min;95℃變性10 s,55℃復(fù)性10 s,72℃延伸1 000 bp/min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。待PCR反應(yīng)完成后,取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物,進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),將檢測(cè)成功的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京博邁德生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,并利用Vector NTI 11.5.2軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Sigmaplot 12.5軟件對(duì)不同劑量煙嘧磺隆處理的狗尾草存活率進(jìn)行回歸分析,得到劑量-反應(yīng)曲線,求出狗尾草死亡50%的除草劑劑量(ED50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 狗尾草種群對(duì)煙嘧磺隆抗藥性

施藥3 d后,S種群狗尾草開始出現(xiàn)藥害癥狀,心葉顏色變淡失綠。藥后10 d,狗尾草S種群地上部分受到明顯抑制,與對(duì)照相比,新葉生長(zhǎng)基本被抑制,在田間推薦劑量下,S種群出現(xiàn)死亡,而R1,R2種群未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。3周后田間推薦劑量下S種群全部枯死,其ED50值為10.8 g/hm2。R1、R2種群在8倍田間劑量下出現(xiàn)植株死亡現(xiàn)象,其ED50分別為235.4 g/hm2和258.1 g/hm2,相對(duì)于S種群的抗性倍數(shù)分別為21.8倍和23.9倍(圖1,2)。

2.2 不同狗尾草種群ALS基因差異位點(diǎn)分析

通過對(duì)狗尾草ALS基因擴(kuò)增和測(cè)序發(fā)現(xiàn),相較于S種群,R1和R2兩個(gè)種群均發(fā)生了ALS位點(diǎn)突變。其中,R1種群ALS在376位點(diǎn)由GAT突變?yōu)镚AA,R2種群ALS在376位點(diǎn)由GAT突變?yōu)镚AG,兩個(gè)突變均導(dǎo)致天冬氨酸替換為谷氨酸(Asp-376-Glu)。

圖1 不同狗尾草種群對(duì)煙嘧磺隆抗性水平測(cè)定(藥后21 d)Fig.1 Resistance levels of different Setaria viridis populations to nicosulfuron (21DAT)

圖2 不同狗尾草種群對(duì)煙嘧磺隆劑量反應(yīng)曲線Fig.2 Dose-response curve for different Setaria viridis populations treated with nicosulfuron

3 結(jié)論與討論

煙嘧磺隆在我國(guó)取得登記已有20余年,該除草劑用量低,效果好,廣泛用于我國(guó)玉米田除草[12]。經(jīng)過連續(xù)多年使用后,馬唐Digitariasanguinalis(L.) Scop.、狗尾草、反枝莧AmaranthusretroflexusL.、藜ChenopodiumalbumL.、稗Echinochloacrus-galliL.等雜草的抗藥性逐年增強(qiáng)[13]。本研究通過整株生物測(cè)定結(jié)果顯示,采自吉林的R1和R2狗尾草種群均對(duì)煙嘧磺隆表現(xiàn)出了抗性,抗性倍數(shù)分別為21.8倍和23.9倍,屬于高抗水平。

本試驗(yàn)擴(kuò)增了2個(gè)抗性狗尾草種群的ALS基因序列,通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)R1和R2種群的ALS在第376位氨基酸均發(fā)生了Asp-376-Glu突變。該突變?cè)诤邴湶軱oliumperenneL.[14]、反枝莧[15]、豬殃殃GaliumspuriumL.[16]等雜草中也被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。Laplante等[11]在加拿大發(fā)現(xiàn)了多個(gè)對(duì)咪唑乙煙酸和煙嘧磺隆產(chǎn)生交互抗性的狗尾草種群,這些種群是由于靶標(biāo)ALS Ser-653-Thr、Asn或Ile,和Gly-654-Asp突變導(dǎo)致。本研究未發(fā)現(xiàn)上述ALS氨基酸突變,可能與測(cè)定的狗尾草樣本量較少有關(guān)。

ALS不同位點(diǎn)突變會(huì)產(chǎn)生不同的交互抗性譜。其中,Asp-376和Trp-574位點(diǎn)突變均可對(duì)五類ALS抑制劑表現(xiàn)出抗藥性[2]。在本研究中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)狗尾草種群ALS存在Asp-376位點(diǎn)突變,因此ALS抑制劑已不被推薦用來(lái)防除這些抗性狗尾草種群。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上,針對(duì)玉米田狗尾草發(fā)生區(qū)域,不能單一使用煙嘧磺隆,應(yīng)推廣不同作用機(jī)理的除草劑如苯唑草酮、環(huán)磺酮交替、混合使用,從而延緩和控制雜草產(chǎn)生抗藥性并減少抗性種群的發(fā)生,同時(shí)擴(kuò)大殺草譜、降低除草劑使用量或延長(zhǎng)除草劑的使用壽命,可保障雜草的有效治理和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。