馬玲玲，馬紅梅，吳霜，王東，李勇，馬臣杰，曾瑾

1．寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，寧夏 銀川 750021；2．寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，C.p.）又稱魏氏梭菌，是一種革蘭陽性厭氧芽孢形成菌，廣泛分布于自然界，特別是土壤和人類、動物的腸道［1］，感染者血管中會出現(xiàn)氣泡，該性狀與壞疽性氣體的感染癥狀相似［2］。該菌可引起人類食物中毒及動物的膿毒血癥、壞死性腸炎、氣性壞疽等疾?。?-4］，給人類健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重威脅。據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）統(tǒng)計，C.p.病是美國第二大常見食源性疾病，占總發(fā)病率的26%［5］。我國也有關(guān)于C.p.感染的報道，2016年，北京市順義區(qū)暴發(fā)1 起由C 型C.p.毒素導(dǎo)致的食物中毒事件［6］；2015年，對我國4 個省份的907 份豬糞便樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)豬場普遍攜帶C. p.，母豬感染比例達(dá)75%，哺乳仔豬感染達(dá)80%［7］。

C.p.是一種條件致病菌，當(dāng)外界環(huán)境或寄主環(huán)境適合其大量增殖，并分泌毒素時可導(dǎo)致疾病［8］，C.p.致病因子主要是其產(chǎn)生的外毒素及胞外水解酶。目前，已知C.p.分泌23 種外毒素或酶類［9］，其中α、β、ε、ι 為主要致死毒素，根據(jù)這4 種主要毒素，可將C.p.分為A、B、C、D、E 共5 種血清型。C.p.β1毒素（Clostridium perfringensBeta1 toxin，CPB1）是B和C 型菌株產(chǎn)生的一種成孔毒素，相對分子質(zhì)量約34 000，等電點(diǎn)為5.6，以多聚體形式存在［10］，該毒素具有細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性，可引起人和動物的壞死性腸炎。因此，早期檢測C.p感染對相關(guān)疾病的預(yù)防和篩查尤為重要。目前，主要檢測方法包括微生物分離培養(yǎng)鑒定法、普通PCR 法、實(shí)時熒光定量PCR法、ELISA 法和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法等［11］。其中，普通PCR 檢測法僅能進(jìn)行定性檢測，不能檢測毒素基因的表達(dá)及分泌情況，還具有易出現(xiàn)假陽性、工作繁瑣、周期長及不適用大批量檢測等缺點(diǎn)；ELISA 法特異性及靈敏性高，易于操作，檢測速度快，適用大量樣品檢測，廣泛應(yīng)用于臨床疾病檢測及實(shí)驗室病原研究。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)CPB1，以其為包被抗原建立檢測CPB1 抗體的間接ELISA 法，并對CPB1的包被濃度、一抗稀釋度、封閉條件、二抗稀釋度等檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，同時確定方法的臨界值，驗證特異性、靈敏度、重復(fù)性，以期用于C.p.感染臨床血清樣品的檢測和相應(yīng)疫苗免疫效果的評價。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及細(xì)胞 感受態(tài)E.coliBL21（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；載體pET32a、C.p.A型菌（ATCC 3624和57-1）、C.p.B型菌（58-2）、C.p.C型菌（59-2和59-44）的培養(yǎng)液和E.coli（C83529、C83905、C83684、C83922、C14208）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（ATCC19115）、沙門菌（CMCC50115）、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的培養(yǎng)物均由寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗室制備；CPB1雜交瘤細(xì)胞株1K19及21株CPB2雜交瘤細(xì)胞株均由艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司制備。

1.2 血清 201 份牛血清樣品采自寧夏某牛場；感染C.p.的2 份小鼠陽性血清及2 份免疫生理鹽水的小鼠陰性血清均由寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗室制備。

1.3 主要試劑及儀器 限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ及T4 DNA連接酶購自英國New England Biolabs公司；胰蛋白胨、酵母粉及腦心浸液培養(yǎng)基購自英國OXOID公司；彩色預(yù)染蛋白marker（26616）購自美國Thermo Fisher 公司；5×SDS-Tris-甘氨酸緩沖液購自上海百賽生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖（AGAROSE）購自法國BIOWEST 公司；IPTG、牛血清白蛋白及Tween20購自北京索萊寶科技有限公司；膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自美國AxyGen 公司；GelRed購自美國Biotium 公司；氨芐青霉素及卡那霉素購自美國USBIOANALYZED 公司；20×PBS Buffer及瓊脂粉（Agar）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；脫脂奶粉購自美國BD Difco 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG北京中杉金橋生物有限公司；液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；快速封閉液購自新賽美生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；兔抗牛IgG 購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；AKTA 純化系統(tǒng)及Protein G 均購自思拓凡科技有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.4 目的基因的擴(kuò)增根據(jù)GenBank 中登錄的cpb1基因序列（X83275.1），應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，F(xiàn)orward：5′-CGCCATGGCTAATGATATAGGCAAAACTACTACTAT-3′，Reverse：5′-GAATGAATTCAATAGCTGTTACTTTATG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為930 bp。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。以C 型C. p.的59-2 基因組為模板擴(kuò)增cpb1基因，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃30 s，56 ℃45 s，72 ℃45 s，共30個循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 膠回收PCR產(chǎn)物，與載體pET-32a均經(jīng)NcoⅠ及EcoRⅠ雙酶切，回收目的基因和載體片段，以T4 DNA 連接酶于4 ℃連接過夜；連接產(chǎn)物涂布于含100 μg／mL 氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取單克隆，分別進(jìn)行單酶切（EcoRⅠ）、雙酶切（NcoⅠ和EcoRⅠ）和三酶切（NcoⅠ、HindⅢ和EcoRⅠ）鑒定，陽性克隆送金斯瑞生物科技公司測序。將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET32a-cpb1。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET32a-cpb1轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21（DE3），于37 ℃培養(yǎng)12 h；挑取陽性單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，加入IPTG至終濃度0.1 mml／L，20℃誘導(dǎo)3 h；收集菌體，7 104×g離心5 min，PBS重懸沉淀，超聲破碎，分別取上清和沉淀，進(jìn)行12%SDS-PAGE 分析，同時設(shè)空載體和未誘導(dǎo)表達(dá)作為對照，BCA法測定蛋白濃度。

1.7 McAb 1K19的制備及純化 將雜交瘤細(xì)胞株1K19于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期進(jìn)行傳代，繼續(xù)培養(yǎng)至過度生長以富集抗體，約5 d后，待培養(yǎng)液變酸（變黃色）后，取細(xì)胞培養(yǎng)液，1 500×g離心10 min，收集上清，按1∶100稀釋，采用鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒檢測McAb 1K19 亞型。上清經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌。采用AKTA 純化系統(tǒng)經(jīng)Protein G純化McAb 1K19，用0.1 mol／L Glycine-HCl（pH 2.7）緩沖液洗脫，進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

1.8 方法的建立 用重組蛋白CPB1 包被96 孔板，100 μL／孔，4 ℃包被過夜；PBST洗滌液（含2‰Tween20的PBS）洗滌3次，每次5 min，用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉；PBST洗滌3次，每次5 min，加入待檢樣品，同時設(shè)空白對照（PBS）及陰性對照（CPB2 單克隆抗體），100 μL／孔，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌3次，每次5 min，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG，100 μL／孔，37 ℃孵育30 min；PBST 洗滌3次，每次5 min，加入OPD顯色液，50 μL／孔，用2 mol／L H2SO4溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定A450。

1.9 方法的優(yōu)化

1.9.1 抗原包被濃度及抗體稀釋度的確定 將重組蛋白CPB1用包被緩沖液（NaCO31.59 g，NaHCO32.93 g，ddH2O 100 mL，pH 9.6）稀釋為2、5、8、10 μg／mL，包被96 孔板；用5%脫脂奶粉于37 ℃封閉30 min；以McAb 1K19作為一抗，用包被緩沖液分別進(jìn)行1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096、1∶8 192、1∶16 384 稀釋，加入96 孔板；加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2 000稀釋）；其他步驟同1.8項。

1.9.2 二抗稀釋度的確定 用最佳抗原包被濃度的重組蛋白CPB1包被96孔板，用5%脫脂奶粉于37 ℃封閉30 min；加入最佳稀釋度的McAb 1K19；將HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000 進(jìn)行梯度稀釋，加入96 孔板；其他步驟同1.8項。

1.9.3 封閉時間的確定 用最佳抗原包被量包被96孔板，以5%脫脂奶粉為封閉液，分別孵育30、60、90和120 min；加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2 000 稀釋）；其他步驟同1.8項。

1.10 臨界值的確定 采用建立方法檢測21 株陰性抗體（21 株CPB2 雜交瘤細(xì)胞株），計算樣品的A450平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)方差（SD），當(dāng)A450≥+3SD時，判定為陽性；A450≤+ 2SD時，判定為陰性，介于二者之間時，判為疑似。

1.11 方法的驗證

1.11.1 特異性 分別以C.p.A 型菌（ATCC 3624 和57-1）、C.p.B型菌（58-2）、C.p.C型菌（59-2和59-44）的培養(yǎng)液和E.coli（C83529、C83905、C83684、C83922、C14208）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（ATCC19115）、沙門菌（CMCC50115）、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的菌體培養(yǎng)物包被抗原，以McAb 1K19作為一抗，PBS為空白對照，CPB2單克隆抗體為陰性對照，對McAb 1K19進(jìn)行特異性檢測，通過臨界值判定其特異性。

1.11.2 靈敏度 將McAb 1K19 按1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096、1∶8 192、1∶16 384、1∶32 768 稀釋，采用建立的方法進(jìn)行檢測，以臨界值為判定依據(jù)，A450對應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)為該方法的靈敏度。

1.11.3 精密性 制備4 批重組蛋白CPB1，取同批重組蛋白CPB1，采用建立的方法對McAb 1K19 重復(fù)檢測4 次，計算變異系數(shù)（CV）；取4 批重組蛋白CPB1，采用建立的方法對McAb 1K19 進(jìn)行檢測，計算CV。

1.12 方法的應(yīng)用 采用建立的方法檢測201 份正常牛血清及陽性小鼠血清和陰性小鼠血清樣品，計算陽、陰性檢出符合率及總體符合率。

2 結(jié)果

2.1cpb1基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定cpb1基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約1 000 bp 的目的基因條帶，大小與預(yù)期相符，見圖1。

圖1 cpb1基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of cpb1 gene

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒pET32a-cpb1酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，EcoRⅠ單酶切產(chǎn)物可見約6 800 bp 的基因片段，NcoⅠ和EcoRⅠ雙酶切產(chǎn)物可見950和5 900 bp的基因片段，NcoⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ三酶切產(chǎn)物可見500（該條帶為cpb1基因在442 bp 處Hind 酶切位點(diǎn)斷裂后形成的混合物）和5 900 bp 的基因條帶，大小均與理論值相符，見圖2。測序結(jié)果表明，獲得的基因序列與GenBank 中登錄的cpb1基因序列（X83275.1）的同源性為100%。上述結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET32a-cpb1構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pET32a-cpb1的酶切鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pET32a-cpb1

2.3 重組蛋白的鑒定 誘導(dǎo)菌超聲破碎裂解沉淀和全菌體經(jīng)12% SDS-PAGE 分析，表達(dá)的蛋白相對分子質(zhì)量為54 000（CPB1 蛋白與硫氧化還原蛋白的融合蛋白）及34 000（CPB1 蛋白）條帶，大小與理論值相符，上清中表達(dá)較少，主要以包涵體形式表達(dá)。見圖3。

圖3 表達(dá)的重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression product of recombinant protein

2.4 McAb 1K19 的鑒定 McAb 1K19 純化產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE分析，可見相對分子質(zhì)量約50 000的重鏈蛋白條帶和25 000 的輕鏈條帶，見圖4。McAb 1K19 細(xì)胞株分泌的抗體重鏈為IgG2b 型，輕鏈為κ型。

圖4 McAb 1K19純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified product of McAb 1K19

2.5 方法的優(yōu)化

2.5.1 最佳抗原包被濃度及抗體稀釋度 當(dāng)重組蛋白CPB1 包被濃度為10 μg／mL，McAb 1K19 稀釋度為1∶16 384 時，P／N 最大，為18.938，見圖5。因此，確定CPB1 最佳包被濃度為10 μg／mL，McAb 1K19最佳稀釋度為1∶16 384。

圖5 抗原包被濃度（A）及抗體稀釋度（B）的優(yōu)化結(jié)果Fig.5 Optimization results of coating concentration of antigen（A）and antibody dilution（B）

2.5.2 最佳二抗稀釋度 HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 稀釋倍數(shù)為1∶1 000 時，P／N 最大，且A450接近1，見圖6。因此，確定HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 最佳稀釋倍數(shù)為1∶1 000。

圖6 二抗稀釋度的優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Optimization result of dilution of the secondary antibody

2.5.3 最佳封閉時間 5%脫脂奶粉封閉120 min時，A450和P／N 均最大，見圖7。因此確定最佳封閉時間為120 min。

圖7 封閉時間的優(yōu)化結(jié)果Fig.7 Optimization result of blocking time

2.6 臨界值的確定 21 份陰性對照的A450分別為0.073、0.076、0.064、0.071、0.083、0.063、0.088、0.066、0.059、0.077、0.091、0.072、0.155、0.109、0.064、0.135、0.068、0.119、0.066、0.134、0.072，x為0.086，SD為0.028。樣品A450≥0.17判為陽性，≤0.142判為為陰性。

2.7 方法的驗證

2.7.1 特異性 除C.p.B 型和C 型菌株外，其他菌株A450均＜0.142，見圖8。表明McAb 1K19與其他病原菌無交叉反應(yīng)。

圖8 McAb1K19與常見食源性病原菌的交叉免疫反應(yīng)Fig.8 Cross-immune reaction of McAb1K19 with common foodborne pathogenic bacteria

2.7.2 靈敏度 當(dāng)McAb 1K19 稀釋度為1∶32 768，即濃度為0.002 μg／μL時，A450為0.223 5，仍大于陽性臨界值，且P／N 為10.2，見圖9。表明建立的方法具有較高靈敏度。

圖9 靈敏度驗證結(jié)果Fig.9 Verification of sensitivity

2.7.3 精密性 用同批重組蛋白重復(fù)4次檢測McAb 1K19 的A450分別為1.100、1.186、1.093、1.172，x為1.138，SD為0.041，CV為3.654%。用4 批重組蛋白檢測McAb 1K19 的A450分別為1.115、1.259、1.063、1.220，x為1.164，SD為0.078，CV為6.759%。CV均＜10%，表明該方法具有良好的精密性。

2.8 方法的應(yīng)用 201份健康牛血清及2份陰性小鼠均為陰性，2份陽性小鼠血清均為陽性，陰性、陽性及總符合率均為100%，表明建立的方法可用于臨床樣品檢測。

3 討 論

B 和C 型C.p.是患病家畜中常見的致病菌株，除分泌CPB1 外，還可分泌產(chǎn)生CPA、CPB2 等其他毒素和酶類［12-13］。天然CPB1 的分離純化過程復(fù)雜繁瑣，得率較低、成本高，不適合作為檢測用抗原。目前，E.coli是最常用且最成熟的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。本課題組前期從B 型C.p.菌株NCTC8533 中擴(kuò)增獲得cpb1基因，測序并克隆至pBET7 載體上，在E.coliM109 中表達(dá)，獲得的目的蛋白相對分子質(zhì)量約34 000，可與天然CPB1 產(chǎn)生的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)［14］。另一項研究將CPB1 的編碼基因亞克隆至載體pAE 中，在E.coliBL21（DE3）中也成功表達(dá)了重組CPB1 蛋白［15］。本實(shí)驗通過低溫誘導(dǎo)方法獲得了CPB1 表達(dá)，主要以包涵體形式存在。本課題組前期構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pTIG-Trx-cpb1，獲得目的蛋白相對分子質(zhì)量約34 000，但E.coli菌體蛋白的相對分子質(zhì)量約35 000，兩者較接近，使SDS-PAGE 分析結(jié)果難以區(qū)分，因此本實(shí)驗將cpb1基因構(gòu)建至載體pET32a，獲得了相對分子質(zhì)量為54 000 的重組蛋白CPB1 與硫氧化還原蛋白的融合蛋白，可與E.coli菌體蛋白進(jìn)行有效區(qū)分。

ELISA法可特異性檢測腸道內(nèi)容物中的外毒素ε，是診斷C.p.感染的最佳方法之一［16］，如LAVANA等［17］以15 只美利奴羔羊為研究對象，在羔羊十二指腸內(nèi)接種D型C.p.上清培養(yǎng)物300 mL，發(fā)現(xiàn)外毒素ε在回腸、十二指腸和結(jié)腸的檢出率分別為92%、64%和57%，在7%的心包和房水液中也檢測到了外毒素ε，但在腹水和尿液中未檢測到該毒素；也有研究表明，在常規(guī)體液中檢測外毒素ε存在較大誤差，還應(yīng)基于臨床和病理數(shù)據(jù)診斷C.p.感染［18］。另外，KIRCANSKI等［19］通過重組CPB2 多克隆抗體建立了定量檢測新生仔豬腸道內(nèi)容物中CPB2 的抗原捕獲ELISA 法；MCCOURT 等［20］建立了用于檢測C.p.外毒素α 的夾心ELISA 方法。這兩種方法為動物壞死性腸炎的快速篩查診斷提供了一種較理想的檢測方法。

本研究通過制備重組CPB1，以其為包被抗原建立了CPB1抗體的間接ELISA檢測方法，并采用C.p.的McAb 1K19對建立的方法進(jìn)行優(yōu)化和驗證。優(yōu)化結(jié)果表明，重組蛋白CPB1最佳包被抗原濃度為10 μg／mL，一抗最佳稀釋度為1∶16 384，二抗最佳稀釋度為1∶1 000，最佳封閉時間為120 min。方法驗證結(jié)果顯示，除B 和C 型C.p.外，其他常見食源性致病菌A值均低于0.3，表明McAb 1K19 具有良好的特異性；批內(nèi)及批間CV均＜10%，表明建立的間接ELISA 法具有良好的精密性；方法的靈敏性較高。采用建立的間接ELISA 法對采自寧夏地區(qū)某養(yǎng)殖場的201 份健康牛血清、2 份C.p.陽性小鼠血清和小鼠陰性血清的檢測結(jié)果表明，201份牛血清樣品及小鼠陰性血清均呈陰性，陽性小鼠血清樣品呈陽性，陰性、陽性及總符合率均為100%。

綜上所述，本研究建立了一種用于CPB1抗體檢測的間接ELISA 法，且具有良好的精密性和較高的靈敏性，可用于大量臨床樣本的檢測。