劉雪艷，程林圓，周國利

（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252059）

選擇性剪接（Alternative splicing，AS）是擴大真核細(xì)胞遺傳多樣性的一種普遍機制［1］。大約90%的人類基因通過這個精細(xì)調(diào)控的過程產(chǎn)生一個以上的轉(zhuǎn)錄本［2，3］?；虻那绑wmRNA通過不同的剪接方式產(chǎn)生不同的mRNA剪接變異體，通過剪接因子和相應(yīng)轉(zhuǎn)錄組中順式作用元件之間的相互作用，進(jìn)而精細(xì)調(diào)控組織和階段特異性剪接事件，可變剪接是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機制，是導(dǎo)致真核生物基因和蛋白質(zhì)種類多樣性和差異性的重要原因［4］。AS轉(zhuǎn)錄本的時空表達(dá)譜在很大程度上有助于細(xì)胞分化、特化和器官發(fā)生［5］。

選擇性多聚腺苷酸化（Alternative polyadenylation，APA）是真核生物細(xì)胞中普遍存在的一種基因調(diào)控機制，選擇不同的加尾信號可以使單個基因產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄本［6，7］。APA的結(jié)果是可以產(chǎn)生具有不同編碼序列的轉(zhuǎn)錄本，或者不同長度的3＇端非翻譯區(qū)（3＇untranslated region，3＇UTR），而不同長度的3＇UTR影響著mRNA的穩(wěn)定性、定位和翻譯效率，因此，APA在細(xì)胞發(fā)育、分化和增殖過程中對基因表達(dá)具有重要的調(diào)控作用［8，9］。

牛的Basigin（BSG）基因，位于7號染色體上，長約9 kb，含有7個外顯子。BSG基因編碼一種廣泛表達(dá)的跨膜糖蛋白Basigin，也稱CD147，它參與機體腫瘤發(fā)生、胚胎發(fā)育、能量代謝、損傷修復(fù)等多種生理和病理過程［10］。人和小鼠的BSG基因剪接變異體已經(jīng)被克?。?1，12］，然而牛的BSG基因是否存在AS和APA變異體尚不清楚。因此，本研究的目的是通過3＇RACE技術(shù)和測序技術(shù)去尋找牛的BSG基因是否存在AS或APA的生物學(xué)事件。研究結(jié)果將會補充牛的基因組數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步分析牛BSG基因不同變異體在不同的生物學(xué)過程中的功能奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

RNAeasy?Plus動物RNA抽提試劑盒、BeyoRT?cDNA第一鏈合成試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖、凝膠DNA回收試劑盒均購自天根生化科技公司；Taq酶、dNTPs、T載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)普通分析純。

1.2 動物組織樣品及總RNA提取

魯西黃牛的組織樣品采自山東省聊城市張爐集鎮(zhèn)屠宰場。在屠宰后立即采集牛的里脊、睪丸、腎臟、肝臟等組織，并迅速投到液氮中帶回實驗室，利用RNA試劑盒提取總RNA，用濃度為1%～1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。

1.3 BSG基因變異體的克隆與測序

根據(jù)NCBI中牛BSG基因的mRNA序列（Gen-Bank登錄號：NM_001075371.2），利用Oligo 6.0軟件設(shè)計用于牛BSG基因變異體克隆的2條上游特異性引物，第一個引物在第二個引物的下游。經(jīng)BLAST程序比對，各條引物在牛的基因組上均沒有互補序列。

利用表1中所設(shè)計的用于3＇RACE的cDNA反轉(zhuǎn)錄通用引物，用cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)組織的cDNA，然后以獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物通過凝膠回收試劑盒純化回收，利用連接試劑盒將回收的PCR產(chǎn)物克隆到T載體上，陽性的克隆進(jìn)行雙向測序，再用DNAStar 5.0軟件、NCBI和UCSC網(wǎng)站的BLAST程序作序列比對分析。

表1 BSG基因3＇RACE相關(guān)引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 組織樣品總RNA電泳檢測

分別從肝、睪丸、腎、里脊組織中提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。電泳結(jié)果顯示，提取總RNA的28S rRNA與18S rRNA的條帶比較明顯，5S條帶比較暗，說明提取的RNA完整性較好，沒有明顯的降解（圖1），可以用于后續(xù)的相關(guān)試驗。

圖1 各組織樣品總RNA電泳檢測

2.2 3＇RACE產(chǎn)物的電泳及測序

2.2.1 3＇RACE產(chǎn)物電泳 通過濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖2）可以看出，擴增出的目標(biāo)片段至少為3條，可能是由于基因選擇性表達(dá)，它們并沒有來源于同一個組織。在腎組織的PCR擴增產(chǎn)物中，有2條比較明顯條帶，700 bp左右的條帶亮度明顯大于300 bp，并且在100 bp附近也能觀察到1條與里脊中大小相似的條帶，但是條帶的亮度比較弱。在里脊組織中有1條亮度明顯的約100 bp的條帶，但該條帶較寬，不能確定該條帶存在幾條目的片段，可以通過后續(xù)的克隆和測序驗證。

圖2 3＇RACE產(chǎn)物電泳

2.2.2 3＇RACE產(chǎn)物片段測序 通過利用上游GSP1、GSP2特異性引物與下游RTUP2通用引物進(jìn)行巢式PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、克隆和測序后發(fā)現(xiàn)有4條目的片段，根據(jù)片段的大小將它們分別命名為BSG-v1、BSG-v2、BSG-v3和BSG-v4，各片段的部分序列及峰圖見圖3。

BSG-v1片段的組織來源為牛的腎臟組織，上下游引物之間長767 bp，在poly（A）尾上游17～23 bp處存在1個經(jīng)典的加尾信號“AATAAA”（圖3a）。利用NCBI中的BLAST程序?qū)υ撔蛄信c牛的基因組進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與牛BSG基因的序列完全一致，并且所獲得的BSG-v1就是NCBI中已經(jīng)公布的序列（Gen-Bank登錄號：NM_001075371.2）。BSG-v2片段的組織來源為牛的腎臟組織，上下游引物之間長245 bp，在poly（A）尾上游12～18 bp處存在1個經(jīng)典的加尾信號“AATAAA”，該加尾信號序列與BSG-v1是同一個加尾信號（圖3b）。該序列與牛的基因組比對，發(fā)現(xiàn)與牛BSG基因的序列高度同源。BSG-v3和BSGv4片段來源于牛的里脊組織，上下游引物之間分別為168 bp和129 bp，具有明顯的poly（A）尾結(jié)構(gòu)，但無經(jīng)典的加尾信號（圖3c，3d）。該序列與牛的基因組比對，發(fā)現(xiàn)BSG-v3和BSG-v4序列與牛BSG基因序列高度同源。

圖3 牛BSG基因各轉(zhuǎn)錄本變異體的部分序列與測序峰

通過使用NCBI比對發(fā)現(xiàn)，只有BSG-v1序列與已經(jīng)報道的完全一致，BSG-v2，BSG-v3和BSG-v4是新發(fā)現(xiàn)的可變剪接變異體。

2.2.3 牛BSG基因的可變剪接變異體的結(jié)構(gòu)分析利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序和UCSC網(wǎng)站（http：//genome.ucsc.edu/）上的BLAT程序聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，與BSG-v1相比，BSG-v2、BSG-v3和BSG-v4是BSG-v1不同形式的變異體（圖4）。BSG-v2在第7外顯子處發(fā)生了A3SS，導(dǎo)致BSG-v2的外顯子7比BSG-v1的短了515 bp，相當(dāng)于BSG-v2的內(nèi)含子6在原來的基礎(chǔ)上延伸了515 bp，但分析發(fā)現(xiàn)BSG-v2的內(nèi)含子6的邊界仍然符合“GT-AG”規(guī)則（圖4a）。此外，通過對來源于里脊組織的2個可變剪接變異體BSG-v3和BSG-v4的分析發(fā)現(xiàn)，二者都發(fā)生了APA現(xiàn)象，它們都沒有外顯子7，導(dǎo)致產(chǎn)生了更短的3＇UTR（圖4b，4c）。進(jìn)一步地分析發(fā)現(xiàn)，與BSG-v1和BSG-v2相比，雖然終止密碼子的位置發(fā)生了變動，但并沒有造成原有開放閱讀框（ORF）移碼突變，而是密碼子堿基以3的倍數(shù)形式缺失，造成羧基端變化。BSG-v3終止密碼子前2個密碼子與BSG-v1和BSG-v2不同，并且BSG-v3多了1個編碼氨基酸的密碼子（圖4b）。而BSG-v4在3＇端缺失了9個編碼氨酸的密碼子，使BSG的羧基端變短（圖4c）。而且BSG-v1和BSG-v2的3＇UTR區(qū)都非常短，無經(jīng)典的加尾信號，具有明顯的poly（A）尾巴。

圖4 牛BSG基因各轉(zhuǎn)錄本變異體的部分結(jié)構(gòu)與序列

3 小結(jié)與討論

在真核生物中，AS和APA的現(xiàn)象是普遍存在的［9，13］，本研究通過3＇RACE技術(shù)成功地克隆出了牛BSG基因的4條轉(zhuǎn)錄本的3＇端片段。經(jīng)序列對比和分析后發(fā)現(xiàn)，在這4條轉(zhuǎn)錄本中，最長的1條BSG-v1已經(jīng)在NCBI中公布。BSG-v2則在外顯子7中（也是3＇UTR）存在明顯的A3SS剪接現(xiàn)象。較短的2條BSG-v3和BSG-v4都分別存在1個新的poly（A）位點，但這4條不同的轉(zhuǎn)錄本并沒有來源于牛的同一個組織，這可能是基因的選擇性表達(dá)造成的。同時這也是AS和APA在真核細(xì)胞中的遺傳多樣性精細(xì)調(diào)控的一種體現(xiàn)［13］。

在本研究中，BSG-v2的外顯子7有515 bp的序列被剪接，與BSG-v1的內(nèi)含子6一起作為新的內(nèi)含子6被剪接掉，因為發(fā)生剪接的是外顯子7的5＇端，并且屬于3＇UTR，所以BSG-v2變異體的加尾信號并沒有改變（圖4a）。推測BSG-v1和BSG-v2可能會存 在 不 同 的 轉(zhuǎn) 錄 后 調(diào) 控 機 制［13，14］。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控基因表達(dá)功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸。成熟的miRNAs由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。成熟的miRNA結(jié)合到與其互補的mRNA的位點來調(diào)控基因表達(dá)，其中一些靶位點就存在于3＇UTR［15］。研究發(fā)現(xiàn)，與一般3＇UTR相比，一些基因通過內(nèi)含子保留形成的3＇UTR區(qū)域比其他區(qū)域有更大的可能含有更多miRNA的靶標(biāo)位點，因此，保留內(nèi)含子能顯著增加該基因被miRNA調(diào)控的可能［16］。一些研究已經(jīng)報道，基因的AS或APA的事件會導(dǎo)致該基因逃避某些miRNAs或RNA結(jié)合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）的調(diào)控［15-17］。所以由于BSG-v2變異體3＇UTR的A3SS剪接事件存在，可能會使該變異體逃避miRNAs的調(diào)控，從而導(dǎo)致牛BSG-v1和BSG-v2的差異表達(dá)調(diào)控；此外，基因的3＇UTR除受miRNAs的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控外，還會有一些RBPs的結(jié)合，從而促進(jìn)或抑制mRNA的穩(wěn)定性或翻譯效率。與BSG-v1相比，BSG-v2的3＇UTR長度短了515 bp，因此可能會缺失RBPs的結(jié)合位點，從而導(dǎo)致mRNA或蛋白水平上的差異。但具體逃避了哪些能夠與BSG-v2變異體的3＇UTR發(fā)生相互作用的miRNAs或RBPs，還需通過相應(yīng)的試驗進(jìn)一步證實。

此外，有趣的是本次克隆BSG基因mRNA的3＇端片段表明，來源于牛里脊組織的2條較短轉(zhuǎn)錄本具有明顯的新poly（A）位點，有非常短的3＇UTR序列，且都不包含外顯子7。BSG-v3比BSG-v1的ORF多一 個密碼 子，BSG-v4比BSG-v1的ORF缺 失9個密碼子，它們都是羧基端發(fā)生了變化，這種變化是否影響了BSG蛋白的功能，尚需進(jìn)行功能驗證。但有報道指出，APA如果發(fā)生在編碼區(qū)，可能會引起終止密碼子前移，提前終止編碼蛋白［6］。此外，在BSG-v4的poly（A）尾中還有一個“G”存在，這也是近年來研究發(fā)現(xiàn)的在poly（A）尾中存在非“A”堿基的一種新事件，也已經(jīng)成為近年來關(guān)于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究的熱點［18］。AS同樣也可能會引起終止密碼子位置的改變，根據(jù)當(dāng)前的研究發(fā)現(xiàn)，人的BSG基因通過AS選擇性編碼出4種變異體蛋白，分別為basigin-1、basigin-2、basigin-3和basigin-4［11］。但目前獲得的BSG-v3和BSG-v4變異體只是包括了外顯子5和外顯子6，至于其前面的外顯子是否發(fā)生了AS事件，還需要進(jìn)一步證實。但本研究成功克隆了牛BSG基因幾種不同形式的變異體，為進(jìn)一步探索BSG基因在牛的各種相關(guān)生物學(xué)過程中的表達(dá)調(diào)控及生物學(xué)功能奠定了一定的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。