馮金林，席曉宇，趙世鳳

(山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030031)

蛋白質(zhì)N-末端乙酰化(N-terminal acylation，NTA)是廣泛存在于真核生物中的一種蛋白質(zhì)修飾方式，絕大多數(shù)真核生物的胞質(zhì)蛋白會(huì)發(fā)生N-末端乙酰化修飾，但是原核生物和古細(xì)菌中很少發(fā)生[1-2]。NTA是以乙酰輔酶A作為乙?；鶊F(tuán)的供體，通過(guò)N-末端乙酰轉(zhuǎn)移酶(N-terminal acetyltransferase，NATs)的催化將乙?；D(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)N-末端的α-氨基上，主要以共翻譯方式進(jìn)行乙酰化修飾，且這種修飾過(guò)程是不可逆的[3]。N-末端乙?；揎棔?huì)影響多種蛋白質(zhì)的功能。在分子水平上，蛋白質(zhì)的N-末端乙?；瘯?huì)影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、抑制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊，以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等，是維持蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡的重要方式[4-8]。在細(xì)胞水平上，N-末端乙酰化修飾會(huì)影響細(xì)胞增殖發(fā)育、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡等[9-11]。此外，NTA的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致人Ogden綜合征、發(fā)育障礙和癌癥等多種病理情況的發(fā)生，也會(huì)觸發(fā)植物免疫和脅迫響應(yīng)[12-13]。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道了8種不同的NATs，分別為NatA～NatH[12]，其在進(jìn)化上都是保守的[8]。Nats由一個(gè)催化亞基和一個(gè)或兩個(gè)輔助亞基組成并且具有不同的底物特異性，可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生命活動(dòng)[14-17]。

NatE復(fù)合物含有一個(gè)催化亞基Naa50，以及兩個(gè)輔助亞基Naa10和Naa15[18]。在人細(xì)胞中，Naa50傾向以起始甲硫氨酸保留、并且第二個(gè)氨基酸是Leu、Ile、Phe或Trp的底物蛋白進(jìn)行乙?；揎梉19]。人Naa50通過(guò)調(diào)控姐妹染色單體的分離過(guò)程，進(jìn)而參與細(xì)胞分裂的調(diào)控[20]。果蠅Naa50/San蛋白缺失引起膜翅發(fā)育缺陷，Naa50通過(guò)調(diào)控黏連蛋白Scc1與黏附素亞單位Smc3的相互作用，建立或者維持姐妹染色單體的內(nèi)聚力[21-23]。Naa50的缺失會(huì)降低人細(xì)胞系和果蠅細(xì)胞內(nèi)姐妹染色單體的內(nèi)聚力，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生異常有絲分裂[21]。人Naa50基因在酵母中過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致N末端乙酰化水平明顯增加，但是酵母Naa50基因過(guò)表達(dá)沒(méi)有表現(xiàn)出N末端乙酰化水平增加，且敲除酵母中的Naa50基因也未表現(xiàn)出明顯表型變化[19]。此外，Naa50對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育也至關(guān)重要。在擬南芥中，Naa50參與調(diào)控植物免疫應(yīng)答和逆境脅迫響應(yīng)[24]。缺失Naa50會(huì)觸發(fā)植物的免疫防御調(diào)節(jié)機(jī)制，表現(xiàn)出嚴(yán)重的發(fā)育缺陷，以及誘導(dǎo)的脅迫反應(yīng)[24]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，敲除擬南芥Naa50基因的植株對(duì)滲透脅迫表現(xiàn)出超敏反應(yīng)[25]。naa50-1突變體主根的生長(zhǎng)明顯受到抑制，相較于野生型表現(xiàn)出主根較短、根毛較早分化、細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞核大小不均一、幼苗嚴(yán)重矮化且高度不育的表型[25]?；谇捌谘芯?，猜測(cè)naa50-1突變體根短的現(xiàn)象可能是由于Naa50參與根尖細(xì)胞有絲分裂過(guò)程，進(jìn)而調(diào)控根的正常生長(zhǎng)。目前關(guān)于Naa50在植物生長(zhǎng)發(fā)育方面的功能和作用機(jī)制研究較少。

H2B是組成核小體的組蛋白，分析H2B-YFP的熒光信號(hào)，可以反映不同分裂時(shí)期細(xì)胞中染色體的狀態(tài)。為了進(jìn)一步探究Naa50在植物根生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用，本文利用H2B-YFP株系，對(duì)naa50-1突變體根中細(xì)胞分裂情況進(jìn)行分析；用PI染色分析naa50-1突變體的根細(xì)胞活力，還檢測(cè)了根細(xì)胞中CYCB1蛋白表達(dá)水平。研究結(jié)果進(jìn)一步闡明了Naa50調(diào)控根生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 植物材料與試劑

擬南芥[Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.]生態(tài)型為Columbia-0(Col-0)生態(tài)型，naa50-1突變體(CS350943)購(gòu)自Arabidopsis Biological Resource Center。H2B-YFP植株、CYCB1-GUS植株為實(shí)驗(yàn)室前期保存。植物培養(yǎng)基所用MS培養(yǎng)基基鹽購(gòu)自北京中科起源科技有限公司，蔗糖購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，Phytagel、GUS染液和PI染液購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用到的所有種子首先在4 ℃低溫下處理3 d，之后用75%乙醇消毒1 min，1.5%次氯酸消毒10 min，再點(diǎn)種于MS培養(yǎng)基，放入光照16 h(22 ℃)、黑暗8 h(18 ℃)的植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，然后將幼苗移栽到含有蛭石和營(yíng)養(yǎng)液的土壤中，并移入光照16 h(22 ℃)、黑暗8 h(18 ℃)、相對(duì)濕度為65%的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1.2.2 植物根尖細(xì)胞分裂情況觀察

將naa50-1突變體雜合植株與H2B-YFP植株開(kāi)花后進(jìn)行雜交，分別獲得野生型和naa50-1純合突變體背景下含H2B-YFP的穩(wěn)定純合株系，將純合株系的種子在MS培養(yǎng)基上點(diǎn)種并培養(yǎng)6 d，在激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)下觀察幼苗根尖細(xì)胞分裂與野生型的差異。并統(tǒng)計(jì)有絲分裂率、染色體畸變率和微核千分率。

有絲分裂率(%)=(分裂細(xì)胞數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù))×100；

染色體畸變率(%)=(染色體畸變細(xì)胞數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù))×100；

微核率(%)=(微核細(xì)胞數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù))×100。

1.2.3 PI染色

將在MS豎直培養(yǎng)基生長(zhǎng)5 d的野生型與naa50-1突變體幼苗置于載玻片上，滴加適量10 μg·mL-1的碘化丙啶染液(propidium iodide，PI)，染色50 s后，將幼苗用蒸餾水洗滌1次后置于新的載玻片上，將根尖置于載玻片中央，滴加25%甘油后蓋上蓋玻片，用濾紙吸去多余的甘油，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察根細(xì)胞標(biāo)記的熒光信號(hào)。

1.2.4 GUS染色

將naa50-1突變體雜合植株與CYCB1-GUS植株開(kāi)花后進(jìn)行雜交，獲得naa50-1純合突變體背景下含CYCB1-GUS的穩(wěn)定純合株系，將純合株系的種子在MS豎直培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，然后將幼苗的根置于GUS染液中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光染色過(guò)夜。之后將幼苗用蒸餾水洗滌3次，置于載玻片上，將根尖移至中央并滴加適量水合氯醛(水合氯醛∶水∶甘油體積比為8∶3∶1)透明化處理4 h后，在熒光顯微鏡(Olympus DP71)下觀察根尖細(xì)胞有絲分裂活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用Microsoft Excel 2019軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。使用SPSS Statistics 17.0軟件中的Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 naa50突變體表型

利用H2B-YFP標(biāo)記株系對(duì)Naa50在細(xì)胞分裂過(guò)程中的作用進(jìn)行研究，通過(guò)觀察YFP熒光信號(hào)發(fā)現(xiàn)，野生型植株中的主根分生區(qū)細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞核呈規(guī)則球狀，大小相對(duì)均勻；而naa50-1突變體中主根分生區(qū)細(xì)胞排列無(wú)序，細(xì)胞核呈現(xiàn)出不同的形狀，大小不均等，存在較大或較小的細(xì)胞核(圖1)。細(xì)胞排列無(wú)序暗示Naa50的缺失可能造成細(xì)胞分裂方向改變，細(xì)胞核形態(tài)異常暗示Naa50的缺失可能影響了細(xì)胞分裂過(guò)程中遺傳物質(zhì)的平均分配。

利用H2B-YFP對(duì)萌發(fā)5 d的擬南芥根尖細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)的觀察。標(biāo)尺=20 μm。

2.2 naa50-1突變體有絲分裂過(guò)程中染色體分離異常

進(jìn)一步通過(guò)H2B-YFP的熒光信號(hào)觀察野生型和naa50-1突變體中分裂期細(xì)胞的染色體分離行為。與野生型正常的細(xì)胞分裂過(guò)程中染色體分離行為相比，naa50-1突變體表現(xiàn)出異常的細(xì)胞分裂行為，包括微核、染色體橋、多束分裂、不等分裂、細(xì)胞板偏轉(zhuǎn)和雙核現(xiàn)象(圖2)。naa50-1突變體的染色體畸變率和分裂中期細(xì)胞的比例高于野生型(表1、表2)，表明在細(xì)胞分裂過(guò)程中Naa50對(duì)遺傳信息的平均分配起重要作用，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞分裂從中期向后期轉(zhuǎn)變。

表1 Naa50對(duì)擬南芥根尖分生區(qū)細(xì)胞染色體畸變率的影響

表2 Naa50對(duì)擬南芥根尖分生區(qū)細(xì)胞有絲分裂率的影響

圖A、B、C、D分別為野生型細(xì)胞分裂的前期、中期、后期、末期；圖E、F、G、H為naa50-1突變體細(xì)胞分裂前期、中期、后期、末期；圖I為微核；圖J為染色體橋；圖K為多束分裂；圖L為不等分裂；圖M為細(xì)胞板偏轉(zhuǎn)；圖N為雙核現(xiàn)象。標(biāo)尺=5 μm。

2.3 naa50突變體有絲分裂活性

為進(jìn)一步探究Naa50在細(xì)胞分裂過(guò)程中的作用，利用細(xì)胞周期蛋白CYCB1-GUS標(biāo)記株系對(duì)naa50-1突變體中的CYCB1蛋白表達(dá)豐度進(jìn)行檢測(cè)。GUS信號(hào)的結(jié)果表明，相較于野生型，naa50-1突變體中CYCB1的蛋白豐度明顯增加(圖3-A)。這可能是由于naa50-1突變體中分裂中期細(xì)胞比例增加，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂期，是植物本身的一種反饋?lái)憫?yīng)。

2.4 naa50突變體根細(xì)胞活性

細(xì)胞的異常分裂可能會(huì)導(dǎo)致遺傳信息無(wú)法平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，造成產(chǎn)生非整倍體的子細(xì)胞。為了進(jìn)一步探究非整倍體對(duì)植物細(xì)胞的影響，對(duì)野生型和naa50-1突變體的主根進(jìn)行PI染色。PI主要對(duì)野生型根細(xì)胞的細(xì)胞壁進(jìn)行著色，而在naa50-1突變體中，部分細(xì)胞內(nèi)部也有紅色的PI染色信號(hào)，表明這些細(xì)胞已經(jīng)死亡(圖3-B)。以上結(jié)果暗示naa50-1突變體中出現(xiàn)的死細(xì)胞可能是由于非整倍體細(xì)胞的基因組不穩(wěn)定，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

A，利用CYCB1-GUS對(duì)生長(zhǎng)5 d的擬南芥根中CYCB1的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)；B，對(duì)生長(zhǎng)5 d的擬南芥根尖進(jìn)行PI染色；標(biāo)尺=50 μm。

3 結(jié)論與討論

有絲分裂在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是真核生物細(xì)胞分裂的基本方式。在有絲分裂期間，細(xì)胞骨架與膜結(jié)構(gòu)重塑，紡錘體重新組裝，染色體被均勻地分配到兩個(gè)子細(xì)胞中[26]。正是由于多種細(xì)胞機(jī)制調(diào)控染色體的正確分離，才確保了物種之間穩(wěn)定的遺傳特性[27]。異常的有絲分裂會(huì)造成染色體非整倍體的產(chǎn)生，導(dǎo)致染色體不能正常分離，使子代基因組信息不完整，甚至?xí)绊憘€(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育。

本研究結(jié)果表明，Naa50對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞有絲分裂至關(guān)重要，缺失Naa50會(huì)導(dǎo)致根細(xì)胞散亂排列，細(xì)胞核呈現(xiàn)出大小不均等的現(xiàn)象，且表現(xiàn)出不同程度的細(xì)胞死亡現(xiàn)象。另外，naa50-1突變體相較于野生型有絲分裂率下降，染色體畸變率和微核率顯著增加，處在有絲分裂中期的細(xì)胞數(shù)多，細(xì)胞周期蛋白CYCB1的表達(dá)量明顯增加，說(shuō)明Naa50能促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂從中期向后期轉(zhuǎn)移，并且促進(jìn)細(xì)胞分裂過(guò)程中遺傳信息平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。綜上所述，Naa50參與調(diào)控根細(xì)胞有絲分裂，在蛋白質(zhì)共翻譯修飾水平上發(fā)揮作用進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

在真核生物中，NDE1(nuclear distribution protein nudE homolog 1)是動(dòng)力蛋白Dynein的調(diào)節(jié)蛋白，敲除小鼠的Nde1基因，會(huì)造成其皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞紡錘體組裝紊亂和有絲分裂延遲的現(xiàn)象；PLK1是一種在有絲分裂期高表達(dá)的絲蘇氨酸激酶，可以促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞骨架的形成，NDE1是PLK1的一種結(jié)合蛋白，兩者相互作用參與調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂[26]。植物分生組織(如根尖分生區(qū)、莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)等)中連續(xù)、規(guī)則的細(xì)胞依賴于有絲分裂增加其細(xì)胞數(shù)目，促進(jìn)根的生長(zhǎng)發(fā)育，保證植物從周圍土壤中吸收所需的營(yíng)養(yǎng)成分[28-29]。擬南芥根分生組織細(xì)胞的染色體實(shí)時(shí)成像表明，有絲分裂的細(xì)胞中染色體和細(xì)胞骨架表現(xiàn)出高度的動(dòng)態(tài)變化[29]。微管(microfllaments，MFs)和肌動(dòng)蛋白微絲(actin microfilaments，AFs)是細(xì)胞骨架和細(xì)胞分裂所需的重要組成成分，分裂過(guò)程中早前期細(xì)胞分裂平面的選擇、染色體向兩極遷移和形成新細(xì)胞板都需要MFs和AFs的參與[29-31]。因此，MFs和AFs對(duì)細(xì)胞形態(tài)建成和細(xì)胞分裂至關(guān)重要，Naa50是否通過(guò)調(diào)控MFs和AFs而影響細(xì)胞有絲分裂也是未來(lái)非常值得關(guān)注的內(nèi)容。