黃燕倩 莫怡飛 向健 張曉麗 盧玉沛 楊立峰 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗所 （廣東 廣州 510080）

內(nèi)容提要： 目的：比較不同浸提比例下銀離子泡沫敷料亞慢性全身毒性試驗結(jié)果的差異。方法：對兩組SD大鼠分別給予不同濃度的銀離子泡沫敷料浸提液，綜合比較臨床觀察、體重變化、血液學(xué)、血液生化、大體尸檢和組織病理學(xué)檢查結(jié)果，觀察兩組動物的亞慢性全身毒性反應(yīng)。結(jié)果：浸提比例為0.4g/mL的銀離子泡沫敷料浸提液，會導(dǎo)致大鼠體重增長緩慢。結(jié)論：提高銀離子泡沫敷料的浸提比例，可以觀測到大鼠全身毒性反應(yīng)。

研究表明，銀離子具有良好的廣譜抗菌性，可以有效殺滅細(xì)菌、真菌和霉菌，且較少產(chǎn)生抗菌性[1]。利用這一原理，銀離子在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域等到廣泛的應(yīng)用，例如在牙科材料、傷口修復(fù)和婦科疾病治療中都發(fā)揮著重要作用，而且也常用于導(dǎo)管、支架、硅橡膠等醫(yī)療器械[2]。尤其在創(chuàng)傷抗菌敷料上，對外科、多種疾病引起的皮膚潰瘍等創(chuàng)面治療具有突出效果[3]。然而，銀離子作為一種金屬離子，其抑菌殺菌作用無選擇性，在一定濃度下，對生物體正常的細(xì)胞也會造成的損傷，對人體依然具有一定的毒性作用[4]。鑒于銀離子優(yōu)秀的抗菌特性，銀離子抗菌材料已然成為當(dāng)今醫(yī)療器械研究的熱點(diǎn)。如何安全合理地應(yīng)用銀離子，探索其在生物體上引發(fā)生物毒性的閾值是值得關(guān)注的。本文對銀離子敷料兩種給藥濃度實驗結(jié)果進(jìn)行比較，以期對銀離子敷料這一類醫(yī)療器械的全身毒性研究提供一定的參考。

1.材料與方法

1.1 一般材料

本實驗起止時間：2021年3月～2021年11月。

供試品液制備：取銀離子泡沫敷料，除吸水容量外分別按0.1g/mL和0.4g/mL的比例加入生理鹽水，37?C下放置72h，取浸提液作為供試品。浸提比例為0.1g/mL的浸提液設(shè)為A液，浸提比例為0.4g/mL的設(shè)為B液。生理鹽水作為對照液。

實驗動物：檢疫合格的SPF級SD大鼠80只，雌雄各半，雌性未產(chǎn)并無孕。動物來源：廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.2 方法

設(shè)置A、B兩組實驗，每組各40只動物，雌雄各半，雌性未產(chǎn)并無孕。隨機(jī)分配為對照組和觀察組。A、B兩組觀察組動物按10mL/kg的比例分別皮下注射給予浸提比例為0.1g/mL和0.4g/mL的浸提液。對照組動物均按照10mL/kg的比例皮下注射給予生理鹽水。連續(xù)注射90d后，分別比較觀察組A與對照組A、觀察組B與對照組B動物的各項指標(biāo)，比較給予不同濃度浸提液大鼠的全身毒性反應(yīng)。實驗設(shè)計如表1所示。

表1.實驗設(shè)計

實驗期間每天觀察并記錄動物的一般狀態(tài)和毒性表現(xiàn)。于實驗開始時、實驗開始后每周及安樂死前記錄動物體重。實驗終期經(jīng)腹主動脈采血后進(jìn)行血液常規(guī)和血生化檢測。采血后對動物進(jìn)行大體剖檢，及時稱量記錄各主要臟器的濕重，并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.3 觀察指標(biāo)

比較臨床觀察、體重變化、血液學(xué)、血液生化、大體尸檢和組織病理學(xué)檢查結(jié)果，觀察兩組動物的亞慢性全身毒性反應(yīng)。分析浸提液濃度與受試動物異常指標(biāo)產(chǎn)生的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 臨床觀察

實驗期間，各組大鼠外觀、一般狀態(tài)和行為活動未見明顯異常。

2.2 動物體重

在B組實驗中，觀察組動物在實驗中后期體重增長速度明顯較對照組緩慢，且經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析觀察組動物體重與對照組相比存在統(tǒng)計學(xué)差異。與對照組相比較，觀察組雌性動物體重在實驗第49天和第56天有顯著差異（P<0.05），第63天起至實驗結(jié)束，有極顯著差異（P<0.01）；觀察組雄性動物體重在第21天、第28天和第35天有顯著差異（P<0.05），第42天起至實驗結(jié)束，有極顯著差異（P<0.01）。在A組實驗中，觀察組與對照組相比較，雌性動物體重未見統(tǒng)計學(xué)差異，雄性動物在實驗第84天有顯著差異（P<0.05），在第90天有極顯著差異（P<0.01）。各組實驗動物體重變化見圖1。

圖1.各實驗組動物體重變化趨勢

2.3 血液學(xué)數(shù)據(jù)分析

A組實驗中，與對照組同性別動物相比較，觀察組雌性動物血小板（Platelet，PLT）升高，雌雄性動物白細(xì)胞（WhiteBlood Cell，WBC）均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在B組實驗中，與對照組同性別動物相比較，觀察組雄性動物紅細(xì)胞（Red Blood Cell，RBC）降低。A、B兩組實驗中其他血液學(xué)指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)意義的差異（P>0.05）。以上統(tǒng)計學(xué)差異主要由個別數(shù)值偏差加大引起，臨床觀察未見動物異常反應(yīng)，故認(rèn)為差異無毒理學(xué)意義。見表2。

表2.血液數(shù)據(jù)(n=10,±s)

表2.血液數(shù)據(jù)(n=10,±s)

注1：凝血酶原時間（Prothrombin Time，PT），平均紅細(xì)胞體積（Mean Corpuscular Volume，MCV），紅細(xì)胞壓積（Hematocrit，HCT），血紅蛋白（hemoglobin，HGB）注2：與同一時期對照組同性別動物相比，aP<0.05，表示統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異，bP<0.01，表示有極顯著差異；無標(biāo)記即為P>0.05，表示無統(tǒng)計學(xué)差異

指標(biāo) 雌性 雄性 雌性 雄性對照組A 觀察組A 對照組A 觀察組A 對照組B 觀察組B 對照組B 觀察組B PT(S) 8.2±0.4 8.3±0.5 11.4±4.1 9.7±1.4 8.44±0.33 8.14±0.42 9.34±0.56 9.06±0.43 RBC(×1012/L) 8.73±0.50 9.18±0.58 10.08±0.42 10.03±0.58 8.00±2.84 8.81±0.46 10.27±0.37 9.80±0.33b MCV(fL) 51.1±1.2 51.2±2.0 47.1±1.6 48.1±1.6 53.5±4.7 51.5±2.6 47.4±1.2 47.6±1.9 HCT(%) 44.6±2.1 46.9±2.6 47.5±2.2 48.3±3.6 46.3±2.5 45.2±1.4 47.4±2.1 46.6±1.5 HGB(g/L) 159±8 166±9 172±8 174±13 165±10 162±5 172±11 165±6 PLT(×109/L) 1,172±170 1,375±158a 1,285±132 1,293±381 1,157±165 1,254±95 1,279±140 1,389±189 WBC(×109/L) 9.08±3.23 6.19±1.39a 13.83±2.17 8.62±2.04b 9.00±2.50 10.35±2.87 13.71±4.30 15.04±3.93

2.4 臨床生化分析

在A組實驗中，與對照組動物同性別動物相比較，觀察組雌雄性動物白蛋白（Albumin，ALB）、總蛋白（Total Protein，TP）均降低，雌性動物血糖（Blood Glucose，GLU）、血尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）升高，雄性動物堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Alanine Aminotransferase，ALT）、甘油三酯（Triglyceride，TG）降低，肌酐（Creatinine，Cre）和BUN升高。在B組實驗中，與對照組動物同性別動物相比較，觀察組雌性動物Glu升高，雄性動物TP升高。A、B兩組實驗中其他臨床生化指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)意義的差異（P>0.05）。見表3。

表3.臨床生化數(shù)據(jù)(n=10,±s)

表3.臨床生化數(shù)據(jù)(n=10,±s)

注1：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST），總膽固醇（Total Cholesterol，TCHO），總膽紅素（Total Bilirubin，TBil）注2：與同一時期對照組同性別動物相比，aP<0.05，表示統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異，bP<0.01，表示有極顯著差異；無標(biāo)記即為P>0.05，表示無統(tǒng)計學(xué)差異

指標(biāo) 雌性 雄性 雌性 雄性對照組A 觀察組A 對照組A 觀察組A 對照組B 觀察組B 對照組B 觀察組B 35±3 32±2a 29±1 27±1b 37.0±1.4 35.4±2.1 31.1±0.7 31.4±1.3 36±6 44±12 77±15 63±12a 43.7±14.7 51.7±15.6 85.2±14.7 84.0±7.5 32±15 35±11 33±5 27±5a 51.7±9.3 59.0±39.8 69.7±17.9 65.2±8.9 130±45 148±57 123±25 129±21 153±28 130±28 210±58 206±44 2.10±0.48 2.17±0.28 1.52±0.29 1.54±0.20 2.28±0.38 2.20±0.42 1.48±0.25 1.55±0.23 42±6 52±20 36±6 55±10b 61.2±10.6 70.4±13.8 61.7±4.9 58.9±5.5 8.67±0.73 10.67±1.95a 9.16±1.00 10.64±3.01 7.38±0.89 8.37±0.85a 8.84±1.56 9.08±1.71 2.07±0.25 2.02±0.24 1.99±0.32 2.24±0.36 0.35±0.15 0.29±0.10 0.23±0.08 0.27±0.09 58±5 51±3b 51±3 45±2b 56.1±2.8 53.4±3.1 47.9±1.8 50.8±3.2a 0.69±0.28 0.79±0.25 1.10±0.30 0.77±0.23a 0.72±0.43 0.67±0.20 0.81±0.12 0.71±0.15 7.59±0.96 9.48±0.92b 6.44±0.87 7.70±1.56a 8.86±1.23 10.58±2.36 8.63±1.63 8.88±1.20 ALB(g/L) ALP(U/L) ALT(U/L) AST(U/L) TCHO(mmol/L)Cre(μmol/L) Glu(mmol/L) TBil(μmol/L) TP(g/L) TG(mmol/L) BUN(mmol/L)

2.5 大體剖檢及臟器重量和系數(shù)

大體剖檢中，實驗的所有大鼠均未見明顯損傷或病變。解剖時及時記錄臟器濕重。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，A組實驗中，觀察組雌性動物心臟重量及系數(shù)較對照組雌性動物減?。挥^察組雄性動物肝臟重量及系數(shù)、腦系數(shù)較對照組雄性動物減小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。B組實驗中，觀察組雌性動物心臟、肝臟臟器重量較對照組減小，腦系數(shù)增大；觀察組雄性動物心臟、脾臟、腎、腎上腺和腦系數(shù)增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。A、B兩組實驗中其他臟器重量、臟器系數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義的差異（P>0.05）。見表4、表5。

表4.各組大鼠臟器重量統(tǒng)計數(shù)據(jù)(n=10,±s,g)

表4.各組大鼠臟器重量統(tǒng)計數(shù)據(jù)(n=10,±s,g)

注：與同一時期對照組同性別動物相比，aP<0.05，表示統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異，bP<0.01，表示有極顯著差異；無標(biāo)記即為P>0.05，表示無統(tǒng)計學(xué)差異

臟器 雌性 雄性 雌性 雄性對照組A 觀察組A 對照組A 觀察組A 對照組B 觀察組B 對照組B 觀察組B心 1.065±0.150 0.917±0.071a 1.831±0.090 1.746±0.120 1.011±0.070 0.926±0.081a 1.606±0.116 1.541±0.153肝 8.199±1.247 7.700±0.486 14.532±1.138 12.357±0.961b 8.150±0.874 7.294±0.247a 13.566±0.908 12.394±1.517脾0.533±0.060 0.486±0.044 0.889±0.079 0.868±0.134 0.539±0.061 0.537±0.102 0.888±0.079 0.911±0.130腎1.765±0.219 1.720±0.139 3.058±0.233 3.161±0.190 1.817±0.214 1.768±0.101 3.077±0.210 3.083±0.304腎上腺 0.060±0.010 0.059±0.008 0.060±0.008 0.059±0.010 0.062±0.008 0.053±0.011 0.061±0.008 0.063±0.010胸腺 0.447±0.050 0.404±0.081 0.520±0.158 0.474±0.143 0.416±0.093 0.392±0.087 0.535±0.116 0.448±0.133腦1.934±0.080 1.948±0.085 2.119±0.099 2.132±0.060 2.003±0.147 1.982±0.096 2.205±0.128 2.157±0.082子宮 0.773±0.173 0.771±0.178 3.901±0.308 3.838±0.277 0.692±0.142 0.849±0.640 3.680±0.386 3.642±0.392卵巢 0.142±0.034 0.147±0.025 1.446±0.134 1.452±0.138 0.129±0.034 0.114±0.014 1.417±0.151 1.340±0.132

表5.各組大鼠臟器系數(shù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)(n=10,±s,%)

表5.各組大鼠臟器系數(shù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)(n=10,±s,%)

注：與同一時期對照組同性別動物相比，aP<0.05，表示統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異，bP<0.01，表示有極顯著差異；無標(biāo)記即為P>0.05，表示無統(tǒng)計學(xué)差異

臟器 雌性 雄性 雌性 雄性對照組A 觀察組A 對照組A 觀察組A 對照組B 觀察組B 對照組B 觀察組B心0.350±0.040 0.302±0.024b 0.307±0.016 0.308±0.016 0.305±0.020 0.307±0.025 0.255±0.014 0.274±0.019a肝2.697±0.332 2.541±0.280 2.432±0.124 2.176±0.112b 2.463±0.268 2.417±0.087 2.157±0.122 2.204±0.188脾 0.175±0.014 0.161±0.023 0.149±0.015 0.153±0.020 0.162±0.014 0.177±0.029 0.141±0.012 0.162±0.015b腎 0.580±0.050 0.566±0.047 0.513±0.045 0.557±0.031a 0.549±0.058 0.586±0.027 0.490±0.038 0.551±0.064a腎上腺 0.020±0.003 0.020±0.003 0.010±0.001 0.010±0.001 0.019±0.002 0.017±0.004 0.010±0.001 0.011±0.001a胸腺 0.148±0.023 0.133±0.029 0.087±0.026 0.083±0.024 0.126±0.029 0.130±0.025 0.085±0.018 0.071±0.029腦 0.639±0.036 0.643±0.063 0.355±0.018 0.376±0.023a 0.606±0.052 0.657±0.043a 0.351±0.028 0.387±0.041a子宮 0.254±0.048 0.255±0.066 0.655±0.065 0.678±0.062 0.210±0.046 0.280±0.206 0.586±0.067 0.652±0.092卵巢 0.047±0.013 0.048±0.007 0.242±0.023 0.256±0.028 0.039±0.010 0.038±0.005 0.226±0.030 0.241±0.036

2.6 組織病理

對所有大鼠的主要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，主要見脾臟含鐵血黃素沉積，偶見肝內(nèi)肉芽腫，在對照組與觀察組大鼠均可見，認(rèn)為與實驗樣品無關(guān)。見圖2、圖3。

圖2.肝臟，肉芽腫

圖3.脾臟，含鐵血黃素沉積

3.討論

本次實驗采用同樣的染毒方式與染毒周期，比較不同濃度下銀離子泡沫敷料亞慢性全身毒性試驗差異。研究結(jié)果表明，當(dāng)浸提比例為0.4g/mL時，從實驗中期開始直至實驗結(jié)束，觀察組大鼠體重增長速度均小于對照組同性別大鼠，同一時期對照組大鼠體重明顯大于觀察組同性別大鼠，差異顯著，并且隨著時間推移，差異呈逐漸增大趨勢。這種現(xiàn)象在雌雄性大鼠中均出現(xiàn)。觀察組動物心臟、肝臟重量較對照組小，但僅雌性動物間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。血液學(xué)和臨床生化指標(biāo)與對照組相比較未發(fā)現(xiàn)明顯的異常。綜上，認(rèn)為在0.4g/mL的浸提比例下，銀離子敷料明顯影響觀察組大鼠體重增長。當(dāng)浸提比例為0.1g/mL時，觀察組雌性動物體重與對照組同性別動物比較，未見有統(tǒng)計學(xué)意義的差異。僅觀察組雄性動物在實驗第84天和第90天時與對照組雄性動物相比體重較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，觀察組動物心臟、肝臟重量較對照組小，但僅雄性動物間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。血液學(xué)和臨床生化指標(biāo)與對照組相比較未發(fā)現(xiàn)明顯的異常。綜合分析，在0.1g/mL的浸提比例下，銀離子敷料未引起明顯的亞慢性全身毒性，或在該實驗的實驗終點(diǎn)前，銀離子引起的全身毒性不明顯。

研究表明，銀離子濃度在10ppm時殺菌作用較強(qiáng)，且對體外細(xì)胞存活率無任何影響，在濃度為12.5～25ppm時，銀離子的細(xì)胞毒性增加非常明顯[4]。銀離子抗菌敷料在發(fā)揮殺菌特性的同時，也會產(chǎn)生一些不良反應(yīng)。銀的不良反應(yīng)包括致敏、皮膚染色、含銀敷料干擾醫(yī)療成像以及銀中毒。本研究通過對銀離子敷料的不同浸提比例浸提液進(jìn)行亞慢性全身毒性研究，通過比較發(fā)現(xiàn)，低濃度的浸提液未引起動物明顯的異常反應(yīng)，或僅在實驗接近終點(diǎn)時，對雄性動物體重增長有一定的影響。高濃度的浸提液能夠更快表現(xiàn)出對動物體重增長產(chǎn)生抑制作用，具有一定的毒性，符合銀離子濃度增加，細(xì)胞毒性增強(qiáng)的特點(diǎn)。然而，高濃度的浸提液遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過實際臨床使用劑量，盡管能夠表明銀離子在一定濃度下對人體會造成危害，但生物學(xué)評價的目的并非證明一種物質(zhì)或器械在極大的、超乎實際的接觸劑量下的危害作用，而是為臨床安全使用器械提供依據(jù)和保障[5]。合理的使用器械，把使用器械帶來的不良影響降到可接受范圍內(nèi)，發(fā)揮器械臨床使用最大效益才是醫(yī)療器械生物學(xué)安全性評價的最終目的。因此，對醫(yī)療器械做生物安全性評價實驗時，要把握好實驗樣品的浸提比例和浸提時間，在合理的實驗條件范圍內(nèi)對器械做安全評估，對產(chǎn)品臨床長期使用可能帶來的不良反應(yīng)做出預(yù)測，規(guī)避風(fēng)險，使高效有用的器械被采用，在安全合理的使用條件下更好地服務(wù)患者。

在本次研究中，僅在動物體重變化這一觀察指標(biāo)體現(xiàn)出明顯差異，其他臨床檢測指標(biāo)和組織病理學(xué)并未見明顯異常。有研究表明，在完整的皮膚表面使用銀離子敷料，在汗水和皮脂的作用下，銀離子會滲透皮膚進(jìn)入體內(nèi)，最終經(jīng)肝腎代謝，也可經(jīng)毛發(fā)和指甲生長代謝。在大鼠的開放性創(chuàng)面模型Ag標(biāo)記的硝酸銀溶液應(yīng)用治療研究中發(fā)現(xiàn)肝臟存在顯著的銀同位素吸收，而腎臟中存在較低水平[6]。在關(guān)于銀離子的全身毒性試驗中，可以增加動物攝食量和飲水量的檢測，以及動物血液、尿液中銀離子濃度的含量檢測[7,8]。條件允許時，可以采用同位素標(biāo)記的方法，了解銀離子在動物身體中的全身吸收情況，為全身毒性研究提供更全面直接的依據(jù)。