劉曉飛，劉 晶，王傳洗*，王震宇

1.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122

2.江南大學(xué)環(huán)境過(guò)程與污染控制研究所，江蘇無(wú)錫 214122

硒(Se)是人體必不可少的微量元素之一，被稱為“生命的保護(hù)劑”[1].人體想要補(bǔ)充Se元素，目前被承認(rèn)的最健康的方法是飲食補(bǔ)Se[2].然而，我國(guó)屬于低Se地帶，容易導(dǎo)致作物富Se量不足[3].發(fā)展富Se農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)成為農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的重要措施[4].常見(jiàn)的傳統(tǒng)Se肥(如亞硒酸鈉)容易被土壤固定，最終導(dǎo)致植物對(duì)Se的利用率較低，殘留在土壤中的Se對(duì)環(huán)境和人體健康都存在一定威脅[5].硒納米顆粒(Se NPs)的出現(xiàn)打破了僵局，低毒性和高生物活性等特性使其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注[6-7].

近年來(lái)，以納米顆粒(NPs)生產(chǎn)的納米肥料、納米農(nóng)藥、納米農(nóng)業(yè)傳感器等新穎納米農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，在提高作物產(chǎn)量、提升作物品質(zhì)和降低病蟲害等方面已經(jīng)顯現(xiàn)出巨大潛力[8-10]. NPs在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用受到了全世界學(xué)者前所未有的關(guān)注[11-12].已有研究表明，Se NPs可用于改善茶葉的品質(zhì)，與對(duì)照相比，Se NPs(10 mg/L)顯著提高了蛋白質(zhì)、可溶性糖、類胡蘿卜素、茶多酚和兒茶素的含量[6].Li等[13]發(fā)現(xiàn)，葉施Se NPs(20 mg/L)可以激活苯丙烷和支鏈脂肪酸途徑以及相關(guān)酶和基因表達(dá)，促進(jìn)辣椒中辣椒素、類黃酮和總酚的合成，這些化合物具有抗炎、抗癌、抗氧化等保健功能.同時(shí)，筆者所在課題組的近期(2022年)盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，土壤施加Se NPs(0.5 mg/kg)能夠增加油菜根際有益微生物的豐度及低分子量有機(jī)酸的含量，從而提高了土壤中養(yǎng)分的釋放，促進(jìn)植物對(duì)這些養(yǎng)分的吸收；同時(shí)，根系低分子量有機(jī)酸能夠減少Se NPs在土壤中的固持，促進(jìn)Se在作物內(nèi)的吸收[14].然而，目前的研究大多在盆栽中進(jìn)行.田間真實(shí)復(fù)雜環(huán)境下，Se NPs促進(jìn)作物生長(zhǎng)及品質(zhì)的肥料效應(yīng)研究較少.

該研究以小油菜和生菜兩種作物為研究對(duì)象，通過(guò)比較傳統(tǒng)Se肥(亞硒酸鈉)和Se NPs對(duì)兩種作物生長(zhǎng)、富Se情況的影響，研究Se NPs對(duì)葉菜類作物促生和富Se的普適性，并探究Se NPs可能對(duì)土壤環(huán)境產(chǎn)生的影響，以期為Se NPs作為新型Se肥在農(nóng)田應(yīng)用中的可行性做進(jìn)一步了解.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小油菜種子購(gòu)自合肥合豐種業(yè)有限公司，發(fā)芽率不低于85%.供試生菜種子購(gòu)自河北茂華種業(yè)有限公司，發(fā)芽率不低于85%.

Se NPs通過(guò)固相還原法制備[15].Se NPs的形貌和粒徑通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM，JEM-2100，日本)觀察測(cè)定，表面電荷由納米粒度儀(Nano ZS90，馬爾文，英國(guó))測(cè)定獲得.

透射電子顯微鏡視野下，Se NPs的形貌呈球形〔見(jiàn)圖1(a)〕；對(duì)Se NPs的粒徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，其粒徑主要分布在30~40 nm之間.Se NPs的Zeta電位在?31.45 mV左右〔見(jiàn)圖1(b)〕.傳統(tǒng)Se肥選擇亞硒酸鈉(Na2SeO3含量≥98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).

圖1 Se NPs的透射電鏡圖和Zeta電位Fig.1 TEM and Zeta potential of Se NPs

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)分別在江蘇省無(wú)錫市濱湖區(qū)馬山街道(小油菜，試驗(yàn)區(qū)海拔為3.4 m，地理位置31.4°N、120.1°E，單個(gè)小區(qū)面積為1 m×1 m，總面積為4 m×5 m)和江蘇省蘇州市昆山市千燈鎮(zhèn)(生菜，試驗(yàn)區(qū)海拔為5.7 m，地理位置31.4°N、120.9°E，單個(gè)小區(qū)面積為1 m×1 m，總面積為7 m×10 m)進(jìn)行，種植過(guò)程不施加化肥，田間土壤理化性質(zhì)見(jiàn)表1.土施濃度根據(jù)已有研究[16]設(shè)置為0.05 mg/kg，分別設(shè)置無(wú)任何添加(CK)、添加Se NPs和添加亞硒酸鈉(圖表中表示為Selenite)共3個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次.

表1 無(wú)錫濱湖區(qū)和蘇州昆山市的田間土壤理化性質(zhì)Table1 Physical and chemical properties of field soils in Binhu (Wuxi)and Kunshan (Suzhou)

1.3 測(cè)定方法

使用根掃儀(WinRHIZO Pro 2017b，Regent，加拿大)分析小油菜和生菜的根系參數(shù)(根長(zhǎng)、根表面積、根體積).小油菜和生菜的生物量以每株地上部的鮮質(zhì)量表示.

將干燥樣品(植物樣品25 mg，土壤樣品15 mg)與3 mL去離子水和3 mL濃硝酸(GR，65%~68%)混合，在微波消解反應(yīng)系統(tǒng)(Mars 6，CEM，美國(guó))中消化.用0.22μm的微孔膜過(guò)濾后，用去離子水稀釋至50 mL，待測(cè).采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS，iCAP-TQ，Thermo Fisher，美國(guó))分析不同處理下植物組織和土壤中元素(P、K、Fe、Cu、Zn、Mn、Mo和Se)的含量[17].標(biāo)準(zhǔn)曲線采用國(guó)家有色金屬與電子材料分析測(cè)試中心(GNM-M203814-2013)的多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液配置，內(nèi)標(biāo)元素為鍺Ge(GSB 04-2826-2011，國(guó)家有色金屬與電子材料分析測(cè)試中心)，各元素的加標(biāo)回收率在84.9%~102.9%之間，儀器運(yùn)行穩(wěn)定.葉片和土壤中TOC、TN含量由元素分析儀(UNICUBE，ELEMENTAR，德國(guó))測(cè)定[18].

采用2,6-二氯靛酚滴定法[19]測(cè)定小油菜葉片中的抗壞血酸(Vc)含量.

將50 mg新鮮葉片在液氮中均勻研磨，置于2 mL離心管中，加入1.5 mL 80%甲醇水溶液(含0.1%甲酸和內(nèi)標(biāo)液)進(jìn)行渦流混合.冰浴超聲30 min(35 kHz)后，將上清液(12 000 r/min，4℃)離心15 min.用離心濃縮機(jī)真空干燥上清液，再溶于200μL的復(fù)溶液(V甲醇∶V乙腈∶V水=4∶4∶2)中. 離心(12 000 r/min，4℃)10 min得到上清液，?20℃下保存待測(cè).以L-2氯苯丙氨酸為內(nèi)標(biāo)，取各樣品等量混合均勻作為質(zhì)控樣品(QC).采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS，Thermo Fisher，德國(guó))分析代謝產(chǎn)物[20-21].

1.4 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用OriginPro 2019b程序進(jìn)行制圖.采用單因素方差分析比較不同處理之間的差異.分析結(jié)果采用Fisher/Tukey檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.采用Compound Discoverer software 3.1和Metabo Analyst(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml)進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 Se NPs對(duì)小油菜和生菜生物量的影響

在農(nóng)田生態(tài)環(huán)境中土施Se NPs(0.05 mg/kg)可促進(jìn)小油菜的生長(zhǎng).與CK相比，Se NPs可以顯著提高小油菜的根長(zhǎng)、根表面積、根體積以及生物量，其中根表面積和根體積分別提高了47.4%和52.0%〔見(jiàn)圖2(A)~(C)〕，小油菜的地上可食用部位的鮮質(zhì)量較CK增加了108.2%〔見(jiàn)圖2(D)〕.

將Se NPs應(yīng)用于土施培養(yǎng)生菜，發(fā)現(xiàn)Se NPs同樣促進(jìn)了生菜的生長(zhǎng).Se NPs可促進(jìn)生菜根系的生長(zhǎng)，與CK相比，根長(zhǎng)、根表面積和根體積分別提高了53.8%、74.7%和85.7%〔見(jiàn)圖2(A)~(C)〕，地上部鮮質(zhì)量增加了90.9%〔見(jiàn)圖2(D)〕.因此，農(nóng)田環(huán)境中施用Se NPs提高葉菜類作物生物量是可行的，然而農(nóng)田環(huán)境中施用同濃度的亞硒酸鈉對(duì)葉菜類作物的促生效果并不理想.在施用亞硒酸鈉后，生菜和小油菜的根長(zhǎng)、根表面積以及生物量與CK相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，只有生菜的根體積在施用亞硒酸鈉后與CK相比增加了79.1%.因此與亞硒酸鈉相比，土施Se NPs對(duì)葉菜類作物的促生效果更顯著.

圖2 Se NPs和亞硒酸鈉對(duì)葉菜類作物生長(zhǎng)情況的影響Fig.2 Effects of Se NPs and sodium selenite on the growth of Brassica chinensis L.(rapeseed)and Lactuca sativa L.var.ramosa Hort (lettuce)

2.2 農(nóng)田環(huán)境中Se NPs對(duì)小油菜和生菜微量元素的影響

施用Se NPs可以促進(jìn)葉菜類作物中微量元素的積累.與CK相比，Se NPs處理組小油菜葉片中Fe、Cu、Zn、Mn、Mo和Se的含量分別提高了48.1%、18.9%、38.7%、9.6%、102.6%和185.7%；同樣，生菜葉片中Cu、Zn、Mn、Mo和Se的含量分別提高了8.5%、28.6%、72.2%、51.9%和60.4%(見(jiàn)表2).Fe和Mn均是光合作用的重要元素，F(xiàn)e是植物體葉綠素合成的重要元素[22]，Mn是光系統(tǒng)Ⅱ中四錳團(tuán)簇(Mn4)的必需元素，在光合作用放氧反應(yīng)中起到重要作用[23].因此，農(nóng)田環(huán)境中Se NPs可以通過(guò)分別調(diào)控小油菜和生菜對(duì)Fe和Mn的積累，對(duì)光合作用產(chǎn)生影響，最終促進(jìn)生物量的提升.

表2 Se NPs對(duì)農(nóng)田環(huán)境中小油菜和生菜微量元素的影響Table2 Effectsof Se NPs on trace elements of rapeseed and lettuce in farmland environment

此外，在土施Se NPs后，小油菜中Se含量增加了200.9μg/kg，而生菜中Se含量增加了119.2μg/kg，這可能是受到了土壤有機(jī)質(zhì)的影響.土壤中的有機(jī)質(zhì)可以增加土壤表面的負(fù)電荷量，降低負(fù)電荷Se NPs被土壤吸附固定的可能性[24].無(wú)錫濱湖大田(青菜)中土壤有機(jī)質(zhì)含量高于江蘇昆山大田(生菜)，其土壤中Se NPs不容易被固定，具有較高的有效性；此外，植物吸收硒還與植物種類有關(guān)，一般作物中十字花科植物對(duì)硒的積累能力最強(qiáng)[25]，這也可能是小油菜富硒效果更好的原因.

2.3 農(nóng)田環(huán)境中Se NPs對(duì)小油菜和生菜營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

2.3.1 Se NPs對(duì)小油菜和生菜葉片Vc含量的影響

土施Se NPs可以促進(jìn)葉菜類作物葉片中Vc水平的提高(見(jiàn)圖3).結(jié)果表明，農(nóng)田環(huán)境中土施Se NPs使小油菜Vc含量提高了127.5%，其次，亞硒酸鈉也在一定程度上提高了小油菜的Vc含量；同樣，Se NPs使生菜的Vc含量提高了約23.1%.研究發(fā)現(xiàn)，生菜中的Vc水平低于小油菜中的Vc水平，這可能與葉片中的Se含量有關(guān)(Se更容易在小油菜中富集).研究表明，Se NPs能夠促進(jìn)小油菜的光合作用，增加Vc的含量[24].

圖3 Se NPs對(duì)小油菜和生菜Vc含量的影響Fig.3 Effectsof Se NPs on Vc content in rapeseed and lettuce

2.3.2 農(nóng)田環(huán)境中的小油菜葉片代謝組學(xué)分析

通過(guò)上述分析可知，與生菜相比，小油菜的相關(guān)生理生化以及代謝指標(biāo)可能變化更顯著.因此，該研究以小油菜為研究對(duì)象，利用代謝組學(xué)分析方法詳細(xì)分析Se NPs對(duì)葉菜類作物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響.如圖4所示，小油菜的代謝產(chǎn)物主要?dú)w屬于氨基酸代謝途徑(24.3%)和類黃酮代謝途徑(6.8%).此外，與CK相比，Se NPs處理后的小油菜中歸屬于氨基酸和類黃酮代謝途徑的代謝產(chǎn)物相對(duì)豐度分別提高了22.7%和37.1%(見(jiàn)圖5).

圖4 小油菜葉片中代謝產(chǎn)物的分類Fig.4 Classification of metabolites in leaves of rapeseed

圖5 小油菜葉片中氨基酸和類黃酮的相對(duì)豐度Fig.5 Total relativeabundance of amino acidsand flavonoids in leavesof rapeseed

氨基酸和類黃酮對(duì)人體健康有極大的益處[26].對(duì)小油菜代謝產(chǎn)物中幾種氨基酸的分析發(fā)現(xiàn)，與CK相比，施用Se NPs處理組的小油菜中苯丙氨酸、蘇氨酸和纈氨酸的相對(duì)豐度分別提高了26.8%、31.6%和39.1%〔見(jiàn)圖6(A)〕.同樣，小油菜經(jīng)過(guò)Se NPs處理后，葉片中的槲皮素、山奈酚和異鼠李素等三種類黃酮的相對(duì)豐度分別較CK提高了206.0%、100.4%和41.8%〔見(jiàn)圖6(B)〕.這些化合物具有抗炎、抗癌、抗氧化等保健功能[27].綜上，施用Se NP可以分別提高小油菜的4種代謝途徑(氨基酸，黃酮類化合物，脂肪酸及其共軛物，以及TCA酸類化合物)中代謝物的相對(duì)豐度，提升了其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，有利于促進(jìn)人體健康發(fā)展.

圖6 Se NPs對(duì)小油菜中3種氨基酸和類黃酮相對(duì)豐度的影響Fig.6 Effectsof Se NPs on the relative abundanceof three amino acids and flavonoidsin rapeseed

2.4 農(nóng)田施用Se NPs對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

為了符合農(nóng)田的可持續(xù)發(fā)展，減少對(duì)農(nóng)用土地的污染，將Se NPs推廣到農(nóng)田，需要考慮到Se NPs施用對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響.對(duì)比無(wú)錫濱湖區(qū)大田(小油菜)和江蘇昆山市大田(生菜)施用Se NPs后的土壤理化性質(zhì)(見(jiàn)表3)發(fā)現(xiàn)，與CK相比，土壤pH和TOC含量都沒(méi)有明顯變化.

表3 小油菜、生菜收獲后土壤的理化性質(zhì)Table3 Soil physicochemical properties of rapeseed and lettuce after harvest

這與已有的盆栽試驗(yàn)結(jié)果存在差異，Wang等[14]發(fā)現(xiàn)，Se NPs可以引起根際土壤中有機(jī)質(zhì)含量的增加以及土壤pH的降低.因此，導(dǎo)致農(nóng)田和盆栽試驗(yàn)最終的土壤性質(zhì)存在差異的原因可能是，較低的pH使得土壤具有良好的酸堿緩沖能力[28]，復(fù)雜的農(nóng)田生態(tài)環(huán)境會(huì)引起進(jìn)入土壤中的有機(jī)質(zhì)分解速度加快[29].但是Se NPs處理組的土壤TN含量有了一定程度的降低，這與前期盆栽結(jié)果[14]一致.SeNPs的施用可能改善了土壤微環(huán)境，活化土壤養(yǎng)分并提高了葉菜類作物對(duì)其的吸收.這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Se NPs在減少農(nóng)用氮肥成本以及減輕環(huán)境污染方面的優(yōu)勢(shì).此外，更需要關(guān)注的是，與傳統(tǒng)Se肥(亞硒酸鈉)對(duì)比，Se NPs施用后的土壤中Se殘留量更低，這也說(shuō)明更多的Se被植物有效吸收和利用，降低了Se殘留在土壤中可能造成的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn).

3 結(jié)論

a)與傳統(tǒng)Se肥(亞硒酸鈉)對(duì)比，農(nóng)田施加硒納米顆粒(Se NPs)顯著促進(jìn)了兩類葉菜作物(小油菜和生菜)的根系生長(zhǎng)，增加了作物對(duì)土壤微量元素的吸收，進(jìn)而提升了葉菜類作物的光合作用和生物量.

b)與傳統(tǒng)Se肥對(duì)比，農(nóng)田施加Se NPs不僅使得葉菜類作物含Se量更高，而且顯著提高了葉菜類作物的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，有助于改善人體健康.

c)與傳統(tǒng)Se肥對(duì)比，Se NPs的施用可以降低土壤中的Se殘留量，提高氮素利用率，達(dá)到減輕環(huán)境污染、降低環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的目的.