陳小嬌,張妹,康翠翠,陳文平
(1.北京市華都峪口禽業(yè)有限責(zé)任公司,北京 101206;2.國家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系平谷綜合試驗(yàn)站,北京 101206)
禽白血?。ˋvian Leukosis,AL)是可垂直傳播的病毒性腫瘤病,呈世界性分布,嚴(yán)重制約著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。由于該病的防治無有效藥物和疫苗,唯一有效的控制方法就是對核心雞群進(jìn)行凈化。近幾年,大多數(shù)養(yǎng)禽場已開展核心雞群禽白血病的研究與凈化工作,而1日齡雛雞胎糞禽白血病P27檢測是建立陰性雞群的第一步,對禽白血病凈化起到關(guān)鍵作用。
不同廠家的禽白血病P27試劑盒的檢測要求不同,根據(jù)說明書使用對應(yīng)的胎糞樣品稀釋液。同時(shí)在出雞前需準(zhǔn)備足夠的樣品稀釋液,根據(jù)種蛋入孵數(shù)量和所入選品系的種蛋受精率、孵化率來計(jì)算出雛數(shù)量。如果種蛋入孵10 000枚,假設(shè)受精率、孵化率分別為90%、80%,那么出雛數(shù)量是:10 000×90%×80%=7200(只)。那么需要準(zhǔn)備胎糞樣品稀釋液7200份,每個(gè)離心管中加入0.5 mL樣品稀釋液[1]。
雛雞鑒別人員負(fù)責(zé)胎糞樣品的采集工作,對出雛紙袋中剛出殼的每只雛雞進(jìn)行翻肛性別鑒別,逐只采集雛雞胎糞,擠到加有0.5 mL稀釋液的2 mL離心管中,在離心管蓋上用馬克筆標(biāo)記家系號[2],將采集完的胎糞樣品置于常溫放置。胎糞樣品采集前,鑒別人員的雙手應(yīng)進(jìn)行徹底消毒,在完成一個(gè)家系雞只胎糞采集后雙手還要再次消毒,避免不同家系間感染;若采集過程中手指沾到大量胎糞時(shí),應(yīng)及時(shí)進(jìn)行消毒,避免引起相同家系間雞只的交叉感染。從采樣環(huán)節(jié)嚴(yán)格控制不同家系間或同一家系雞只的交叉感染,能夠有效保障檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
將采有胎糞樣品的離心管上下左右搖晃、震蕩,直至胎糞塊與稀釋液完全融合;為防止離心管掉到液氮罐中,避免出現(xiàn)漏檢,需將搖勻的樣品放到紗布袋里,收緊口袋,置于液氮罐中保存。
將胎糞樣品按不同品系分類放到不同的液氮罐里,冷凍5 min。之后取樣人員雙手一定要帶上棉線手套,用大鑷子夾取長繩,慢慢往上拉出樣品,將取出的胎糞樣品在空氣中停留至無液氮揮發(fā)后,方可放到桌面。放置時(shí),注意離其他人員遠(yuǎn)一點(diǎn)。
待胎糞樣品在空氣中放置10 min后,將樣品按著標(biāo)注的品系、家系的順序碼放于凍存盒內(nèi)。將碼放好的樣品放置38 ℃恒溫箱中回溫直至樣品完全解凍,一般樣品回溫1.5 h即可。
樣品解凍后,蓋上凍存盒蓋子,整板震蕩,讓胎糞與稀釋液充分混勻,之后靜置2 min,液面分成上下兩層。
為確保酶標(biāo)板中樣品反應(yīng)時(shí)間一致,將待檢胎糞樣品按照一定順序加入到一次性反應(yīng)板孔內(nèi),加樣時(shí)要吸取上清液150 μL,切忌樣品混有沉淀。如果有的待檢樣品上清液量不足,則可傾斜離心管貼壁吸取上清液;如果上述操作后上清液吸取量還是達(dá)不到要求,則可在待檢胎糞樣品中加入0.2 mL稀釋液。
加樣人員每加完一板胎糞樣品后,需在一次性反應(yīng)板和凍存盒上標(biāo)清楚對應(yīng)的品系及板號,并將各個(gè)板和凍存盒按著順序碼放在固定的位置上,便于實(shí)驗(yàn)人員、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)人員進(jìn)行操作,以便應(yīng)對突發(fā)情況。每塊反應(yīng)板中胎糞樣品信息由專人負(fù)責(zé)登記,需詳細(xì)記錄檢測的第幾板、品系、家系、加樣人姓名等相關(guān)信息。
胎糞樣品禽白血病p27檢測嚴(yán)格按照試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說明書進(jìn)行,檢測前將試劑盒置于25 ℃恒溫箱中回溫2.5 h,確保試劑結(jié)晶完全融化后方可使用。
5.2.1 人員合理分配 出雛后4 h內(nèi)完成雞只胎糞樣品檢測工作,以確保雛雞的健康。由于檢測任務(wù)比較重、時(shí)間緊迫,需合理組織與安排人員,做好ELSIA實(shí)驗(yàn)檢測流程的管控與記錄,確保試驗(yàn)順利進(jìn)行,保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測人員分為2組,實(shí)施8 h工作交替。兩組各環(huán)節(jié)的負(fù)責(zé)人需要交接工作進(jìn)程,保證每個(gè)環(huán)節(jié)能夠有條不紊地開展下一階段的工作。
5.2.2 溫度的控制 實(shí)驗(yàn)過程中酶標(biāo)板需在恒溫中孵育,溫度直接影響酶的活力,是酶標(biāo)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵項(xiàng),其注意事項(xiàng)為:一是保證實(shí)驗(yàn)前將試劑盒中各個(gè)試劑及酶標(biāo)板在室溫(25~28℃)回溫2.5 h;二是樣品檢測過程中,確保酶標(biāo)板的每一個(gè)反應(yīng)環(huán)節(jié)均在試劑盒要求的溫度下進(jìn)行。
5.2.3 時(shí)間的控制 為準(zhǔn)確把握檢測中每個(gè)環(huán)節(jié)的反應(yīng)時(shí)間,每次加完試劑后均使用計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí),并且實(shí)驗(yàn)操作中要不斷計(jì)算各板之間的時(shí)間間隔,合理安排每塊板的時(shí)間,保證實(shí)驗(yàn)時(shí)間的準(zhǔn)確性。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)人員首先將胎糞樣品編號提前輸入EXCEL表格中,輸號期間需要兩個(gè)人密切配合核對數(shù)據(jù),確保每一份樣品編號準(zhǔn)確。檢測完畢后將檢測數(shù)據(jù)從軟件中導(dǎo)出,并將其與輸入的樣品編號進(jìn)行合并,篩選出陽性雞只的編號。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后,經(jīng)負(fù)責(zé)人審核確認(rèn)無誤后,方可將檢測的陽性編號反饋給生產(chǎn)負(fù)責(zé)人。
雛雞出殼后,嚴(yán)格篩選出健康雞只,同一個(gè)小家系的雛雞放入一個(gè)帶有透氣孔的紙袋內(nèi),標(biāo)記家系號。經(jīng)過免疫后的雛雞按照家系號順序放置在出雛場地,然后按照家系分類每只雛雞裝入一個(gè)帶有透氣孔的紙袋中,并放在白色塑料篩上。待檢測結(jié)果反饋后,及時(shí)淘汰陽性雞。需注意:同一只母雞所產(chǎn)雛雞中有一只陽性雞就要全部淘汰同紙袋中雛雞,同時(shí)追溯到種雞,淘汰相應(yīng)的種母雞。最終,將健康的雞只運(yùn)送至育雛場。
禽白血病的水平傳播主要發(fā)生在孵化期間和出雛后的前兩周內(nèi),尤其是雛雞出殼后48 h內(nèi)具有很強(qiáng)的傳染性、傳播性,因此,1日齡胎糞檢測是禽白血病凈化程序最重要的一環(huán),是“重中之重”[3]。本研究梳理出一套適合規(guī)模化養(yǎng)殖場1日齡雛雞胎糞禽白血病檢測流程,且在禽白血病凈化生產(chǎn)應(yīng)用中也取得了較好的效果,為國內(nèi)種雞場禽白血病凈化的示范推廣提供技術(shù)支持。