廖韋衛(wèi)，韋海球，羅晟昇 ，馬文清，何洪良，江清梅，謝君鋒,2*

(1廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西龍州 532400；2廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530004)

0 引言

甘蔗是單子葉禾本科甘蔗屬植物(Saccharum officinarum)植物[1]。甘蔗組織培養(yǎng)再生植株多采用新葉愈傷組織誘導(dǎo)或者莖尖頂端分生組織誘導(dǎo)的方法進(jìn)行。甘蔗作為第一個(gè)組織培養(yǎng)成功的禾本科植物[2]經(jīng)過多年研究，甘蔗組織培養(yǎng)已經(jīng)發(fā)展成為一類比較成熟的應(yīng)用生物技術(shù)。目前，植物組織培養(yǎng)技術(shù)在植物種苗快速繁殖、培育無病毒苗、種質(zhì)資源保存、基因育種等方面得到了較為普遍的應(yīng)用[3-6]。截至2022年5月，以“甘蔗”、“組織培養(yǎng)”為關(guān)鍵詞查詢可獲相關(guān)文獻(xiàn)共計(jì)70篇，但是成文時(shí)間較早，內(nèi)容普遍涉及脫毒健康種苗繁育等實(shí)用技術(shù)，內(nèi)容大多以誘導(dǎo)新葉愈傷組織、分化、增殖為主，而采用的組織培養(yǎng)部位多為新葉、莖尖。EVANS P S使用新葉誘導(dǎo)分化的方法第一次獲取了甘蔗組培苗[7]。唐紅琴等于 2011年報(bào)道了甘蔗莖尖脫毒健康種苗的研究進(jìn)展，提到使用莖尖進(jìn)行甘蔗組織培養(yǎng)的模式[8]。目前，植物組織培養(yǎng)技術(shù)在植物種苗快速繁殖、培育無病毒苗、種質(zhì)資源保存、基因育種等方面得到了較為普遍的應(yīng)用。近年來，廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生物技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，新葉愈傷組織的誘導(dǎo)存在著易變異、易褐化、苗細(xì)弱、后期分化能力不足的問題；莖尖頂端分生組織誘導(dǎo)也是存在著外植體要求高、接種操作較困難、技術(shù)門檻較高、培養(yǎng)基配比苛刻、褐化嚴(yán)重等諸多問題，而居間分生組織誘導(dǎo)剛好避免了上述的現(xiàn)實(shí)問題。在單子葉植物中，居間生長(zhǎng)是單子葉植物生長(zhǎng)的一個(gè)極其重要的因素[7]，有關(guān)單子葉植物居間分生組織的研究，以稻、麥、玉米、高粱、甘蔗等植物的研究較多。居間分生組織是伸長(zhǎng)節(jié)間的局部分生組織區(qū)域，是插入在或多或少已分化的組織區(qū)的分生組織[9]。所以，根據(jù)植物細(xì)胞的全能性理論，居間分生組織同樣具有與頂端分生組織一樣的分化能力，相較莖尖分生組織分別較少，且難以獲取的特點(diǎn)，居間分生組織具有在同一植物內(nèi)分布廣，獲取難度低的特點(diǎn)。因此，居間分生組織的誘導(dǎo)相較莖尖頂端分生組織誘導(dǎo)技術(shù)具有技術(shù)門檻下降的優(yōu)勢(shì)，是具有較好應(yīng)用前景的一種甘蔗組織培養(yǎng)技術(shù)。如何打破休眠，誘導(dǎo)生長(zhǎng)，成為居間分生組織進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，而解決問題根本辦法在于培養(yǎng)基及激素的選擇。因此本文針對(duì)桂南亞08-186居間分生組織較厚易采的特點(diǎn)，采用了不同外緣激素疊加的試驗(yàn)方式，以期得到打破桂南亞08-186居間分生組織的休眠，誘導(dǎo)生長(zhǎng)的方法，并給其他品種甘蔗居間分生組織植物組織培養(yǎng)誘導(dǎo)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘蔗品種為桂南亞08-186，采自廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所甘蔗資源圃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇

試驗(yàn)使用了常用的MS基本培養(yǎng)基(30 g/L蔗糖；pH 6.0)作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。經(jīng)過對(duì)比文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，甘蔗組織培養(yǎng)多采用MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如常用的莖尖誘導(dǎo)、新葉愈傷組織誘導(dǎo)等[10-11]。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)培養(yǎng)基為 MS基本培養(yǎng)基+0.1 mg/L 6-BA+NAA(吲哚乙酸)+GA3(赤霉素)，進(jìn)行二因素多水平試驗(yàn)，具體處理見表1，其中NAA(設(shè)為A)，水平分別為 0、0.1、0.5、0.75 mg/L；GA3(設(shè)為 B)，水平分別為0、0.01、0.05 mg/L，對(duì)照CK為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖[8]。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20瓶，每瓶放置外植體1個(gè)，培養(yǎng)15天后分別統(tǒng)計(jì)出芽數(shù)及出芽瓶數(shù)。此外，淺層培養(yǎng)進(jìn)行甘蔗組織培養(yǎng)較常用的20 mL液體或固體培養(yǎng)基等模式效果要好[11]，所以本次試驗(yàn)采用淺層培養(yǎng)方法。

1.2.3 居間分生組織獲取及生長(zhǎng)條件

取甘蔗莖頂部約 60 cm，帶回實(shí)驗(yàn)室后于超凈工作臺(tái)上先用75%酒精擦拭表面，剝?nèi)ト~梢，使用0.1% HgCl2處理7 min，使用無菌水沖洗5次。將已經(jīng)消毒后并取剝除莖尖、削除外層組織后剩余的居間分生組織塊，接入不同處理的培養(yǎng)基中，并放于培養(yǎng)間恒溫26℃，光照1500 lx，持續(xù)12 h[12]，控制污染率低于5%[13]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)二因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行方差分析檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果[12]。F測(cè)驗(yàn)使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 出芽誘導(dǎo)結(jié)果

在培養(yǎng)至15天后，觀察發(fā)現(xiàn)：除了A1B1外其余均有腋芽冒出(見表2、表3)，由表2可知，A2B2、A2B3處理組芽數(shù)較多，經(jīng)方差分析驗(yàn)證差異性。

表2 出芽數(shù)統(tǒng)計(jì)兩向表

表3 出芽瓶數(shù)統(tǒng)計(jì)兩向表

通過 SPSS分析可得表4，處理間顯著性P為0.000＜0.001，差異極顯著，說明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同理，通過對(duì)表3進(jìn)行SPSS方差分析可得表5，處理間顯著性P為 0.000＜0.001，差異極顯著，說明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 各處理出芽數(shù)方差分析表

表5 出芽瓶數(shù)方差分析表

2.1.1 出芽數(shù)分析

使用SPSS 22.0對(duì)各處理出芽數(shù)進(jìn)行差異性分析(圖1、圖2)，可以得出 A1B1、A1B2相差不大，意味著2個(gè)處理對(duì)居間分生組織誘導(dǎo)效果相同，對(duì)比統(tǒng)計(jì)表，可以判斷A1B1、A1B2對(duì)居間分生組織的試驗(yàn)效果亦不佳。同理，CK、A1B3、A4B3、A2B1、A3B1、A3B2、A4B2、A3B3以及A4B1都處于顏色深度較近的區(qū)域內(nèi)，因此處理效果可以理解為相似。而A2B3、A2B2在各個(gè)處理中，顏色與CK差異最大，通過對(duì)比表2數(shù)據(jù)可得，A2B3、A2B2是較為理想的誘導(dǎo)桂南亞08-186居間分生組織腋芽的理想培養(yǎng)基。但由于二者顏色差異不大，說明 A2B3、A2B2在芽數(shù)效果上差異不顯著。

圖1 各處理出芽數(shù)

圖2 各處理出芽數(shù)熱圖

2.1.2 出芽瓶數(shù)分析

通過分析出芽瓶數(shù)可以得出，A2B3在出芽瓶數(shù)上較為突出。說明整體而言 A2B3的出芽情況較為均勻，也就是說，A2B3的出芽較為穩(wěn)定。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，A2B3(MS基本培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+0.05mg/L GA3)、A2B2(MS基本培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+0.01 mg/L GA3)具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)居間分生組織腋芽分化的能力，但是對(duì)比出芽情況后發(fā)現(xiàn)，A2B3具有較為整齊的出芽情況，因此，A2B3(MS基本培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+0.05 mg/L GA3)是較為理想的腋芽誘導(dǎo)處理。

圖3 各處理出芽瓶數(shù)

圖4 各處理出芽瓶數(shù)熱圖

通過分析結(jié)果得出，發(fā)現(xiàn) A2為 0.1 mg/L的NAA，NAA學(xué)名吲哚乙酸，是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，NAA不僅有促進(jìn)生根的作用，對(duì)于禾本科及某些單子葉植物而言，也有利于分化的作用[15]；B3和B2分別為0.01和0.05 mg/L濃度的GA3，GA3學(xué)名赤霉素，作為一種重要的植物激素，參與控制多種多樣的植物發(fā)育和生理過程。赤霉素參與調(diào)節(jié)植物生物發(fā)育中一個(gè)突出特點(diǎn)是促使莖的伸長(zhǎng)和植株增高[16]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明較低濃度的 NAA配合較高濃度的 GA3對(duì)桂南亞 08-186居間分生組織具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)分化作用。NAA可以打破分化居間分生組織的休眠，而GA3輔助促進(jìn)了腋芽伸長(zhǎng)和增高，二者相結(jié)合的方式可以打破休眠誘導(dǎo)分化居間分生組織長(zhǎng)出腋芽。另外，本研究中，出芽數(shù)與激素濃度數(shù)據(jù)并未呈現(xiàn)高度的線性分布，其中GA3的最佳濃度處于試驗(yàn)濃度中最高的，更高濃度的效果如何尚不清楚，需要擴(kuò)大濃度范圍進(jìn)一步開展試驗(yàn)，以獲得更加準(zhǔn)確的激素濃度。

本實(shí)驗(yàn)中，桂南亞08-186在NAA與GA3外源激素的條件下均出現(xiàn)了良好的腋芽萌發(fā)現(xiàn)象，表現(xiàn)出對(duì)這 2種激素較為敏感?？梢钥隙ǖ氖荖AA與GA3的作用，是打破甘蔗居間分生組織休眠并誘導(dǎo)甘蔗居間分生組織腋芽分化關(guān)鍵，因此，這2種外源激素也可以是其他甘蔗品種用于居間分生組織誘導(dǎo)腋芽發(fā)生的重要參考，也成為降低大規(guī)模甘蔗組培生產(chǎn)成本的重要關(guān)鍵。