劉馨怡，徐 丹，劉遠(yuǎn)征，李艷霞，馬蔚紅，王甲水，李樹和，張 賀

(1 天津農(nóng)學(xué)院，天津，300384；2 海南大學(xué)，?？?，570208；3 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站，?？?，571101)

油梨PerseaamericanaMill.，又稱鱷梨、牛油果等，原產(chǎn)于墨西哥、中美洲等地區(qū)[1]。油梨富含多種維生素以及不飽和脂肪酸，其營養(yǎng)價(jià)值高，深受消費(fèi)者喜愛。隨著我國消費(fèi)水平的提高，油梨栽培面積日益擴(kuò)大，當(dāng)前我國油梨主要種植在海南、云南、廣西、廣東、福建、四川及臺(tái)灣等熱帶亞熱帶地區(qū)[2-3]。近年來，油梨枝干潰瘍病發(fā)生普遍，造成樹勢衰弱，引起早衰和枯死，嚴(yán)重影響油梨品質(zhì)和產(chǎn)量。可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae是油梨枝干潰瘍病的主要病原菌之一[4-6]，其引起的油梨枝干潰瘍病主要為害枝干，枝條表皮呈黑褐色壞死，病斑位置稍凹陷，發(fā)展迅速，后期會(huì)導(dǎo)致整株死亡，給油梨產(chǎn)業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。

目前L.theobromae引起油梨枝干潰瘍病的致病機(jī)理尚不清楚。活性氧在植物和病原菌互作中扮演關(guān)鍵角色。病原菌和寄主植物互作過程中，寄主植物通常在侵染部位產(chǎn)生大量的活性氧，主要包括超氧陰離子和過氧化氫；活性氧作為毒性分子，在較高濃度下，可能引起一系列的分子傷害，如膜脂、蛋白過氧化以及DNA突變等，甚至引發(fā)植物細(xì)胞程序化死亡等[9]。鑒于當(dāng)前尚缺少寄主油梨和病原真菌L.theobromae互作過程中活性氧代謝變化相關(guān)的系統(tǒng)研究，以及活性氧代謝變化和病情發(fā)展的密切關(guān)系研究，本研究探討了油梨枝干潰瘍病發(fā)生期間活性氧的產(chǎn)生、抗氧化酶以及抗氧化劑的變化特點(diǎn)，希望找到活性氧產(chǎn)生—消除的系統(tǒng)變化規(guī)律及其與病情發(fā)展的關(guān)系，為研究該病害發(fā)生機(jī)制以及開發(fā)高效防治技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株DZN-29，分離自油梨枝干潰瘍病典型癥狀枝條，經(jīng)致病力測定具有強(qiáng)致病性，經(jīng)形態(tài)鑒定及分子鑒定為可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae。供試油梨品種為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站油梨種質(zhì)資源圃內(nèi)種植的4年生“Hass”油梨。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。菌株DZN-29在PDA平板上活化培養(yǎng)3 d，待菌絲體長滿全皿后，使用直徑5 mm打孔器在菌落邊緣取菌餅備用。選取健康生長、粗細(xì)一致、半木質(zhì)化的當(dāng)年生“Hass”油梨枝條，參考Li等[10]方法采用刺傷法接種菌餅，以接種無菌PDA作為對(duì)照。接種后0～5 d分別測量病斑大小，并取接種點(diǎn)周圍0.5～1 cm寬皮部組織，立即放入液氮速凍，保存在-80 ℃超低溫冰箱中備用，重復(fù)3次，每次每個(gè)時(shí)間點(diǎn)15條枝條取樣。

1.3 測定方法

1.3.1 總蛋白含量測定 使用南京建成生物工程公司的總蛋白試劑盒A045-3測定。取枝條皮部樣品0.1 g，加入預(yù)冷的100 mM，pH值7.4磷酸鹽緩沖液1 mL研磨混勻，混合液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，4 °C 3 000 r/min離心10 min，吸取上清液0.1 mL稀釋10倍后使用MULTISKAN GO全波長酶標(biāo)儀(Thermo scientific，美國產(chǎn))在562 nm處測定吸光值，按照試劑盒說明書測定，總蛋白含量單位為μg/mL。

1.3.2 超氧陰離子含量測定 樣品組織中的超氧陰離子(O2-)含量采用北京索萊寶科技有限公司超氧陰離子試劑盒BC1295測定。取樣品0.1 g，加入預(yù)冷的65 mM，pH值7.8磷酸鉀緩沖液1 mL研磨混勻，混合液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液按照試劑盒說明書測定，O2-含量單位為μmol/g。

1.3.3 過氧化氫含量測定 使用南京建成生物工程公司的過氧化氫試劑盒A064-1測定。取樣品0.1 g，加入預(yù)冷的100 mM，pH值7.4磷酸鹽緩沖液1 mL研磨混勻，混合液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液在415 nm處測定吸光值，按照試劑盒說明書測定，過氧化氫含量單位為mmol/g。

1.3.4 丙二醛含量測定 使用南京建成生物工程公司的丙二醛試劑盒A003-1測定，方法參考試劑盒說明書，丙二醛含量單位為μmol/g。

1.3.5 抗氧化酶活性測定 枝條樣品中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)分別采用南京建成生物工程公司試劑盒SOD(A001-3)，CAT(A007-1)測定，方法參考試劑盒說明書，酶活性單位為U/mg。

1.3.6 抗氧化物質(zhì)含量測定 枝條樣品中的抗氧化物質(zhì)——抗壞血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)分別采用南京建成生物工程公司試劑盒AsA(A009-1)，GSH(A006-2)測定，方法參考試劑盒說明書，AsA含量單位為mmol/g，GSH含量單位為μmol/g。

1.3.7 總抗氧化能力測定 枝條樣品的總抗氧化能力(T-AOC)采用南京建成生物工程公司試劑盒A015-2測定，方法參考試劑盒說明書，T-AOC單位為mmol/g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件及SAS(version 8.1，SAS Institute，美國產(chǎn))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。t測驗(yàn)分析兩個(gè)樣品間的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 接菌枝條發(fā)病情況

油梨當(dāng)年生枝條在接種L.theobromae菌株DZN-29后出現(xiàn)褐色壞死性病斑，隨著接種時(shí)間延長，病斑快速擴(kuò)展，接種后5d，病斑長度達(dá)到60.97 mm；對(duì)照接種點(diǎn)沒有變化(見圖1)。

圖1 “Hass”油梨當(dāng)年生枝條接種可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae后發(fā)病情況

2.2 超氧陰離子(O2-)和過氧化氫(H2O2)含量變化

試驗(yàn)結(jié)果看出，接菌枝條皮部中O2-含量在接種后1～5 d均顯著高于對(duì)照。接菌后，O2-含量在第1天至第4天持續(xù)增加，隨后在第5天略有下降；而對(duì)照枝條皮部中O2-含量變化較小，在調(diào)查時(shí)間點(diǎn)均保持較低水平。接菌枝條皮部中H2O2含量快速增加，在第1天達(dá)到峰值，隨后呈現(xiàn)下降趨勢；接菌處理的H2O2含量在接種后0～3 d極顯著高于對(duì)照，第4天和第5天極顯著低于對(duì)照；對(duì)照的H2O2含量在觀察時(shí)間點(diǎn)均保持較低水平(見圖2)。

注：*和**分別表示差異顯著(p<0.05)和極顯著(p<0.01)。圖3至圖5同。

2.3 超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性變化

試驗(yàn)結(jié)果看出，接菌枝條皮部中SOD活性在接種后1～3 d快速上升，第3天達(dá)到峰值，隨后兩天活性下降；接種后1～5 d接菌處理的SOD活性均極顯著高于對(duì)照，對(duì)照SOD活性在觀察時(shí)間點(diǎn)均保持較低水平。接菌后，枝條皮部CAT活性快速升高，第1天達(dá)到峰值，第2天活性緩慢下降，第3天上升到較高水平，隨后迅速下降；接種后1～3 d，接菌處理的CAT活性顯著高于對(duì)照，而第4天和第5天接菌處理的CAT活性顯著低于對(duì)照(見圖3)。

圖3 “Hass”油梨當(dāng)年生枝條接種可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae后枝條皮部超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性變化

2.4 抗壞血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)含量變化

接菌枝條皮部AsA含量迅速上升，接種后1 d達(dá)到峰值，隨后迅速下降，2～5 d一直保持較低水平；接種后1～4 d，接菌處理的AsA含量均極顯著高于對(duì)照。接種后1 d，接菌處理的GSH含量快速升高至峰值，隨后2～3 d呈現(xiàn)下降趨勢，4～5 d又穩(wěn)步上升；接種后1～5 d，接菌處理的GSH含量均極顯著高于對(duì)照(見圖4)。

圖4 “Hass”油梨當(dāng)年生枝條接種可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae后枝條皮部抗壞血酸和谷胱甘肽含量變化

2.5 丙二醛(MDA)含量和總抗氧化能力(T-AOC) 變化

接種后1～2 d，接菌處理的枝條皮部丙二醛含量快速增加，第3天穩(wěn)定在較高的水平，隨后4～5 d略有下降；接菌處理的丙二醛含量在測定時(shí)間均顯著高于對(duì)照。接菌處理的T-AOC迅速上升，第2 天達(dá)到峰值，在剩余的測定時(shí)間呈下降趨勢；接種后1～5 d，接種處理的T-AOC在測定時(shí)間均顯著高于對(duì)照(見圖5)。

圖5 “Hass”油梨當(dāng)年生枝條接種可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae后枝條皮部丙二醛含量和總氧化能力變化

3 結(jié)論與討論

病原菌侵染植物過程中，寄主一般迅速地產(chǎn)生大量的活性氧，如O2-和H2O2，作為防御反應(yīng)的信號(hào)物質(zhì)調(diào)控一系列的抗性反應(yīng)；但是大量活性氧的積累會(huì)形成氧化脅迫，造成植物細(xì)胞中DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等大分子物質(zhì)氧化損傷等，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，組織褐化、壞死等癥狀[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，L.theobromae侵染油梨枝條前期，接種后1～3 d，接種點(diǎn)周圍組織中O2-、H2O2和膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的含量均大量增加，且顯著高于對(duì)照。說明在油梨枝干潰瘍病發(fā)病過程中，活性氧大量產(chǎn)生且可能引起枝條組織中細(xì)胞發(fā)生氧化脅迫?；钚匝踝鳛槎拘苑肿?，可能導(dǎo)致寄主植物組織細(xì)胞的過氧化，引起細(xì)胞壞死。類似的結(jié)果在其他病害發(fā)生時(shí)也觀察到，如小麥殼針孢葉枯病菌Septoriatritici在侵染小麥過程中伴隨著大量過氧化氫的產(chǎn)生和積累[12]。在L.theobromae侵染龍眼果實(shí)的過程中，O2-和MDA含量大量增加，促進(jìn)了龍眼果皮褐化和細(xì)胞壞死，加速了病害的發(fā)展[13]。桃流膠病發(fā)展過程中也發(fā)現(xiàn)，L.theobromae侵染枝條導(dǎo)致寄主組織中O2-、H2O2和MDA的含量顯著提高，引發(fā)寄主植物細(xì)胞膜脂過氧化[14]。由此可知，病原菌侵染過程中，寄主組織活性氧和MDA含量變化和病情發(fā)展具有重要關(guān)系。

活性氧產(chǎn)生和消除的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要意義。當(dāng)活性氧大量產(chǎn)生時(shí)，植物通過激活自身的抗氧化系統(tǒng)，如抗氧化酶和抗氧化劑進(jìn)行活性氧的消除，從而維持動(dòng)態(tài)平衡。如果抗氧化系統(tǒng)無法及時(shí)消除活性氧，導(dǎo)致活性氧在細(xì)胞中積累，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被打破，造成傷害。本研究發(fā)現(xiàn)，接種L.theobromae的油梨枝條中SOD活性在接種后1～3 d快速提高，第3天達(dá)到峰值，隨后SOD活性有所下降；在整個(gè)侵染期間SOD活性均極顯著高于對(duì)照。而CAT活性在病原菌侵染期間存在較大程度的波動(dòng)，接種后1 d快速增加達(dá)到峰值，第2 天活性緩慢下降，第3天上升到較高水平，隨后迅速下降至較低水平。說明病原菌L.theobromae在侵染前期明顯誘導(dǎo)SOD、CAT活性增強(qiáng)，提高了寄主植物的抗氧化防御能力，促使其消除活性氧，從而避免細(xì)胞遭遇氧化脅迫，細(xì)胞損傷和死亡。而SOD、CAT活性在接種后3～5 d逐漸下降可能與寄主細(xì)胞已遭受氧化脅迫，寄主細(xì)胞膜過氧化，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生氧化損傷有關(guān)。有研究表明，植物抗氧化酶的活性和寄主的抗病能力密切相關(guān)。例如，灰霉菌Botrytiscinerea侵染番茄早期，寄主中的抗氧化酶如SOD、CAT活性顯著提高，增強(qiáng)了寄主的抗氧化能力。隨后伴隨著病情發(fā)展，寄主SOD、CAT活性快速下降，表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性[15]。龍眼感染病原菌L.theobromae后，早期SOD、CAT活性迅速上升，后期有所下降，活性氧清除能力下降導(dǎo)致活性氧在寄主組織中大量積累，從而導(dǎo)致龍眼果實(shí)抗病性喪失[13]。而真菌Pyriculariaoryzae侵染小麥期間，小麥抗病品種中SOD、CAT活性快速升高，發(fā)病癥狀較弱[16]。甘蔗過氧化氫酶編碼基因ScCAT2在煙草中超表達(dá)，顯著提高了煙草對(duì)病原菌Ralstoniasolanacearum和Fusariumsolanivar.coeruleum的抗性，表明過氧化氫酶參與寄主植物的抗性反應(yīng)[17]。

本試驗(yàn)中，抗氧化劑AsA和GSH在接種L.theobromae后快速增加，第1 天達(dá)到峰值，隨后下降；而接菌后1～4 d枝條皮部的AsA和GSH含量均顯著高于對(duì)照。接種L.theobromae后，油梨枝條的總抗氧化能力也快速增加，在第2 天達(dá)到峰值，隨后下降。表明抗氧化劑和植物抗氧化能力在病菌侵染早期可能發(fā)揮重要作用，參與活性氧清除。同時(shí)，接菌枝條組織中O2-和MDA含量仍維持在較高的水平。可以推斷病原菌L.theobromae侵染枝條導(dǎo)致寄主組織快速產(chǎn)生了大量的活性氧，激活了寄主的抗氧化系統(tǒng)。但是，隨著侵染不斷發(fā)展，病原菌可能抑制寄主細(xì)胞中抗氧化劑的合成，導(dǎo)致寄主細(xì)胞的抗氧化能力下降，從而累積活性氧，引發(fā)寄主細(xì)胞膜脂過氧化，促進(jìn)了病害發(fā)生。這與接菌枝條病斑在侵染后期快速擴(kuò)展是一致的。病原真菌樟疫霉Phytophthoracinnamomi侵染桉樹的研究表明，對(duì)樟疫霉抗性較高的桉樹中，AsA和GSH含量在病原菌侵染期間是不斷提高的，表明寄主植物桉樹對(duì)樟疫霉的抗性和AsA和GSH的含量密切相關(guān)[18]。此外，病原菌L.theobromae侵染龍眼的研究表明，寄主組織中AsA和GSH的含量的下降導(dǎo)致了龍眼果實(shí)表皮褐化以及果肉腐爛[13]。綜上所述，推測油梨對(duì)枝干潰瘍病的抗病能力與寄主的抗氧化能力密切相關(guān)，寄主抗氧化能力變化影響油梨枝干潰瘍病病情發(fā)展。這一推論仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究以“Hass”油梨當(dāng)年生枝條為材料，研究了接種病原菌L.theobromae后枝條組織中活性氧產(chǎn)生—消除系統(tǒng)相關(guān)物質(zhì)及酶活性的變化趨勢。結(jié)果表明，接種病原菌早期，油梨枝條的O2-、H2O2和MDA含量快速增加，顯著高于對(duì)照；而抗氧化酶SOD和CAT活性和抗氧化劑AsA和GSH在侵染早期含量較高，后期呈下降趨勢。本研究表明，病原菌L.theobromae侵染引起了寄主活性氧的暴發(fā)并激活植物抗氧化系統(tǒng)，隨著病情的發(fā)展，寄主植物的抗氧化能力不斷削弱，導(dǎo)致植物細(xì)胞中活性氧不斷積累以及產(chǎn)生MDA，加速了病害發(fā)展。病原菌L.theobromae侵染油梨枝條過程中，寄主植物活性氧代謝變化顯著，可能和病害發(fā)生密切相關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。