孫 勇, 張藝嘉, 崔嫻秋, 蔣繼宏

(江蘇師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 徐州 221116)

森林資源的良好發(fā)展對微生物生態(tài)的維持有重要作用,同時,良好的微生態(tài)環(huán)境對樹木的生長也有反哺作用.皇藏峪國家森林公園是中國最大的古樹群落景區(qū)之一,有同緯度保存較完好的落葉闊葉林帶,以青檀樹、側(cè)柏、刺槐、橡樹、泡桐、櫟樹、瓜子黃楊、銀杏、南京椴、五角楓、黃連木、青桐、山杏、酸棗、豆梨、櫻桃、石榴等為主.周邊其他山林也較多,如龍崗山、塔山和龍脊山等山上植被繁茂.這些地區(qū)人員流動較少,工業(yè)欠發(fā)達,人類活動對其生態(tài)環(huán)境破壞極少.皇藏峪地區(qū)呈現(xiàn)喀斯特地貌特征,屬于季風(fēng)氣候,其環(huán)境濕潤,四季變化明顯,果樹叢多,是調(diào)查野生酵母菌等微生物資源的良好場所.

酵母菌是十分重要的單細胞真核微生物,與人類的生活、生產(chǎn)密切相關(guān),在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品防腐保鮮、工業(yè)發(fā)酵、化工原材料制備和醫(yī)藥等方面有著廣泛的應(yīng)用,例如：拮抗酵母菌可用于防治果蔬采摘后的病害,延長果蔬保鮮時間[1-4];布拉氏酵母菌對黃疸患兒有明顯療效[5];在人和動物的腸道中,酵母菌可分泌抑菌性物質(zhì)和誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗性,發(fā)揮對致病菌和條件致病菌的拮抗作用,促進優(yōu)勢種群生長,調(diào)整微生態(tài)平衡[6];酵母菌也可用于水處理,且處理后的剩余污泥中富含蛋白質(zhì)和多種氨基酸等[7-10].

近年來,我們多次在皇藏峪國家森林公園及其周邊地區(qū)采集植物樣品,包括野桃樹、山杏、橡樹、側(cè)柏、豆梨和石榴等,作為分離酵母菌的材料.基于酵母單細胞特性和細胞大小范圍,對傳統(tǒng)的酵母菌分離方法進行了改進,分離的酵母菌株通過26S rDNA D1/D2區(qū)序列比對進行初步鑒定,對不同樹種可培養(yǎng)酵母菌種類進行了分析,為皇藏峪國家森林公園原生態(tài)環(huán)境質(zhì)量以及酵母多樣性研究提供理論參考,為酵母菌的開發(fā)應(yīng)用提供資源保障.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器及設(shè)備超凈工作臺(蘇州凈化);Mupid-exu電泳儀(日本Mupid);Gel Doc RF凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad);TP600型基因擴增儀(日本Takara);D3024臺式高速微量離心機(美國Scilogex);DHP-9025電熱恒溫箱(上海坤誠);LDZX-50KBS高壓滅菌鍋器(上海申安).

1.1.2 培養(yǎng)基YPD液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母膏10 g,蒸餾水1 L.PDA培養(yǎng)基:土豆200 g,蔗糖20 g,蒸餾水1 L,瓊脂粉20 g.

1.2 方法

1.2.1 樣品采集采樣點位于安徽省宿州市北部的皇藏峪國家森林公園及其周邊的龍崗山、塔山和龍脊山等山林,見圖1(地圖來自https://ditu.cncn.com/huaibei).植物樣品為桃、杏、石榴、豆梨掉落的腐爛果實，麻櫟掉落的腐爛堅果和側(cè)柏的果實等有機質(zhì)豐富的材料,同一采樣點至少采集3個樣品,樹種復(fù)雜的采樣點相應(yīng)增加樣品數(shù)量.采集樣品時佩戴手套,采集后的樣品置于信封袋中.為防止交叉,每種樣品一個信封袋,按采樣點編號,記錄樣品名稱、海拔高度、經(jīng)緯度等信息,方便后續(xù)在實驗室中進行酵母菌株分離.

圖1 樣品采集點分布圖Fig.1 Distribution map of sample collection points

1.2.2 酵母菌的分離和純化參照并改進文獻[11]的方法進行酵母菌株的分離和純化:根據(jù)樣品數(shù)量準備無菌的50 mL離心管備用,每個離心管中加入含氯霉素(終濃度為100 μg/mL)的10 mL YPD液體培養(yǎng)基.將樣品分別切成邊長約2 mm的方塊,各取0.5 g放入各自的離心管中,150 r/min搖床上震蕩培養(yǎng)12 h,培養(yǎng)溫度25 ℃.取出擴大培養(yǎng)的樣品,用無菌注射器吸取5 mL發(fā)酵液,先用10 μm孔徑的無菌濾膜過濾器過濾培養(yǎng)液,去除絲狀真菌和雜質(zhì)(殘留在濾膜上),再用3 μm孔徑的無菌濾膜過濾濾液(酵母大部分留在濾膜上)，后棄掉濾液,用無菌水反復(fù)沖洗濾膜以減少細菌數(shù)量.取下濾膜置于無菌平板上,用無菌水再次反復(fù)沖洗濾膜,沖洗液用1.5 mL的離心管收集,顯微鏡下觀察和估算酵母菌數(shù)量,然后10倍梯度稀釋2次.從不同梯度的稀釋液中各取100 μL,按先稀后濃的順序涂布于倒好的PDA平板培養(yǎng)基上,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天查看1次菌落的生長狀態(tài),連續(xù)查看2 d.菌落長出后,用無菌槍頭蘸取需要進一步培養(yǎng)的菌落,采用四區(qū)劃線法在PDA平板培養(yǎng)基上進一步純化.純化得到的菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中,在28 ℃搖床上培養(yǎng)3 d后,用菌液與質(zhì)量濃度為40%的甘油按體積比1∶1混合后冷凍保藏(-80 ℃).鑒定后的菌株,交由保藏中心用液氮和冷凍干燥等方法進行永久或長效保藏.

1.2.3 酵母菌株DNA的提取菌株純化后,挑取芝麻粒大小的菌體,置于1.5 mL的無菌離心管中,-20 ℃冰凍2 h后，立即加入質(zhì)量濃度為2%的CTAB 200 μL,再加入1/2體積的石英砂，離心管置于65 ℃的水浴鍋中溫浴1.5 h，加入PCI混合溶液(VTris-飽和酚∶V氯仿∶V異戊醇=25∶24∶1),劇烈震蕩1 min后,10 000 r/min離心10 min.吸取100 μL上清液移至新的離心管中,加入100 μL異丙醇,混勻,-20 ℃下孵育2 h,沉淀DNA.10 000 r/min離心10 min后,去上清液,沉淀用體積分數(shù)為75%的乙醇洗滌后,置于超凈工作臺上自然干燥,使用30 μL去離子水溶解提取到的DNA,置于-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹12].

1.2.4 酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列擴增及測序選擇酵母菌通用擴增引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)/NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)進行酵母菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)序列擴增[13].

PCR的反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性20 s,52 ℃退火20 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min.擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,制備質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠,每孔上樣量為5 μL,150 V電壓下電泳20 min后EB染色,在UV凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄,好的擴增產(chǎn)物條帶單一且清晰,大小約為600 bp,剩余的擴增產(chǎn)物送往上海生工生物技術(shù)公司測序.測序結(jié)果在Chromas軟件中分析數(shù)據(jù)的可靠性,用Editseq軟件打開序列數(shù)據(jù),將序列在NCBI網(wǎng)站上進行比對,對比結(jié)果及序列合并保存.

1.2.5 菌株系統(tǒng)樹的構(gòu)建用軟件MEGA 6.0將每一個樣品分離的酵母菌株基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列進行聚類，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，在發(fā)育樹中顯示菌株分離鑒定結(jié)果和菌株重復(fù)數(shù)量.

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母的分離效果

與傳統(tǒng)分離方法(圖2A、B)相比，改進的酵母菌分離方法增加了2次過濾步驟,處理后的平板培養(yǎng)狀態(tài)如圖2C、D所示.酵母菌的細胞濃度可以隨機調(diào)節(jié),涂布的平板上酵母菌落生長密集,數(shù)量和種類較多,細菌菌落占比極少(酵母菌落和細菌菌落可通過質(zhì)地、透光度和細胞大小分辨),絲狀真菌極少或沒有,即除單細胞的酵母菌外,擴張很快的絲狀雜菌對酵母菌的生長和后期純化影響極小.可見，改進的分離方法排除了細菌和絲狀真菌對酵母菌的干擾,有利于延長分離平板的培養(yǎng)時間及鑒別、挑選酵母菌株,提高獲得酵母純菌株的幾率.

A.不過濾分離(原液); B.不過濾分離(稀釋10倍); C.2次過濾(原液); D.2次過濾(稀釋10倍).圖2 分離平板上的菌落情況Fig.2 Colonies on the separation plate

2.2 同一采樣點可培養(yǎng)酵母種群分析

采樣點2以北緯117°4′10″,東經(jīng)34°1′47″為中心,面積約0.2 km2,地形為兩面山坡圍成的山峪,從北向南海拔逐漸升高,海拔高度為60～300 m;主要以側(cè)柏林為主,點綴幾片小桃林和零星的杏樹、洋槐等.采集側(cè)柏成熟球果、腐爛桃果和杏果作為酵母菌株的分離材料,分離后獲得的酵母菌株進一步純化保存.以這些菌株的DNA為模板,進行26S rDNA D1/D2區(qū)序列擴增獲得PCR產(chǎn)物,測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上比對,所有樣品的鑒定結(jié)果見系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3—5).

每行依次為菌株號、種名、最高相似度、重復(fù)鑒定菌株數(shù).疑似新種菌株號加粗.下同.圖3 桃果分離獲得的酵母菌株基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 domain sequences of the yeast strains isolated from peach fruit

圖4 杏果分離獲得的酵母菌株基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 domain sequences of the yeast strains isolated from apricot fruit

圖5 側(cè)柏樣品分離獲得的酵母菌株基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 domain sequences of the yeast strains isolated from platycladus orientalis

桃果樣品2個(編號A、T)，共鑒定酵母菌株39株，20個種，分屬于Papiliotrema、Kwoniella、Meyerozyma、Wickerhamomyces、Rhodotorula等18個酵母屬，其中Papiliotremaflavescens和Kwoniellabestiolae菌株重復(fù)較多，2個分離樣品共有交叉重復(fù)的菌株19株，僅4個種，表明同一樹種重復(fù)分離是必要的；從桃果樣品獲得了5個潛在新種，分別為Anhui A25(Tremellasp.)，Anhui A6和Anhui T8(Vishniacozymasp.)，Anhui T17(Cystofilobasidiumsp.)，Anhui T6和Anhui A22(Colacogloeasp.)，Anhui A20(Hamamotoasp.)(圖3).

杏果樣品2個(編號B、X)，共鑒定酵母菌株24株，10個種，分屬于Papiliotrema、Kwoniella、Vishniacozyma、Filobasidium、Curvibasidium、Sporidiobolus、Colacogloea、Hanseniaspora、Wickerhamomyces9個酵母屬，其中Vishniacozymatephrensis、Kwoniellabestiolae和Filobasidiummagnum重復(fù)菌株較多，2個分離樣品共有交叉重復(fù)的菌株15株，屬于4個種；另外,發(fā)現(xiàn)3個潛在新種，其中2個新種在桃樹上也分離到.與在桃樹上分離的酵母菌種相同的為Papiliotremaflavescens、Kwoniellabestiolae、Colacogloeasp.和Vishniacozymasp. 4個菌種(圖4).

側(cè)柏球果樣品1個(編號S),共獲得酵母菌株33株,鑒定為16個種,分屬于Aureobasidium、Bullera、Curvibasidium、Vishniacozyma、Papiliotrema、Sporidiobolus、Rhodosporidiobolus、Tremella、Hannaella、Pseudotremella10個酵母屬,其中Aureobasidiumnamibiae和Curvibasidiumpallidicorallinum重復(fù)菌株較多;另外，獲得3個潛在新種(圖5).

該采樣點共分離鑒定了酵母菌株96株,歸屬于25個屬,36個種,7個種為潛在新菌種,新種獲得率較高.不同的樹種材料分離的酵母菌株中,優(yōu)勢菌種存在差異,36種酵母菌中,桃樹獨有的菌種12個,杏樹獨有的5個,側(cè)柏獨有的9個,桃和杏有4個種相同,桃和側(cè)柏有4個種相同,杏和側(cè)柏有3個種相同,3種植物共有的有2個種(Papiliotremaflavescens和Vishniacozymasp.).這表明,即使是在同一區(qū)域,不同樹種上的酵母菌種類也存在較大差別.

2.3 皇藏峪國家森林公園及其周邊區(qū)域酵母菌種的初步調(diào)查

在皇藏峪國家森林公園內(nèi)以北緯117°4′10″、東經(jīng)34°1′47″為中心設(shè)置1個采樣點，在其周圍的龍崗山(北緯117°3′20″,東經(jīng)34°2′2″)、塔山(北緯116°59′50″,東經(jīng)33°55′41″)和龍脊山(北緯116°28′48″,東經(jīng)33°54′48″)等地設(shè)置6個采樣點(圖1).采集的樣品來自杏、豆梨、橡樹、桃、石榴等植物,分離獲得了562株酵母菌株,對其中的216株菌株進行26S rDNA D1/D2區(qū)序列測序,在NCBI網(wǎng)站上比對，分類鑒定結(jié)果見表1.鑒定的216株酵母菌株歸屬于37個屬,68個種(子囊菌酵母25種,擔(dān)子菌酵母43種);潛在新種11個,分屬于子囊菌的Metschnikowia屬和Wickerhamomyces屬,擔(dān)子菌的Cryptococcus屬、Tremella屬、Cystofilobasidium屬、Rhodotorula屬、Fibulobasidium屬、Vishniacozyma屬、Colacogloea屬和Hamamotoa屬,潛在新種占16.2%.

表1 皇藏峪國家森林公園及其周邊的酵母種類Tab.1 Yeast species isolated from Huangcangyu National Forest Park and its surroundings areas

3 討論

通常,分離酵母菌的方法包括樣品的處理、酵母富集培養(yǎng)、梯度稀釋后涂布分離、酵母的挑選和純化[11,14-15].富集培養(yǎng)主要利用的是培養(yǎng)基差異和加入抗生素來抑制酵母菌外的微生物生長,這種分離方法對細菌的抑制程度小,部分細菌具有抗藥性,會和酵母菌一起生長,影響酵母單菌落的生長和后期的分離純化.絲狀真菌如沒有去除措施,其快速擴展會導(dǎo)致酵母菌落還未表現(xiàn)出個體差異就被絲狀真菌覆蓋，影響后期酵母菌落的挑選和純化.本研究改進的分離方法增加了2步過濾步驟：樣品富集培養(yǎng)時,絲狀真菌的孢子已經(jīng)變成菌絲,通過10 μm濾膜去除,較好地解決了絲狀真菌的干擾;3 μm濾膜的過濾及多次沖洗可以去除大部分的細菌.值得注意的是,使用這種方法過濾時樣品要干凈,且不能過碎,否則不易過濾;濾液量少而稀才能發(fā)揮濾膜的選擇作用.

影響酵母菌種調(diào)查的因素很多,除同一區(qū)域不同樹種分離的酵母不同外,不同區(qū)域同一樹種分離的酵母菌種類也存在差異.培養(yǎng)法是獲取微生物資源、用于實際應(yīng)用的主要途徑,能部分反映取樣地區(qū)微生物的豐富度,經(jīng)過分離和培養(yǎng)過程,平板上獲得的菌株數(shù)量與實際情況會有較大差異,主要表現(xiàn)在分離中的富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)時,不同的菌株生長和分裂速度不一樣,導(dǎo)致分析結(jié)果與事實可能不一致;另外,挑取菌落用于鑒定時,帶有一定的人為主觀因素,菌株重復(fù)或不全面與挑菌人員的知識儲備有很大關(guān)系.因此，培養(yǎng)法僅能調(diào)查到一個地區(qū)酵母菌的部分種類.我們僅對皇藏峪國家森林公園部分植物進行了調(diào)查，從目前分離和鑒定的結(jié)果看,分離到37個屬，68個種及潛在新種11個，表明該地區(qū)酵母多樣性非常豐富,值得進一步采樣分離,獲取菌種資源,從而為后續(xù)的酵母菌功能研究及酵母菌資源開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ).