楊開智 梁 丹 黃生林
(常德市畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心,湖南 常德 415000)
磺胺類(Sulfonamides,SAs)藥物為常見的合成抗菌劑,主要用于預(yù)防和治療細(xì)菌性感染疾病,具有抗菌譜廣、低毒高效、組織穿透力強(qiáng),并且價(jià)格低廉等特點(diǎn),在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到普遍的使用。但這類藥物的大量使用會(huì)導(dǎo)致在水產(chǎn)品中的殘留,進(jìn)而通過食物鏈危害人類的健康。SAs藥物對(duì)人體腎臟和肝臟有損害的毒副作用,破壞人的造血系統(tǒng),引起溶血性貧血癥,而磺胺二甲基嘧啶甚至有潛在的致癌可能。同時(shí)這兩類藥物在養(yǎng)殖中大量的使用,均容易使病原體產(chǎn)生耐藥性[1]。
目前測(cè)定動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[2-3]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[4-5]。液相色譜法一般使用紫外和熒光檢測(cè)器,由于動(dòng)物源性食品中蛋白質(zhì)和脂肪含量較高、基質(zhì)復(fù)雜等原因,采用該方法容易受雜質(zhì)影響,并且分析時(shí)間較長(zhǎng),較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近年來,對(duì)這兩類藥物殘留同時(shí)檢測(cè)的報(bào)道也越來越多,但是大部分集中在畜禽組織和牛奶中。
本文針對(duì)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品檢測(cè)中心在水產(chǎn)品例行監(jiān)測(cè)中經(jīng)常檢測(cè)的8 種磺胺類藥物建立了同時(shí)測(cè)定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,該方法提高了色譜分析的功效,簡(jiǎn)單快速,靈敏度高,而且節(jié)約成本,能實(shí)現(xiàn)藥物殘留的快速檢測(cè),適合水產(chǎn)品當(dāng)中磺胺類藥物的殘留檢測(cè)。
Thermo TSQ Quantum 液相色譜- 高分辨串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀,配用電噴霧離子(ESI)源(Thermo 公司)。超聲波清洗器(昆山超聲波儀器廠),平行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi(布奇)公司),高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司),微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠),精密電子天平(梅特勒—托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司)。
磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品(磺胺噻唑、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺多辛、磺胺嘧啶、磺胺二甲異惡唑、磺胺喹惡啉)以及內(nèi)標(biāo)物(氘代磺胺間二甲氧嘧啶、氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶) 的純度不低于99.8%;甲醇、甲酸、醋酸銨均為色譜純(美國(guó)Tedia 公司);無(wú)水硫酸鈉:分析純,于650 ℃下灼燒4 h 后儲(chǔ)存于干燥器中備用。
標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配置:分別稱取磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg,用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容配置成100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,在-18 ℃下避光保存。使用時(shí)將上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合,用甲醇稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液及使用液的配置:分別稱取10.0 mg 各內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容,配成100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,在-18 ℃下避光保存。準(zhǔn)確吸取各內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,用甲醇逐級(jí)稀釋配成1.0mg/L 的混合內(nèi)標(biāo)使用液,在-18 ℃下避光保存。
1.2.1 色譜條件
色譜柱為Capcell Pak C18(MGⅡ,150 mm×2.1 mm,5 μm);柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為10μL,流動(dòng)相A 為甲醇;B 為2 mmoL/L 的乙酸銨溶液(含0.1%的甲酸);梯度洗脫程序?yàn)椋?-6 min,10%A-60%A;6-8 min,60%A-80%A;8-13 min,80%A-90%A;13-14 min,90%A-10%A,并保持2 min;流速為250 μL/min。
1.2.2 質(zhì)譜條件
采用大氣壓電噴霧離子源(ESI),正離子模式;噴霧電壓為4 000 V;離子傳輸毛細(xì)管溫度為350 ℃,Q1 半峰寬為0.7Da;Q3 半峰寬為0.7Da;碰撞氣氬氣壓力為1.5 mTorr;鞘氣流量為10 L/min;輔助氣流量為2 L/min;采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM),各種磺胺類藥物的母離子、子離子和碰撞能量見表1。
表1 10 種藥物的SRM 采集參數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線
稱取5 g 樣品(精確至0.01 g)至于離心管中,加入10 g 烘干備用的無(wú)水硫酸鈉后,立刻用玻璃棒攪勻,然后加入20 mL 乙腈提取液,在漩渦混合儀上充分混合1 min,然后再超聲振蕩20 min,平衡后放入離心機(jī)5 000 r/min 離心10 min 待分層,吸取上層清液至100 mL 雞心瓶中,重復(fù)加20 mL 乙腈提取液提取一次,合并乙腈提取液,于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。準(zhǔn)確加入1.0 mL 甲醇-2 mmol/L 乙酸銨溶液(2∶8,V:V,含0.1%甲酸)溶解殘?jiān)?,為了防止脂肪和雜質(zhì)的影響,加入2.0 mL 正己烷去脂,漩渦混勻1 min,取下層液體過0.22 μm 濾膜,供液質(zhì)聯(lián)用儀分析。
由于水產(chǎn)品成分比較復(fù)雜,基質(zhì)中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及色素等雜質(zhì)。本文比較了乙腈和正己烷兩種提取液,兩種提取液回收率均滿足要求,但是由于正己烷對(duì)脂肪溶解度大,容易造成對(duì)質(zhì)譜的污染。而乙腈能提取大多數(shù)目標(biāo)物,并且提取效果好,乙腈使蛋白質(zhì)變性凝結(jié)沉淀下來后通過離心除去;前處理中加入無(wú)水硫酸鈉是為了有效除去水產(chǎn)品基質(zhì)當(dāng)中含有的水分,同時(shí)無(wú)水硫酸鈉還可以促使使蛋白質(zhì)變性分散,防止樣品結(jié)成塊狀影響提取效果;最后加入正己烷可溶解一些脂肪、蛋白質(zhì)和色素,經(jīng)離心后除去,過0.22 μm 濾膜后溶液清亮,回收率實(shí)驗(yàn)滿足要求。
本文對(duì)定容溶液進(jìn)行了選擇,有研究采用甲醇-水(2∶8,V:V)進(jìn)行定容[6],本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用甲醇- 水(2∶8,V:V) 定容時(shí),溶液渾濁,但進(jìn)樣后峰形不尖銳,有加合峰,分叉峰出現(xiàn),信號(hào)靈敏度下降,保留時(shí)間不穩(wěn)定;經(jīng)多次試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)采用甲醇-2 mmol/L 乙酸銨溶液(2∶8,V:V,含0.1%甲酸)定容,溶液澄清,進(jìn)樣后色譜峰峰形尖銳,對(duì)稱性好,保留時(shí)間穩(wěn)定,回收率也滿足分析要求。因此本文采用甲醇-2 mmol/L 乙酸銨溶液(2∶8,V:V,含0.1%甲酸)作為定容溶液。
流動(dòng)相的PH 值會(huì)影響磺胺類藥物在色譜柱中的分離。本實(shí)驗(yàn)比對(duì)了甲醇-水,甲醇-甲酸水溶液(0.1%),甲醇-乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)三種不同的流動(dòng)相。當(dāng)采用甲醇-水為流動(dòng)相時(shí),各種磺胺類藥物幾乎在同一時(shí)間被洗脫,而且出峰時(shí)間極短,大概在1min 之內(nèi)出峰,這可能是由于磺胺類藥物在中性流動(dòng)相中具有相同的保留因子,而出峰時(shí)間太快對(duì)質(zhì)譜會(huì)造成污染;當(dāng)采用甲醇-甲酸水溶液(0.1%)作為流動(dòng)相時(shí),各種目標(biāo)物峰形得到了較大的改善,保留時(shí)間也較穩(wěn)定,但SAs 中幾種目標(biāo)物出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,峰形不夠尖銳;本實(shí)驗(yàn)考慮采用揮發(fā)性電解質(zhì)乙酸銨來做為流動(dòng)相,同時(shí)加入0.1%甲酸控制流動(dòng)相PH 值,采用合適的梯度洗脫程序,不但很好的實(shí)現(xiàn)了各種目標(biāo)物的分離,并且得到了比較理想的色譜峰,峰形尖銳且對(duì)稱性好,增大了分子離子峰的峰強(qiáng)度。見下圖1。
圖1 空白基質(zhì)中10.0μg/kg 磺胺類藥物加標(biāo)樣品離子色譜圖
根據(jù)目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)特征,選擇ESI 正離子電離模式對(duì)1.0 mg/L 的8 種磺胺類混合標(biāo)液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描分析,m/z 掃描范圍為200-400 之間,得到每種藥物的分子離子,然后以該分子離子為母離子,進(jìn)行子離子掃描,選取豐度最強(qiáng)的碎片離子為定量離子,豐度次強(qiáng)的碎片離子為定性離子。在此基礎(chǔ)上對(duì)錐孔電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化,使選定的母離子和子離子組成的特征離子的豐度和比例達(dá)到最佳。得到1.2.2 中最佳質(zhì)譜條件。
磺胺二甲異惡唑、磺胺喹惡啉以氘代磺胺間二甲氧嘧啶為內(nèi)標(biāo);磺胺噻唑、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺多辛、磺胺嘧啶以氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶為內(nèi)標(biāo)。配置10.0-500.0 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值Y 為縱坐標(biāo),工作溶液的質(zhì)量濃度X(μg/L)為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明,各種SAs 的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)符合要求,見表1。
在空白樣品基質(zhì)中添加8 種磺胺類藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以每種目標(biāo)峰高的信噪比(S/N)大于5 確定為方法的檢出限,信噪比(S/N) 大于10 確定為方法的定量限,9 種SAs 的檢出限(LOD) 為1.0 μg/kg,定量限(LOQ)為2.0 μg/kg,表明該方法滿足國(guó)家對(duì)水產(chǎn)品檢測(cè)的要求。
在空白樣品中添加5、10、50μg/kg 三個(gè)水平的添加實(shí)驗(yàn),每個(gè)添加水平進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn),每次平行測(cè)定6 次,按1.2 節(jié)所述條件進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),所得回收率結(jié)果為69.5%-121.9%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%-14.6%,符合國(guó)內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求[7],結(jié)果見表2。
表2 8 種藥物在空白樣品中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs,n=6)
運(yùn)用本文建立的方法對(duì)市場(chǎng)中的20 個(gè)水產(chǎn)品樣品進(jìn)行了分析檢測(cè)。結(jié)果表明:該方法簡(jiǎn)單、快速,具有很好的適用性和可操作性,譜圖無(wú)干擾,樣品中未檢出9 種SAs 藥物。
本方法適用于各種不同基質(zhì)的水產(chǎn)品及其制品中磺胺類藥物的測(cè)定,前處理方法步驟簡(jiǎn)單、試劑用量少、回收率穩(wěn)定、精密度好,方法的定量限為2.0μg/kg,滿足我國(guó)以及歐盟等國(guó)家的限量要求,可以作為水產(chǎn)品及制品中磺胺類藥物的檢測(cè)方法,并可為該類藥物在水產(chǎn)品中的消除規(guī)律及毒理評(píng)價(jià)提供靈敏、準(zhǔn)確的分析手段,為水產(chǎn)品的安全工作提供了有力的保障。