王麗，林昕，魏茂瓊，陳興連，林濤，劉宏程

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，昆明 650205； 2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，昆明 650205)

三七為五加科人參屬多年生草本植物，主要產(chǎn)于云南省文山州等地，是預(yù)防和治療心腦血管等疾病的傳統(tǒng)中藥材之一，有散瘀止血、消腫定痛等功效[1-3]。在三七人工種植過(guò)程中，不可避免地會(huì)噴施農(nóng)藥來(lái)防治各種病蟲草害，可能存在農(nóng)藥使用過(guò)量或違規(guī)使用情況，從而導(dǎo)致藥材中藥物殘留明顯，影響用藥者人身安全[4]。因此建立殘留分析技術(shù)對(duì)三七等中藥材中農(nóng)藥殘留分析監(jiān)測(cè)，對(duì)保障人民身體健康及推進(jìn)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。氨基甲酸酯和有機(jī)磷類等殺蟲劑被廣泛用于中藥材種植中病蟲害防治。目前，對(duì)中藥材中氨基甲酸酯類農(nóng)藥分析有一些報(bào)道[5-6]，但主要針對(duì)農(nóng)藥母體的監(jiān)測(cè)，忽略了相關(guān)代謝物殘留的同時(shí)分析。研究發(fā)現(xiàn)部分農(nóng)藥代謝物毒性遠(yuǎn)高于農(nóng)藥母體[7]，農(nóng)藥及其代謝物的同時(shí)監(jiān)測(cè)，對(duì)食品安全更有意義。筆者選取幾種殺蟲劑類農(nóng)藥：克百威、涕滅威、氟蟲腈、水胺硫磷，對(duì)以上農(nóng)藥代謝物同時(shí)分析。以上農(nóng)藥在三七等中藥材種植中屬于禁用農(nóng)藥，但可能存在違規(guī)錯(cuò)誤使用情況，對(duì)三七中幾種禁用農(nóng)藥及其代謝物殘留同時(shí)分析對(duì)中藥材安全性具有重要意義。

中藥材中禁限用農(nóng)藥殘留分析有一些報(bào)道[8-9]，但三七中以上幾種禁用農(nóng)藥的研究報(bào)道不多。張舉成等[5-6]只測(cè)定了三七中幾種氨基甲酸酯中母體農(nóng)藥殘留，沒(méi)有代謝物分析，且采用的固相萃取前處理相對(duì)復(fù)雜、耗時(shí)。氟蟲腈及代謝物在三七中的分析鮮少報(bào)道。目前，分散固相萃取技術(shù)因其操作快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用在農(nóng)藥殘留分析中[10-12]。在貝母、山海棠有等中藥材的農(nóng)藥分析中有一定應(yīng)用[13-14]，在三七農(nóng)藥檢測(cè)中的應(yīng)用報(bào)道相對(duì)較少。與傳統(tǒng)色譜方法對(duì)比，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LCMS/MS)技術(shù)選擇性和靈敏度更好，針對(duì)中藥材等復(fù)雜樣本的抗基質(zhì)干擾能力更強(qiáng)[15]。筆者以中藥材三七為研究對(duì)象，對(duì)色譜、質(zhì)譜及分散固相萃取法提取凈化等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立針對(duì)三七中農(nóng)藥及代謝物殘留量的分散固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)快速檢測(cè)方法，為中藥材產(chǎn)品中藥物及代謝物殘留分析提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：5500 型，美國(guó)AB SCIEX 公司。

電子分析天平：JJ200 型，感量為10 mg，江蘇省常熟市雙杰測(cè)試儀器廠。

超聲波清洗儀：KQ-500DB 型，昆山市超聲儀器有限公司。

高速離心機(jī)：TGL-10B-6D 型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

超純水儀：MILLI-Q 型，美國(guó)密理博公司。

渦旋振蕩器：Vortex3 型，德國(guó)艾卡公司。

克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、水胺硫磷、氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫化物標(biāo)準(zhǔn)樣品：1 000 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

乙腈、甲醇：色譜純，德國(guó)默克公司。

氯化鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

乙酸銨、甲酸、乙酸：色譜純，美國(guó)Sigma 公司。

PSA(N-丙基乙二胺)、NH2(丙氨基鍵合硅膠)、C18(十八烷基鍵合硅膠)、弗羅里硅土、GCB(石墨化炭黑)凈化材料：粒徑為50～100 μm，天津艾杰爾公司。三七樣品：市售。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜儀

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美 國(guó)Waters 公 司)；流 動(dòng) 相：A 相 為甲醇，B 相為5 mmol/L 乙酸銨溶液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為0.05% 的 甲 酸)，流 量 為300 μL/min；梯度 洗 脫 程 序：0～5 min，5% A～95% A，5～8 min，95% A～95% A，8～8.1 min，95% A～5% A，8.1～10 min，5% A；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：1.0 μL。

1.2.2 質(zhì)譜儀

采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，ESI 源下正離子和負(fù)離子進(jìn)行同時(shí)掃描；電噴霧電壓：正源為5 500 V，負(fù)源為-4 500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣壓力：0.227 MPa；霧化氣壓力：0.345 MPa；輔助加熱氣壓力：0.379 MPa。每種農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 10 種農(nóng)藥的色譜、質(zhì)譜參數(shù)

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確吸取克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、水胺硫磷、氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫化物標(biāo)準(zhǔn)樣品各1.00 mL，用甲醇配制成質(zhì)量濃度均為10.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用移液管準(zhǔn)確移取一定體積上述各儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)液，混合并用甲醇稀釋定容，得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于低溫避光條件下保存。系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用甲醇和空白基質(zhì)配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品處理

稱取2 g(精確至0.01 g)三七粉末試樣放入50 mL 離心管中，之后加入10.0 mL 去離子水，渦旋震蕩1 min 后放置30 min，三七干粉試樣應(yīng)充分浸潤(rùn)，向離心管內(nèi)加入20.0 mL 乙腈作為提取溶劑，渦旋混合振蕩提取1 min，再加入6.0 g 氯化鈉，劇烈振蕩提取1 min，超聲輔助提取30 min，于8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心3 min，取上層清液1 mL 至內(nèi)含40 mg PSA、40 mg NH2、20 mg GCB 凈化離心管中，渦旋振蕩提取20 s，以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心3 min 后，取上層清液過(guò)0.22 μm 濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.3 定量方法

采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行各農(nóng)藥定量分析。在1.2 儀器工作條件下，將系列濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)樣品上機(jī)分析，計(jì)算農(nóng)藥含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化

各種農(nóng)藥的離子化效率以及色譜保留時(shí)間受流動(dòng)相體系的影響較大。分別采用甲醇和乙腈作為流動(dòng)相中的有機(jī)相，考察目標(biāo)農(nóng)藥色譜分離情況。結(jié)果表明，甲醇作為流動(dòng)相時(shí)10 種農(nóng)藥分離效果更好，所以選擇甲醇作為有機(jī)相。由于各農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)性質(zhì)不同，克百威、涕滅威及代謝物等容易在ESI 源正離子電離模式下形成[M+H]+[M+Na]+物質(zhì)離子峰，在流動(dòng)相中加入適當(dāng)濃度的酸性物質(zhì)可以促進(jìn)目標(biāo)物的正離子化效率。但在氟蟲腈及代謝物的結(jié)構(gòu)中，存在數(shù)目較多的強(qiáng)吸電子基團(tuán)(F、Cl、CN)，使得分子中的氫質(zhì)子極易失去，易形成負(fù)離子，加入乙酸銨等緩沖鹽能夠改善待測(cè)組分峰形，在一定程度上能提高目標(biāo)物的響應(yīng)靈敏度[16]。綜合考慮不同農(nóng)藥的化學(xué)性質(zhì)，最終選擇甲醇、5 mmol/L 乙酸銨溶液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的甲酸)為流動(dòng)相體系，10 種目標(biāo)化合物響應(yīng)值和色譜峰形等綜合達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選擇在ESI 源的正離子和負(fù)離子模式下同時(shí)掃描方式。采用針泵直接進(jìn)樣方式對(duì)10 種目標(biāo)農(nóng)藥(0.1 μg/mL)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，獲得穩(wěn)定的母離子準(zhǔn)離子峰，然后對(duì)其進(jìn)行二級(jí)碎片掃描，獲得目標(biāo)農(nóng)藥的二級(jí)子離子質(zhì)譜信息。篩選2～3 個(gè)信號(hào)較強(qiáng)的二級(jí)碎片離子作為子離子，并在MRM 模式下分別優(yōu)化去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)、毛細(xì)管電壓及離子源溫度等質(zhì)譜參數(shù)。定量和定性離子最終選取響應(yīng)強(qiáng)度高并且基質(zhì)干擾小的兩對(duì)離子。確定的最優(yōu)質(zhì)譜條件參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑

農(nóng)藥殘留分析多選擇甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑作為提取試劑。筆者采用加標(biāo)回收法對(duì)提取試劑選擇優(yōu)化，以甲醇作為提取劑時(shí)共提取的干擾雜質(zhì)較多，影響后期凈化處理，同時(shí)甲醇與加入的水互溶，不利于分析。乙腈滲透能力強(qiáng)，作為提取試劑總體回收率較好，提取效果好，所以選用乙腈作為提取試劑。

2.2.2 提取溶劑體積

向三七樣品中添加20 μg/kg 濃度水平的10 種農(nóng)藥，分別加入10、15、20、25 mL 乙腈溶劑，考察目標(biāo)農(nóng)藥的提取效果。結(jié)果顯示，加入20 mL 乙腈時(shí)各農(nóng)藥提取效果相對(duì)較好，繼續(xù)增加體積，提取效果沒(méi)有明顯提升。所以最終確定提取溶劑乙腈的加入體積為20 mL。

2.2.3 凈化條件

首先將未凈化的提取上清溶液直接過(guò)膜進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示各目標(biāo)農(nóng)藥的回收率均大于120%，可能由于三七提取液內(nèi)含成分復(fù)雜，產(chǎn)生一定的基質(zhì)效應(yīng)，且不凈化直接進(jìn)樣易造成離子源污染。因此需選擇合適高效快捷的凈化方法對(duì)樣品提取液凈化，以降低三七中有機(jī)質(zhì)等對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥分析的影響。

選擇高效的分散固相萃取法作為樣品凈化方法，對(duì)C18、PSA、NH2、弗羅里硅土、GCB 5 種凈化材料的種類和用量加以選擇優(yōu)化。在1 mL 的上清提取液中分別加入上述凈化材料100 mg(GCB 20 mg)，結(jié)果顯示，10 種目標(biāo)農(nóng)藥提取率在83%～115%之間，說(shuō)明5 種凈化材料均能滿足凈化要求，但用PSA、NH2、GCB 凈化后的提取液顏色較淺，凈化效果相對(duì)更好。由于不同凈化材料對(duì)干擾物吸附性能不同，最終選擇PSA、NH2、GCB 的混合材料作為本實(shí)驗(yàn)的凈化材料，并對(duì)各凈化材料的用量比例(PSA、NH2和GCB的質(zhì)量比分別為1∶3∶1、2∶2∶1、3∶1∶1)和總用量(50、100、150、200 mg)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，對(duì)于克百威、涕滅威及代謝物當(dāng)用量比例為1∶3∶1、2∶2∶1 時(shí)凈化效果較好，當(dāng)用量比例為2∶2∶1、3∶1∶1 時(shí)氟蟲腈及代謝物凈化效果相對(duì)更好，但對(duì)于水胺硫磷用量比例為2∶2∶1 時(shí)凈化效果最好。綜合考慮，最終確定選擇PSA、NH2和GCB的質(zhì)量比2∶2∶1。對(duì)凈化材料總用量進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)用量大于100 mg 時(shí)，凈化效果沒(méi)有明顯增強(qiáng)，因此，最終選擇總用量為100 mg。

此外，試驗(yàn)結(jié)果表明，用傳統(tǒng)的固相萃取方式(HLB 固相萃取柱)對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化，回收率為88.3%～113.1%，方法同樣滿足要求，但相比之下，分散固相萃取法更加簡(jiǎn)便快速、成本低，更適用于大批量樣品的殘留分析檢測(cè)。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)現(xiàn)象(ME)是樣品提取過(guò)程中共提取的雜質(zhì)干擾物會(huì)對(duì)目標(biāo)分析物的儀器響應(yīng)產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為對(duì)分析物響應(yīng)增強(qiáng)或抑制。分別配制相同質(zhì)量濃度各農(nóng)藥的溶劑和基質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以色譜峰面積和質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，基質(zhì)效應(yīng)(ME)的強(qiáng)弱通過(guò)對(duì)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比較計(jì)算值進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)|ME|＜20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)20%≤|ME|＜50%時(shí)為中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)|ME|≥50%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[15]。結(jié)果表明(見(jiàn)表2 )，僅有克百威、涕滅威、水胺硫磷表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應(yīng)，其余農(nóng)藥均表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)。為減小基質(zhì)效應(yīng)的影響，筆者采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行各農(nóng)藥定量分析。

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量限

配制10 種農(nóng)藥的系列混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.2 儀器工作條件下，以各農(nóng)藥的色譜峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

以3 倍信噪比添加濃度作為方法檢出限(LOD)，以10 倍信噪比的添加濃度作為方法定量限(LOQ)。

10 種農(nóng)藥的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限見(jiàn)表2。由表2 可知，10 種農(nóng)藥在0.001～0.2 μg/mL 線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.998，表明線性關(guān)系良好，方法檢出限為0.3～2.8 μg/kg，該方法中10 種農(nóng)藥的檢出限較低，能夠滿足農(nóng)藥殘留的分析要求。

表2 10 種農(nóng)藥的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及基質(zhì)效應(yīng)

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

采用三七空白基質(zhì)，分別以約1 倍、5 倍、10 倍各農(nóng)藥的定量限進(jìn)行低、中、高三個(gè)濃度水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加濃度水平做6 個(gè)平行試驗(yàn)，用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，結(jié)果見(jiàn)表3?？瞻讟悠贰⒓訕?biāo)樣品色譜圖如圖1、圖2 所示。由表3 可知，10 種農(nóng)藥的平均回收率為90.4%～110.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7.9%，表明建立的方法回收率和重現(xiàn)性較好，符合農(nóng)藥殘留測(cè)定的要求，適用于三七中10 種農(nóng)藥及相關(guān)代謝物殘留的同時(shí)測(cè)定。

圖1 空白三七樣品色譜圖

圖2 空白三七樣品加標(biāo)色譜圖

表3 10 種農(nóng)藥的加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6) %

續(xù)表3

3 結(jié)語(yǔ)

建立了一種采用分散固相萃取凈化方式的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定三七中農(nóng)藥及代謝物殘留的方法。樣品經(jīng)乙腈提取，提取溶液通過(guò)PSA、NH2和GCB 混合材料凈化，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，能快速實(shí)現(xiàn)三七中農(nóng)藥及代謝物的含量分析。該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足復(fù)雜基質(zhì)中痕量農(nóng)藥分析要求，且簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定，可用于批量三七樣品中農(nóng)藥及代謝物殘留的快速分析測(cè)定。本研究可為中藥材產(chǎn)品中農(nóng)藥及代謝物殘留分析提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。