林澤燕 ,林燕燕 ,章 倩 ,劉慧麗 ,林藝華 ,王淑貞 ,林姿羽

（1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系,福建漳州 363000；2.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院海洋天然產(chǎn)物與活性研究實驗室,福建漳州 363000；3.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)檢測應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,福建漳州 363000）

勝紅薊（Ageratum conyzoidesL.）是菊科藿香薊屬，系一年生草本植物，原為入侵植物并成為農(nóng)田雜草[1].勝紅薊含有豐富的黃酮類物質(zhì)，目前已報道的已經(jīng)有21種之多[2].在已有的文獻(xiàn)報道中發(fā)現(xiàn)勝紅薊含有的黃酮類物質(zhì)對多株腫瘤細(xì)胞在體外具有良好的抗腫瘤活性[3-6].而血液腫瘤當(dāng)中的急性髓性白血病是目前世界上排名前十的惡性腫瘤[7]，利用勝紅薊總黃酮的抗癌活性，抑制血液腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡，將為下一步尋找高效且準(zhǔn)確的靶位藥物提供堅實的實驗室理論基礎(chǔ)，為解決惡性腫瘤疾病提供新思路，并為勝紅薊的有效防控即資源利用開辟新途徑.

1 材料與方法

1.1 供試材料與主要儀器

1.1.1 供試材料

勝紅薊總黃酮溶液（勝紅薊采于福建漳州薌城區(qū)芝山公園，烘干后粉碎后，用60%乙醇提取后，用石油醚除油脂和葉綠素，濃縮后用無水乙醇沉淀多糖和蛋白，離心取上清并旋蒸，再過大孔樹脂D101洗脫，復(fù)旋至無醇味轉(zhuǎn)至冷凍干燥機(jī)冷凍干燥成勝紅薊總黃酮粉末，用雙蒸水配制成40 mg/mL母液）

總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、羥自由基清除能力檢測試劑盒超氧陰離子清除能力檢測試劑盒均購自上海優(yōu)選生物科技有限公司；DPPH購自北京索萊寶科技有限公司；磷酸鹽酸緩沖液和胎牛血清購自美國Sigma，CCK8試劑盒均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，0.22 μm濾膜購自無錫耐思生命科技股份有限公司；其他普通化學(xué)試劑均購自西隴化工股份有限公司.試驗用細(xì)胞株為漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院轉(zhuǎn)化協(xié)同創(chuàng)新中心自行傳代.

1.1.2 主要儀器

酶標(biāo)儀以及恒溫孵育箱均購自美國賽默飛世爾科技公司；恒溫震蕩培養(yǎng)箱購自上海知楚儀器有限公司；超凈工作臺購自蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；紫外分光光度計購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；高速臺式冷凍離心機(jī)購自湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 勝紅薊總黃酮抗氧化能力測定

1.2.1.1 總抗氧化能力（T-AOC）測定

1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線按試劑盒要求，將20 μmol/mL FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0.003 125 μmol/mL，分別取500 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液加入試劑二，充分混勻，反應(yīng)10 min，雙蒸水調(diào)零，蒸餾水為空白，與593 nm 處測吸光值A(chǔ)，計算ΔA=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白，此時Fe2+終濃度為0.1、0.05、0.025、0.0125、0.006 25、0.003 125、0.000 78 μmol/mL，以Fe2+終濃度為橫坐標(biāo)，ΔA為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=kx+b.

2）樣品總抗氧化能力計算預(yù)熱酶標(biāo)儀30 min至穩(wěn)定狀態(tài)的期間，按說明書要求按照7:1:1將試劑一、試劑二和試劑三混合，并預(yù)熱至37 ℃.

將勝紅薊總黃酮溶液稀釋100倍，得到0.4 mg/mL的總黃酮溶液.按試劑盒說明書加樣要求，在180 μL混合液中加入樣品5 μL，混勻后反應(yīng)10 min，雙蒸水調(diào)零，以0.25 mg/mL 的VC 溶液為陽性對照，吸取200 μL 于96 孔板中593 nm 處測吸光值A(chǔ)，計算總抗氧化能力（U/mL）=（ΔA’-b）/k×V反總/V樣，其中：V反總為反應(yīng)總體積223 μL；V樣為反應(yīng)中樣品體積5 μL.

1.2.1.2 超氧陰離子清除能力測定

預(yù)熱酶標(biāo)儀30 min，將勝紅薊總黃酮溶液稀釋20倍，得到2 mg/mL的總黃酮溶液，采用黃嘌呤氧化酶法，按照試劑盒說明書操作，以雙蒸水調(diào)零在530 nm 處測定吸光值，計算公式：超氧陰離子清除率I/%=（A對照管-A測定管）/A對照管×100%.

1.2.1.3 羥自由基清除能力測定

酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，將勝紅薊總黃酮溶液稀釋成1.8 mg/mL，采用Fenton 反應(yīng)氧化法，測定536 nm 的吸光值下降情況，按試劑盒操作說明，吸取樣品50 μL進(jìn)行顯色反應(yīng)，計算勝紅薊總黃酮羥自由基清除率：羥自由基清除率D/%=（A測-A對）/（A空--A對）×100%.

1.2.1.4 DPPH清除能力測定

精密稱取0.002 g DPPH 溶于50 mL乙醇，避光保存待用.精密稱取10 mg VC標(biāo)準(zhǔn)品雙蒸水定容至10 mL配制成1 mg/mL的母液，精密吸取250 μL加入750 μL蒸餾水中將其稀釋成0.25 mg/mL的VC對照液.分別配制0.2、0.1、0.08、0.06、0.04、0.02 mg/mL 的勝紅薊總黃酮溶液.酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長至515 nm，無水乙醇調(diào)零，在90 min測定不同濃度勝紅薊總黃酮處理組吸光值，計算DPPH清除能力：

1.2.2 勝紅薊總黃酮對白血病癌細(xì)胞增殖抑制作用

收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×103個/孔接種于96孔板，設(shè)4個重復(fù)孔，各組加入勝紅薊總黃酮溶液，使其分別成為終濃度400、200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL，設(shè)置不接種細(xì)胞的各藥物濃度對照，以營養(yǎng)液為空白組，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h.每次孵育結(jié)束后，在每孔加入10 μL CCK8 溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，取出適當(dāng)混勻，繼續(xù)孵育2 h后在450 nm測定吸光度，計算細(xì)胞生長抑制率.

其中：A1為處理組吸光值；A2為處理組對照（即加藥液未加細(xì)胞）；A3為對照（即加細(xì)胞未加藥液）；A0為空白（即只加營養(yǎng)液）.

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 勝紅薊總黃酮抗氧化能力測定

2.1.1 總抗氧化能力測定

按照試劑盒要求進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，得到圖1（A）的吸光值y與總抗氧化能力濃度x的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.683 6x+0.000 3,R2=0.999.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同勝紅薊總黃酮的總抗氧化能力得到圖1(Β)，勝紅薊總黃酮的總抗氧化能力隨著勝紅薊總黃酮質(zhì)量濃度(ρ)的升高而增強，其中0.1 mg/mL 勝紅薊總黃酮總抗氧化能力（（5.37±1.33）U/mL）與0.05 mg/mL VC的((6.92±0.87)U/mL)無顯著差異（F=0.643,t=0.970,p=0.387,df=4）；當(dāng)勝紅薊總黃酮濃度達(dá)到0.8 mg/mL時，其總抗氧化能力與0.25 mg/mL的VC無顯著差異（F=6.565,t=1.615,p=0.169,df=4）.

圖1 勝紅薊總黃酮總抗氧化能力Fig.1 Total antioxidant capacity of total flavonoids from Ageratum conyzoides L.

2.1.2 超氧陰離子清除能力

勝紅薊總黃酮對超氧陰離子的清除能力試驗結(jié)果如圖2所示，勝紅薊總黃酮對超氧陰離子的清除能力隨著濃度變化具雙向性.在其濃度達(dá)到1 mg/mL時，超氧陰離子清除率最高為（72±1.68）%，與0.5 mg/mL時的清除率無顯著性差異（F=10.521,t=0.717,df=4,P=0.513），與其它各處理組差異顯著（P＜0.05）.其對超氧陰離子的清除率比0.25 mg/mL VC的清除率（86.67±4.91）%低，且差異顯著（F=7.397,t=4.821,df=4,P=0.009）.另外，勝紅薊總黃酮含量為0.2 與1.5 mg/mL 的兩組處理，超氧陰離子清除能力差異不顯著（F=0.427,t=0.486,df=4,P=0.652），0.2 與0.5 mg/mL處理組差異不顯著，但與1 mg/mL處理組差異顯著（P＜0.05）.

圖2 勝紅薊總黃酮對超氧陰離子的清除能力Fig.2 Superoxide anion scavenging activity of total flavonoids from Ageratum conyzoides L.

2.1.3 羥自由基清除率

勝紅薊總黃酮對羥自由基的清除能力強，如圖3所示.勝紅薊總黃酮濃度為1.8 mg/mL 時清除率最穩(wěn)定，達(dá)到（99.48±0.40）%，與VC 0.25 mg/mL 的清除率（39.88±9.06）%比較，差異顯著（F=10.94,t=6.97,df=10,P＜0.001）.

圖3 勝紅薊總黃酮對羥自由基的清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activity of total flavonoids from Ageratum conyzoides L.

2.1.4 DPPH自由基清除率

不同濃度勝紅薊總黃酮對DPPH 自由基的動態(tài)清除效果區(qū)別比較明顯，其清除能力具有濃度依賴，6個濃度的動態(tài)清除曲線都在60 min 后到達(dá)平臺期.當(dāng)勝紅薊總黃酮濃度達(dá)到0.2 mg/mL 時其動態(tài)清除曲線在10～20 min區(qū)間基本與0.25 mg/mL 的VC的動態(tài)清除曲線重合，在30 min后清除率超過VC.

勝紅薊總黃酮在不同溫度下對DPPH 自由基的清除能力不同，但是都隨著時間的推移在增加，而VC的清除能力則比較恒定，如圖4 中的Β.溫度在40℃時，1.0 mg/mL 處理組的清除能力最強，25 ℃時，其清除能力最低，30和35 ℃的清除能力相當(dāng)，在反應(yīng)30 min后其清除率幾乎相同.

圖4 勝紅薊總黃酮對DPPH自由基的清除能力Fig.4 DPPH scavenging activity of total flavonoids from Ageratum conyzoides L.

2.2 勝紅薊總黃酮對血液腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用

用不同濃度勝紅薊總黃酮對三株白血病細(xì)胞株分別進(jìn)行24、48、72 h 處理，運用CCK8 法測定細(xì)胞的增殖抑制率得到如圖5～7所示.三株細(xì)胞株的增殖抑制率對總黃酮均具有濃度依賴，在12.5 μg/mL處理組抑制率急劇上升，超過25 μg/mL 之后抑制率到達(dá)90%以上.勝紅薊總黃酮對KGIA 細(xì)胞系的抑制率對時間處理具有依賴性，在任一組濃度處理組中，經(jīng)過24、48、72 h處理后其抑制率存在一定的梯度變化(圖6).而THP-1和Kasumi-1兩株細(xì)胞株的抑制率在低濃度時與時間處理有差異，高濃度無差異（P＜0.05）.

圖5 勝紅薊總黃酮對人單核細(xì)胞型白血病細(xì)胞株THP-1的增殖抑制作用Fig.5 Inhibitory effect on THP-1 Cells of total flavonoids from Ageratum conyzoides L.

圖6 勝紅薊總黃酮對人急性髓系白血病細(xì)胞株KGIA的增殖抑制作用Fig.6 Inhibitory effect on KGIA Cells of total flavonoids from Ageratum conyzoides L.

圖7 勝紅薊總黃酮對人急性髓系白血病細(xì)胞株Kasumi-1的增殖抑制作用Fig.7 Inhibitory effect on Kasumi-1 Cells of total flavonoids from Ageratum conyzoides L.

通過對各細(xì)胞株不同時間組的抑制率進(jìn)行曲線擬合得到曲線如表1，通過曲線求出各細(xì)胞株不同時間處理的IC50 如圖8 所示.勝紅薊總黃酮對三株細(xì)胞的抑制作用明顯，致死中濃度在11 μg/mL 以內(nèi).其對KGIA 和Kasumi-1 細(xì)胞株的影響隨著時間的推移，濃度下降，處理72 h 的時候，致死中濃度低至3.86 μg/mL 和3.18μg/mL.對于THP-1 的影響符合邏輯斯蒂規(guī)律，48 h 和72 h 的致死中濃度相差不大，分別為9.01 μg/mL 和9.31 μg/mL.

表1 白血病細(xì)胞株不同時間處理后抑制率擬合曲線Tab.1 Fitted curves of inhibition rate of leukemia cell lines treated with different time

圖8 勝紅薊總黃酮對三株白血病細(xì)胞株的IC50Fig.8 IC50 of total flavonoids from Ageratum conyzoides L.on the three leukemic cell lines

3 小結(jié)與討論

目前根據(jù)文獻(xiàn)檢索，尚未見到報道勝紅薊總黃酮的抗氧化活性研究.植物黃酮具有良好的抗氧化活性[8-9]，勝紅薊總黃酮的抗氧化活性測定結(jié)果也證實了這一觀點.

勝紅薊總黃酮的DPPH 清除能力強，僅需含量為0.2 mg/mL 就能達(dá)到與0.25 mg/mL 維生素C 的清除能力，早在2013年黃宏妙等[10]就研究過勝紅薊的抗氧化活性，其揮發(fā)油具有良好的DPPH 清除能力，這與本次試驗結(jié)果相吻合.勝紅薊總黃酮0.1mg/mL 溶液與0.05 mg/mL 的VC 溶液總抗氧化能力無差異（P＜0.05）、1.8 mg/mL 的勝紅薊總黃酮溶液清除羥自由基的能力高達(dá)（99.48±0.40）%，1 mg/mL 的勝紅薊總黃酮對超氧陰離子的清除能力最強，往低濃度有濃度依賴的趨勢，往高濃度則相反.

Β環(huán)上的酚羥基被認(rèn)為是抗氧化的主要活性基團(tuán)，而A環(huán)上的3,5位上的酚羥基以及4位上的羰基對于形成穩(wěn)定的自由基中間體起到很重要的作用[11].勝紅薊多種黃酮的Β 環(huán)上含有酚羥基、A 環(huán)上的3,5 號位含有酚羥基以及大部分黃酮A 環(huán)4 號位上含有羰基[12]，可能是這些酚羥基能夠與自由基結(jié)合形成穩(wěn)定的半醌結(jié)構(gòu)，阻止其發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性.這些結(jié)果都說明勝紅薊資源利用可通過利用其抗氧化活性來實現(xiàn).

有學(xué)者認(rèn)為黃酮的抗氧化活性能通過抑制脂質(zhì)的過氧化所致的細(xì)胞破壞而達(dá)到抗癌抗腫瘤作用[13-14].研究結(jié)果表明勝紅薊總黃酮對三株白血病細(xì)胞株THP-1、KAIG 和Kasumi-1 細(xì)胞株的抑制效果好.Kasumi-1細(xì)胞株增殖抑制率對勝紅薊總黃酮具有濃度依賴，與其他植物黃酮對其增殖抑制率具有劑量依賴的結(jié)果相同.由此可見，勝紅薊總黃酮具有抗氧化作用所以能夠抗癌.勝紅薊提取物曾被報道對幾種腫瘤細(xì)胞具有抑制活性[6,15]，但這幾種細(xì)胞均為貼壁細(xì)胞，雖與本次研究的白血病細(xì)胞株屬不同類型細(xì)胞，但也從側(cè)面證實了勝紅薊總黃酮能夠抗癌.因此抗癌活性也是可以作為勝紅薊資源利用的另一途徑.

綜上所述，勝紅薊總黃酮的抗氧化活性和抗腫瘤活性也可成為勝紅薊化廢為寶[16]的另一依據(jù).