栗 靜 胡風云 劉 毅

山西醫(yī)科大學第五臨床醫(yī)學院，山西 太原 030000

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，全球每年估計有240萬人被診斷為癲癇。因此，每13 秒就有一個人被新診斷為癲癇。癲癇是一種以腦神經(jīng)元異常放電為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。癲癇持續(xù)狀態(tài)可導致神經(jīng)元損傷和膠質(zhì)細胞增生［1］，可能會造成腦組織損傷，約有15%病死率。一些未有確切病因的昏迷或者意識不清的患者往往存在非驚厥性SE，這類患者只能靠腦電圖來診斷，故常常被漏診。盡管已有20 多種抗癲癇藥物被批準用于臨床，大約有30%的患者癲癇發(fā)作仍未受控制［2］。外泌體（exosomes）來源于內(nèi)吞膜，可以將信號傳遞給受體細胞，從而介導一種細胞間通訊的新機制。在細胞間通信中的基本作用為其用于疾病的診斷和治療提供了許多可能性。我們旨在對血清外泌體在癲癇診療中的研究進展進行綜述，對未來進一步研究泌體作為可能的癲癇理想診斷標志物及治療干預靶點提供參考。

1 外泌體概念及其作為生物學標志物的特性

外泌體是一種小的（30～150 nm）膜囊，是納米級囊泡［3-4］，起源于細胞膜的表面，由于細胞膜的內(nèi)吞作用而形成的內(nèi)吞小體，通過內(nèi)向的出芽作用包涵一定的內(nèi)容物，可攜帶的分子包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、mRNA 和miRNAs 等，之后變?yōu)槟遗莼蛘叨喟w，后釋放到細胞外環(huán)境［5］中形成外泌體。它可以作為獨立細胞器，作用于胞外靶細胞或器官，是細胞之間相互作用的一種新方式。基于外泌體的結(jié)構(gòu)和生成的分泌過程，越來越多研究證實，外泌體可以自由通過血腦屏障［6］，也可以由其他的細胞通過胞吞、胞吐等方式內(nèi)化［7］。外泌體參與維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、胞間通訊、神經(jīng)保護、細胞突觸可塑性、神經(jīng)再生等過程。作為一種物質(zhì)交換和信息傳遞的基本系統(tǒng)［8］，外泌體在神經(jīng)細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能中的作用舉足輕重。此外，由于外泌體同樣也可存在于外周血中，可能成為更容易獲得的生物標志物。

外泌體因其優(yōu)異的傳播能力和優(yōu)良的穩(wěn)定性而越來越受到醫(yī)學界的關(guān)注。miRNA是目前外泌體中研究較多的一種分子。miRNA是一種非編碼的雙鏈RNA 分子，長度為20-22 個核苷酸，前面的序列有一個莖環(huán)狀的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。已知miRNA具有通過靶向多個mRNA來控制mRNA降解和翻譯的轉(zhuǎn)換能力。它已經(jīng)在許多miRNAs 作為基因表達的轉(zhuǎn)錄后抑制劑的生理和病理過程中被積極探索。通過對人類細胞和組織的高通量測序，已經(jīng)鑒定出了不同的miRNA譜。這些小的非編碼RNA可能是潛在的新的疾病特異性生物標記物，以及其他tRNAs、snoRNAs 和piRNAs的RNA家族。最近的研究指出，體液來源的外泌體是miRNAs 的潛在來源，而循環(huán)外泌體中的miRNAs已被用作潛在的診斷生物標志物，用于癌癥和其他疾病的無創(chuàng)診斷［9］。最近的證據(jù)顯示，外泌體的一個關(guān)鍵特征是它們可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）和外周循環(huán)［10］之間傳播。這一特性可能導致循環(huán)外泌體作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生物標志物。循環(huán)miRNAs 的表達變化已經(jīng)在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中被注意到，包括帕金森病、阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、缺血性卒中和癲癇。因此外泌體miRNA有望成為輔助臨床診斷及判斷臨床療效的生物標志物［11］。外泌體脂質(zhì)雙分子層可保護遺傳信息不被降解，并且能穩(wěn)定存在于不同體液之中，使外泌體miRNA 在外周中易獲取。有研究顯示外泌體miRNA 能在4℃條件下穩(wěn)定保存2 d，這有利于在實驗之前標本的質(zhì)量控制［12］。鑒于外泌體結(jié)構(gòu)和生物學特性，我們推測外泌體可以作為癲癇的生物標志物。

2 外泌體可作為癲癇診斷性標志物

癲癇的診斷是具有挑戰(zhàn)性的，一旦癲癇發(fā)作，在癲癇發(fā)作之間通常無明顯和具體的臨床癥狀。另一方面，癲癇發(fā)作，往往是偶發(fā)的和短的事件，相對于無發(fā)作間隔，往往不容易被主治醫(yī)生觀察到。因此，癲癇的診斷主要依賴于患者和觀察者提供的病史。此外，癲癇發(fā)作的癥狀可能是微妙的，而且很容易被那些不是醫(yī)療專業(yè)人員忽視［13］。即使在能獲得連續(xù)視頻腦電圖（EEG）記錄的癲癇監(jiān)測單元中，腦電圖的診斷價值仍然是有限的。癲癇的分類復雜，臨床表現(xiàn)不同，對診斷有很大的挑戰(zhàn)。因此，為癲癇診斷提供無侵入性支持、廉價、快速的分子診斷生物標志物具有重要價值［14］。

外泌體在正常和病理條件下均由細胞釋放。它們攜帶多種類型的小分子，如核酸和蛋白質(zhì)，因此被認為是發(fā)現(xiàn)臨床診斷的生物標志物的關(guān)鍵。如載有腫瘤特異性RNA的外泌體被用作癌癥診斷的生物標志物，外泌體蛋白被認為是多種疾病的潛在生物標志物，包括癌癥、肝病和腎臟疾病。它們包含多種生物標志物，如TSG101、帶電荷的多泡體蛋白2a（CHMP2A）、ras 相關(guān)蛋白Rab-11B（RAB11B）、CD63和CD81蛋白和脂質(zhì)，包括膽固醇、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺和磷脂酰絲氨酸。外泌體的大分子成分在細胞功能和病理狀態(tài)中發(fā)揮重要作用，如炎癥［15］、免疫反應、血管生成、細胞死亡、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥［16］。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷中，外泌體miRNA 是一種新型潛在的生物標志物，內(nèi)源性的核糖核酸酶不會對它造成不良影響。一些醫(yī)學研究表明，血清miRNA 在癲癇患者中有明顯變化［17］。外泌體等微囊泡可以在腦損傷或刺激后釋放，并作為癲癇的生物標志物。如杏仁核內(nèi)紅藻酸誘導的癲癇持續(xù)狀態(tài)導致ESCRT依賴和非依賴信號通路的上調(diào)，從而增加小鼠外泌體的釋放。這種作用持續(xù)很長時間，癲癇持續(xù)狀態(tài)2周后仍可檢測到外泌體分泌增強［18］。此外，來自動物和人類的研究表明，某些類型的外泌體miRNA 與癲癇高度相關(guān)。在老鼠身上前腦細胞外囊泡減少［19］。此外，一項涉及40 例顳葉中葉癲癇伴海馬硬化（mTLE-HS）患者的臨床研究顯示，2 個外泌體miRNAs 表達上調(diào)，48 個miRNAs 表達下調(diào)。在這些候選基因中，外泌體miRNA-8071 對診斷mTLE-HS的敏感性為83.33%，特異性為96.67%［20］。在另一項研究中，外泌體循環(huán)miRNAs，如miR194-2-5p、miR15a-5p、miR132-3p 和miR145-5p，已被報道為局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良和難治性癲癇患者的潛在生物標志物［21］。這些研究表明，癲癇可以改變外泌體的釋放及其miRNA 的含量，這可能是臨床診斷的一個潛在的生物標志物。一項由美國韋恩州立大學，底特律密歇根兒童醫(yī)院，中央密歇根大學，特拉華大學的研究發(fā)現(xiàn)［22］，結(jié)節(jié)性硬化癥相關(guān)癲癇中的外泌體可以作為促炎性microRNA 的攜帶者，結(jié)節(jié)性硬化癥（tuberous sclerosis，TSC）是一種罕見的、嚴重的、兒童期發(fā)生的常染色體顯性遺傳病，約85%的TSC 患者存在癲癇癥狀，多達2/3的TSC患者是藥物難治性癲癇。研究結(jié)果顯示具有TLR 7/8 激活基序的microRNA 在致癇性外泌體中富集［23］，信號通路響應模式呈劑量依賴性增加，癲癇外泌體誘導的基因網(wǎng)絡具有高度的連接性，離體致癇性外泌體誘導的基因表達模式與致癇組織中的同樣明顯，這項研究表明外源性microRNAs 與介導細胞間信號傳導的神經(jīng)炎癥有關(guān)，并為這種信號級聯(lián)在耐藥癲癇中的存在提供了新的證據(jù)，為以后研究耐藥癲癇的神經(jīng)炎癥機制奠定了基礎，同時闡明了耐藥性癲癇新的治療靶點和生物標志物，為非侵入性監(jiān)測癲癇易感性和治療提供一種手段，需要進一步的外泌體研究來確定不同類型的癲癇亞型，以確定特定的miRNA 對癲癇發(fā)生的病理生理意義。

除了外泌體miRNA 可應用于癲癇的相關(guān)研究中，一項大型臨床樣本和兩個慢性癲癇小鼠模型的的研究數(shù)據(jù)表明［24］，兩種血清外泌體蛋白凝血因子IX（F9）和血栓反應蛋白-1（TSP-1）是特異的癲癇診斷生物標志物，這是對癲癇中外泌體蛋白的首次研究。另一項在兒童中進行的研究顯示，癲癇和獲得性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的兒童血清α-突觸核蛋白水平顯著升高，并與疾病的嚴重程度相關(guān)［25］。這些研究表明外泌體蛋白也是診斷癲癇的很有前景的新工具。

3 外泌體可應用于癲癇的治療

當外泌體在1983年最初被發(fā)現(xiàn)時，人們并未預料到其顯著的治療潛力［26］。今天，外泌體被認為在生物醫(yī)學應用中具有巨大的潛力。外泌體通過將其內(nèi)容物，如功能蛋白、mRNA 轉(zhuǎn)錄和miRNA［27］，可不通過細胞之間直接接觸傳遞到受體細胞。由于外泌體的顯著特征，它們能夠減少炎癥［28］，通過血腦屏障，使多次靜脈給藥沒有任何不良反應，并能改善神經(jīng)系統(tǒng)功能［29］。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）來源于中胚層的多能干細胞［30］，有自我更新、向不同間充質(zhì)系列細胞或者非間充質(zhì)細胞分化、分泌細胞外囊泡及細胞因子、免疫調(diào)節(jié)等特點，被廣泛應用在組織的修復相關(guān)研究中。

間充質(zhì)干細胞來源的外泌體通過增強細胞外基質(zhì)重塑，抑制促炎細胞因子的表達，發(fā)揮抗炎作用，及促進組織再生［31］。近年來研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞外泌體由于其強大的抗炎和神經(jīng)保護特性［32］，對癲癇［33］、多發(fā)性硬化［34］、阿爾茨海默癥［35］、腦血管?。?6］、脊髓損傷［37］等疾病具有組織修復的功效［38］，逐漸應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。神經(jīng)炎癥是許多神經(jīng)精神疾病的一個重要的病理過程［39］，要么作為一個病因，要么作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的繼發(fā)性反應?；罨男∧z質(zhì)細胞釋放促炎和抗炎因子［40］，這些因子在神經(jīng)炎癥過程中被證明是有益和有害的。星形膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出與小膠質(zhì)細胞［41］相似的表型，以及對促炎刺激和損傷的免疫反應。然而，已有研究表明，星形膠質(zhì)細胞增生通常比小膠質(zhì)細胞增生更持久，并被認為在放大炎癥過程，從而誘導更大的損傷方面更為重要。星形膠質(zhì)細胞已被證明在調(diào)節(jié)和抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，保護星形膠質(zhì)細胞免受炎癥刺激或改善炎癥誘導的星形膠質(zhì)細胞改變可能是許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種很有前景的治療策略。盡管骨髓間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)特性在治療包括大腦在內(nèi)的各種器官的炎癥性疾病方面顯示出了希望，但目前的證據(jù)表明，MSC-Exo比間充質(zhì)干細胞具有更大的治療潛力，它們攜帶許多抗炎因子，如mRNA、microRNA 和蛋白質(zhì)，免疫原性較低，而且比骨髓間充質(zhì)干細胞［42］更容易存儲和管理應用于治療。MSC-Exo 可以在體內(nèi)外納入海馬星形膠質(zhì)細胞，這對于未來MSC-Exo 靶向海馬星形膠質(zhì)細胞治療藥物的開發(fā)具有重要意義。一項在匹羅卡品誘導的SE 小鼠研究中顯示［43］，MSC-Exo 治療改善了炎癥誘導的星形膠質(zhì)細胞改變，包括反應性星形膠質(zhì)細胞增生、炎癥反應、異常鈣信號和線粒體功能障礙，并減少了學習和記憶障礙。以上研究表明MSC-Exo可能是一種潛在用于癲癇的納米治療藥物。人骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）分泌的A1-外泌體（A1-exosomes），具有強大的抗炎特性，另一項研究利用毛果蕓香堿建立的癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）小鼠模型［44］，確定了鼻腔給藥對MSCs來源的A1-外泌體的治療效果。首先，研究者衡量了在SE后的早期階段，鼻腔給藥A1-外泌體進入海馬、抑制炎癥、保護谷氨酸能和GABA 能神經(jīng)元的能力。接下來，研究者衡量了在SE后的慢性期，在持續(xù)抑制炎癥的情況下，鼻腔給藥A1-外泌體在維持正常的神經(jīng)發(fā)生、認知和記憶功能。結(jié)果表明，A1-外泌體鼻腔給藥可減輕癲癇持續(xù)狀態(tài)的多種不良反應，如減少神經(jīng)元丟失和炎癥，維持正常的神經(jīng)發(fā)生，并保護認知和記憶功能。這對臨床應用A1-外泌體抑制SE所致?lián)p傷向慢性海馬功能障礙的演變具有重要意義。該結(jié)果還暗示，鼻腔給藥A1-外泌體對其他表現(xiàn)為神經(jīng)炎癥的神經(jīng)系統(tǒng)疾病也可能有治療作用。

4 小結(jié)與展望

外泌體在細胞間通信中的基本作用為其用于疾病的診斷和治療提供了許多可能性。外泌體的內(nèi)容物可以反映其來源細胞的功能狀態(tài)。因此，對外泌體的內(nèi)容物及其細胞類型特異性表面蛋白從體液中分析成為具有吸引力的靶點，以探測疾病病理，而不是組織活檢。對于腦部疾病尤其如此，因為要獲得腦組織是很少可能的。而且外泌體的磷脂雙層結(jié)構(gòu)使其能跨越生物屏障，分泌至腦脊液、唾液、血液、尿液和乳汁中。外泌體作為理想的生物標記物轉(zhuǎn)運器，可以避免體液中的各種酶對其內(nèi)RNA、蛋白的降解，因此通過外周體液外泌體的研究途徑了解腦源性疾病被稱為液體腦活檢。外泌體在癲癇診斷與治療領(lǐng)域有重要的前景，其在細胞間通信中的基本作用為其用于癲癇的診斷和治療［45］靶點提供了許多可能性，因為目前一些研究報道了癲癇腦損傷后外泌體數(shù)量及其內(nèi)容物的急性變化，癲癇腦損傷后對外泌體相關(guān)基因表達的調(diào)節(jié)可能是持久的。重要的是，外泌體也正在作為改善恢復癲癇腦功能的治療藥物。然而，了解外泌體在癲癇發(fā)生和癲癇中的機制和治療潛力，以及抗癲癇藥物對外泌體代謝和內(nèi)容物的影響研究還處于起步階段，迫切需要進一步的研究來探索外泌體作為癲癇生物標志物和共病修飾藥物的潛力，以及治療的靶點，以改善癲癇患者的預后。