高 杰 ，郭華陽 ，劉明鑒 ，劉寶鎖 ，朱克誠 ，張 楠 ，郭 梁 ，張殿昌 ,

1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066003

2. 三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南 三亞 572019

3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

4. 廣東省海洋生物種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510300

無乳鏈球菌 (Streptococcus agalactiae) 也稱B族鏈球菌 (Group B Streptococcus, GBS)，是一種人、魚共患的革蘭氏陽性菌[1]。與許多其他致病菌一樣，無乳鏈球菌具有許多毒力因子可提高病原體感染或破壞宿主的能力[2]，其毒力因子可通過影響宿主細(xì)胞的黏附和侵襲以逃避宿主免疫[3]，從而有效削弱機(jī)體免疫系統(tǒng)和新陳代謝過程中誘發(fā)的生理變化[4]，嚴(yán)重時(shí)會(huì)降低機(jī)體的先天防御力，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體死亡。作為一種由病原菌引起的常見疾病，鏈球菌病在羅非魚養(yǎng)殖中具有破壞性影響[5]。2019年，無乳鏈球菌和海豚鏈球菌 (S. iniae) 給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失約達(dá)25億元[6]。此外，無乳鏈球菌感染還可導(dǎo)致斑馬魚 (Danio rerio)[7]在內(nèi)的多種魚體患病并大量死亡。硬骨魚感染無乳鏈球菌的典型癥狀包括魚體表變黑、眼球突出或混濁、發(fā)白、出血、腹部斑點(diǎn)和鰓蓋內(nèi)側(cè)出血等[8]。目前已有學(xué)者從菌株的分離鑒定和分型、防治鏈球菌感染的藥物篩選、疫苗研制等方面進(jìn)行了無乳鏈球菌感染魚體的研究報(bào)道[9]。關(guān)于無乳鏈球菌感染卵形鯧鲹 (Trachinotus ovatus) 的發(fā)病機(jī)理和調(diào)節(jié)機(jī)制方面的研究仍有不足。

卵形鯧鲹作為我國南方深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖的主要品種，年產(chǎn)量近20萬噸[10]。近年來，隨著養(yǎng)殖環(huán)境變化以及養(yǎng)殖密度增加，導(dǎo)致卵形鯧鲹病害頻發(fā)，給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。Cai等[11]2016年首次報(bào)道了無乳鏈球菌感染卵形鯧鲹，感染后可導(dǎo)致其大量死亡，死亡率最高可達(dá)每天2%[12]。有研究報(bào)道，無乳鏈球菌侵襲生物體主要通過血流和主要器官在全身傳播。作為魚類的重要免疫調(diào)節(jié)器官，肝臟、脾臟和腎臟是病原菌入侵魚體時(shí)的廣泛研究對(duì)象。例如，羅非魚感染無乳鏈球菌后可導(dǎo)致其肝臟、腸、鰓、脾、頭腎和腦發(fā)生不同程度的病變，其中在腎臟和脾臟中檢測(cè)到較高的細(xì)菌密度[5]。雜交蛇頭魚 (Channa maculata♀ × C. argus♂)脾臟中存在的免疫和凋亡相關(guān)通路在舒伯特氣單胞菌 (Aeromonas schubert) 感染中發(fā)揮重要作用[13]。愛德華氏菌 (Edwardsiella) 感染可誘導(dǎo)許氏平鲉(Sebastes schlegeli) 脾、肝和頭腎中鈣網(wǎng)蛋白的顯著上調(diào)，從而減少病原體在其體內(nèi)的傳播和復(fù)制[14]。然而，對(duì)卵形鯧鲹脾臟在無乳鏈球菌入侵后的調(diào)控機(jī)制研究仍有不足。

因此，本研究在已有研究基礎(chǔ)上，通過酶活性測(cè)定、組織病理學(xué)觀察和實(shí)時(shí)定量PCR探究了卵形鯧鲹脾臟在無乳鏈球菌感染后的生理生化反應(yīng)和凋亡誘導(dǎo)機(jī)制，以期為卵形鯧鲹抗病育種及長期健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚和細(xì)菌

實(shí)驗(yàn)所用卵形鯧鲹均來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地，平均體質(zhì)量為31.15 g。實(shí)驗(yàn)開始前，選取無病原感染、健壯的500尾卵形鯧鲹，轉(zhuǎn)入與實(shí)驗(yàn)條件一致的實(shí)驗(yàn)桶進(jìn)行暫養(yǎng)，養(yǎng)殖水溫為 (27±0.5) ℃，鹽度25‰，溶解氧質(zhì)量濃度保持在5.5 mg·L?1以上。每天投喂2次，飼喂量約占體質(zhì)量的4%。選用的無乳鏈球菌菌株2021年分離自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地的患病卵形鯧鲹。

1.2 感染預(yù)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)開始前，將細(xì)菌接種于BHI液體培養(yǎng)基中，并在 180 r·min?1、27 ℃ 的搖床上孵育 24 h。將BHI液體培養(yǎng)物在8 000 r·min?1[15]的條件下離心8 min，收集沉淀物。然后用無菌磷酸鹽緩沖溶液 (PBS) 洗滌沉淀4次，用不同濃度 (1.0×1010、1.0×109、1.0×108、1.0×107和 1.0×106CFU·mL?1) 的無乳鏈球菌注射感染卵形鯧鲹。感染后，觀察魚的行為變化，記錄不同感染濃度下死亡率與時(shí)間的關(guān)系，根據(jù)死亡率最終得到半致死濃度為1.0×108CFU·mL?1。

1.3 人工感染實(shí)驗(yàn)

感染實(shí)驗(yàn)在150 L的水族箱中進(jìn)行，水體140 L。選取300尾健康的卵形鯧鲹，隨機(jī)平均分為6組，其中3個(gè)處理組，3個(gè)對(duì)照組。按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將魚麻醉后處理組每尾魚腹腔注射200 μL無乳鏈球菌 (1.0×108CFU·mL?1)，對(duì)照組注射相同劑量的無菌PBS溶液。

注射后的第0、第6、第12、第24、第48、第72、第96和第120小時(shí)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3尾魚，用40 mg·L?1丁香酚麻醉。魚體經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇消毒后，用1.5 mL無菌注射器靜脈取血，將3尾魚的血液混合置于2.0 mL離心管中靜置 5 h，離心 (1 000 r·min?1、20 min) 分離獲得血清，置于1.5 mL凍存管中，于?80 ℃冰箱中保存用于分析酶活性等相關(guān)指標(biāo)。另外用肝素鈉 (100 IU·mL?1) 潤洗后的離心管分別收集第0和第120小時(shí)血液用于血常規(guī)檢測(cè)。取新鮮的脾臟組織液氮速凍后置于?80 ℃冰箱中備用；另取新鮮脾臟組織通過生理鹽水清洗表面血液后用4%多聚甲醛固定用于組織學(xué)檢查。

1.4 病理觀察

對(duì)魚樣品進(jìn)行宏觀和組織學(xué)檢查，記錄外部和內(nèi)部形態(tài)變化。將固定在多聚甲醛中的脾臟組織用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇清洗，經(jīng)過脫水后使用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度5 μm，并用蘇木精-伊紅染色，使用正置熒光顯微鏡(NIKON ECLIPSE C1) 獲得切片圖像[16]。

1.5 血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)

通過全自動(dòng)血液細(xì)胞分析 (深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，BC-5000Vet) 檢測(cè)血液中白細(xì)胞 (WBC)、嗜中性粒細(xì)胞 (NE)、淋巴細(xì)胞(LYM)、紅細(xì)胞 (RBC)、血小板 (PLT)、血紅蛋白濃度 (HGB)、紅細(xì)胞比容 (HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度 (MCHC)、平均血小板體積 (MPV) 和血小板壓積 (PCT) 的變化。

1.6 生化指標(biāo)檢測(cè)

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組卵形鯧鲹血清中乳酸脫氫酶(LDH)，脾臟中酸性磷酸酶 (ACP) 和堿性磷酸酶(ALP) 的活性采用北京華英生物技術(shù)研究所試劑盒和酶標(biāo)儀 (華衛(wèi)德朗DR-200BS) 進(jìn)行測(cè)定。

1.7 Caspase基因表達(dá)

按照RNA提取試劑盒 (廣州美基生物科技有限公司) 說明書提取卵形鯧鲹脾臟總RNA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000(Thermo Fisher，美國) 檢測(cè)其質(zhì)量和濃度，使用PrimeScript? RT試劑盒和gDNA Eraser合成cDNA，于?20 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的引物序列 (表1)，由于EF-1α不受無乳鏈球菌感染的影響，因此選擇EF-1α作為內(nèi)參基因。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche Light Cycler?480 II，羅氏診斷產(chǎn)品有限公司，上海) 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)，反應(yīng)體系為12.5 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性 5 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，在獲得每個(gè)樣品的閾值之后，使用2?ΔΔt方法計(jì)算Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (±SD)”表示。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用單因素方差分析 (One-way ANOVA) 進(jìn)行比較，P<0.05表示差異顯著。

表1 引物信息及序列Table 1 Primers and sequences information applied in this study

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)觀察

人工感染無乳鏈球菌24 h后，卵形鯧鲹游動(dòng)不定、食欲不振、嗜睡、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)，且明顯觀察到角膜混濁、突眼、眼出血、內(nèi)臟充血和內(nèi)鰓蓋充血等典型病變 (圖1)，并在感染后48 h出現(xiàn)大量死亡。組織病理學(xué)分析顯示，脾臟發(fā)生較為嚴(yán)重的病變損傷，典型特征為白髓中B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的壞死和丟失；輕度至中度病變表現(xiàn)為脾炎，白髓區(qū)域顯著減少，淋巴細(xì)胞數(shù)目降低。在嚴(yán)重病變中，脾臟白髓彌漫性壞死至白髓區(qū)域完全消失，伴有網(wǎng)狀內(nèi)皮增生，可見大量被HE染成棕黃色的“小結(jié)”(圖2)。未感染的卵形鯧鲹脾臟具有正常的紅髓和白髓。

圖1 卵形鯧鲹感染無乳鏈球菌后內(nèi)部和外部病變注：a. 角膜混濁、突眼、眼出血；b. 內(nèi)臟充血；c. 內(nèi)鰓蓋充血 (箭頭所指)。Fig. 1 Internal and external lesions recorded on T. ovatus specimens affected by S. agalactiaNote: a. Corneal opacity, exophthalmia and eye hemorrhage; b. Gut congestion; c. Congestion in the inner gill cap (Arrow).

圖2 卵形鯧鲹脾臟組織病理學(xué)特征注：a. 健康脾臟組織切片；b—c. 感染無乳鏈球菌120 h 后脾臟組織切片。Fig. 2 Histopathological characteristics of spleen of T. ovatusNote: a. Healthy spleen tissue section; b?c. Spleen tissue section 120 h after infection with S. agalactiae.

2.2 血液指標(biāo)參數(shù)

卵形鯧鲹感染無乳鏈球菌后血液參數(shù)見表2。與對(duì)照組相比，感染個(gè)體的紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞比容明顯降低 (P<0.05)，白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量則出現(xiàn)相反的趨勢(shì)(P<0.05)，與對(duì)照組相比嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量增加近3倍。同時(shí)平均紅細(xì)胞體積明顯增大，其他指標(biāo)未見明顯變化。

表2 卵形鯧鲹感染無乳鏈球菌對(duì)血液學(xué)指標(biāo)的影響Table 2 Effect of S. agalactiae infection on hematological parameters of T. ovatus

2.3 血清、脾臟生化指標(biāo)結(jié)果

卵形鯧鲹感染無乳鏈球菌后的血清和脾臟生化指標(biāo)變化見圖3，相較于對(duì)照組，感染組個(gè)體的血清LDH和脾臟中ALP、ACP活性顯著增加 (P<0.05)，并于第6小時(shí)達(dá)到峰值 (P<0.01)；同時(shí)隨著感染時(shí)間延長，其活性均逐漸降低但ACP與對(duì)照組相比仍有極顯著差異 (P<0.01)。其中LDH活性在感染6 h后升高最為顯著 (P<0.01)，活性約為對(duì)照組的10倍。

圖3 卵形鯧鲹感染無乳鏈球菌后生化指標(biāo)變化注：a. 不同時(shí)間血漿乳酸脫氫酶變化水平；b. 不同時(shí)間脾臟堿性磷酸酶變化水平；c. 不同時(shí)間脾臟酸性磷酸酶變化水平；**. 差異極顯著 (P<0.01)；*. 差異顯著 (P<0.05)。Fig. 3 Changes of biochemical indexes after infection of T. ovatus at different timeNote: a. The levels of plasma lactate dehydrogenase at different time before and after the challenge; b. The levels of spleen alkaline phosphatase at different time before and after the challenge; c. The levels of spleen acid phosphatase at different time before and after the challenge;**. Very significant difference (P<0.01);*. Significant difference (P<0.05).

2.4 脾臟中凋亡基因表達(dá)

卵形鯧鲹感染無乳鏈球菌后凋亡基因表達(dá)譜見圖4。在第0—第120小時(shí)的實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的mRNA表達(dá)水平隨時(shí)間推移均不斷升高。其中Caspase-8基因表達(dá)水平在感染第6小時(shí)顯著高于對(duì)照組 (P<0.05)，并在第120小時(shí)達(dá)到峰值 (P<0.01)；Caspase-3在感染后第120小時(shí)達(dá)到峰值；Caspase-9在感染后第12小時(shí)表達(dá)量顯著升高 (P<0.05)，并在第72小時(shí)達(dá)到峰值后趨于穩(wěn)定。

圖4 卵形鯧鲹感染無乳鏈球菌后脾臟凋亡基因相對(duì)表達(dá)量注：**. 差異極顯著(P<0.01)；*. 差異顯著 (P<0.05)。Fig. 4 Relative expression of apoptosis genes in spleen after T. ovatus infection with S. agalactiaeNote: **. Very significant difference (P<0.01);*. Significant difference (P<0.05).

3 討論

本研究通過無乳鏈球菌體外注射實(shí)驗(yàn)感染魚體后，自患病魚中分離得到的菌株經(jīng)形態(tài)分析和16S RNA測(cè)序比對(duì)后均與無乳鏈球菌具有高度一致性，因此確定其為無乳鏈球菌感染。經(jīng)腹腔注射200 μL 濃度為 1.0×108CFU·mL?1的病原菌后，在48 h后實(shí)驗(yàn)組死亡率開始增加，這與羅非魚人工注射相似劑量無乳鏈球菌后的死亡高峰期接近[17]。觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組卵形鯧鲹出現(xiàn)與自然感染無乳鏈球菌后相似的臨床癥狀[18]，組織病理學(xué)分析顯示，卵形鯧鲹在無乳鏈球菌感染后表現(xiàn)出脾臟炎癥病變并伴有含鐵血黃素沉積。有研究表明，機(jī)體對(duì)鐵元素利用受阻導(dǎo)致脾臟中含鐵血黃素的積累或紅細(xì)胞被大量破壞是魚類對(duì)環(huán)境應(yīng)激的重要信號(hào)[19]，因此，脾臟中含鐵血黃素的檢測(cè)對(duì)卵形鯧鲹的健康監(jiān)測(cè)具有重要意義。本研究中，脾臟作為卵形鯧鲹的主要淋巴器官在無乳鏈球菌感染后損傷嚴(yán)重，造成無法區(qū)分紅髓和白髓以及淋巴細(xì)胞減少，同時(shí)可見產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞，這與羅非魚在自然狀態(tài)下感染無乳鏈球菌后的組織切片結(jié)果相似[3]。

血清生化參數(shù)是組織或器官在臨床病理學(xué)研究中的重要指標(biāo)[20]。研究表明，高于或低于基線水平的酶活性通常反映組織或器官代謝紊亂，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起細(xì)胞凋亡[21]。細(xì)胞凋亡是感染的最終結(jié)果，主要包括細(xì)胞壞死、凋亡和自噬[22]。LDH作為糖酵解途徑中的末端酶，在輔酶NADH協(xié)助下可將乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸。當(dāng)機(jī)體受到外界壓力時(shí)，LDH可以進(jìn)行逆反應(yīng)并將丙酮酸 (糖酵解的最終產(chǎn)物) 轉(zhuǎn)化為乳酸[23]。而細(xì)胞內(nèi)LDH的釋放是細(xì)胞壞死的特征之一。本研究中感染無乳鏈球菌后卵形鯧鲹血清中LDH顯著升高，表明機(jī)體可能存在細(xì)胞凋亡情況并伴有病理性壞死反應(yīng)，機(jī)體通過凋亡過程清除體內(nèi)壞死的細(xì)胞并參與病原體入侵后的免疫調(diào)控過程。此外，ALP和ACP作為溶酶體中的主要水解酶參與生物體的先天免疫過程，參與包括生長和細(xì)胞分化等一系列生理代謝活動(dòng)，常被作為病原菌感染的敏感指標(biāo)，在評(píng)估魚類病原菌引發(fā)的疾病中起重要作用[23-25]。Sharkoori等[26]研究指出ALP和ACP活性可作為細(xì)胞壞死的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，無乳鏈球菌感染可使卵形鯧鲹脾臟中ALP和ACP活性在短時(shí)間內(nèi)顯著升高，這可能是由于脾臟組織功能活性增加促使其在短時(shí)間內(nèi)大量合成，以降低病原菌感染對(duì)機(jī)體的損害[27]。此外，本研究中ACP活性變化與南亞野鯪 (Labeo rohita)感染嗜水氣單胞菌 (A. hydrophila) 后的變化相似[28]，推測(cè)可能是機(jī)體內(nèi)溶酶體在抵抗無乳鏈球菌感染過程中大量增殖，促使溶酶體膜破裂，致使膜內(nèi)保持潛伏狀態(tài)的ACP被激活。

血常規(guī)檢驗(yàn)對(duì)于病原體感染的監(jiān)測(cè)具有重要意義[29]。病原菌感染魚體后可通過細(xì)胞膜擴(kuò)散到血液系統(tǒng)，并對(duì)機(jī)體血液氧氣輸送能力和血液電解質(zhì)平衡產(chǎn)生負(fù)面影響[30]。血液中紅細(xì)胞比容、紅細(xì)胞和血紅蛋白濃度是評(píng)估魚類在暴露于各種環(huán)境壓力、化學(xué)毒性和細(xì)菌感染后健康狀況的重要指標(biāo)[25]。本研究中，實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞比容、紅細(xì)胞和血紅蛋白濃度均顯著低于對(duì)照組，與草魚 (Ctenopharyngodon idella)[31]人工感染草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus) 后的變化相似，因此認(rèn)為血液生化特性可用作卵形鯧鲹對(duì)無乳鏈球菌感染的敏感指標(biāo)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞比容、紅細(xì)胞和血紅蛋白濃度降低會(huì)造成貧血，這可能是細(xì)菌感染動(dòng)物后抑制紅細(xì)胞生成或是細(xì)菌感染導(dǎo)致紅細(xì)胞生命周期縮短而引起貧血狀態(tài)[32]。同時(shí)本研究中實(shí)驗(yàn)組平均紅細(xì)胞體積較大，推測(cè)其可能伴有紅細(xì)胞增多癥。以往研究發(fā)現(xiàn)，由于魚類與哺乳動(dòng)物不同，幼體紅細(xì)胞比成體紅細(xì)胞小，細(xì)胞質(zhì)較少，當(dāng)外源微生物入侵后可使魚平均紅細(xì)胞體積增大[33]。此外，有研究報(bào)道，血液中白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量常因病原菌感染而增多[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，受感染魚白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的含量顯著升高，可能是病原菌感染誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生可逆性造血干細(xì)胞損傷后出現(xiàn)的侵襲性炎癥病變或血液早期再增殖，機(jī)體在試圖通過發(fā)展獲得性免疫而增強(qiáng)對(duì)病原體的抗性[35]。

當(dāng)先天免疫被破壞導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)受阻時(shí)，細(xì)胞會(huì)遭受嚴(yán)重?fù)p傷并啟動(dòng)凋亡或壞死。細(xì)胞凋亡是由基因編碼的自殺程序的作用引起的，該程序觸發(fā)了一系列特征性的形態(tài)和生化變化，Caspase是魚類檢測(cè)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵指標(biāo)[36]。細(xì)胞凋亡通常通過外在途徑 (受體-凋亡途徑) 和內(nèi)在途徑 (線粒體-凋亡途徑) 兩種主要途徑發(fā)生[37]，其中外在途徑通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)死亡受體，募集相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域和Caspase-8相關(guān)的蛋白質(zhì)，隨后Caspase-8的激活直接或間接地激活Caspase-3。內(nèi)在途徑是由細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子 (Apaf-1) 結(jié)合，激活下游效應(yīng)子Caspase-9后進(jìn)一步激活Caspase-3[38]。河豚 (Takifugu obscurus)[39]感染嗜水氣單胞菌后頭腎中Caspase-3和Caspase-8的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，促使細(xì)胞凋亡。此外，已有研究報(bào)道無乳鏈球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可以改變水生動(dòng)物凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平[40]。本研究發(fā)現(xiàn)，無乳鏈球菌可誘導(dǎo)卵形鯧鲹脾臟中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，表明機(jī)體的內(nèi)外凋亡途徑可同時(shí)參與對(duì)病原體入侵的免疫調(diào)控過程。