張濤,岳淵,肖漓

1.佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,佳木斯 154007;2.中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心呼吸與危重癥醫(yī)學部研究所,北京市器官移植與免疫調(diào)節(jié)重點實驗室

急性肺損傷(ALI)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導致的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭,是呼吸科常見的危重疾病之一[1]。據(jù)報道,ALI患者的病死率達35%～40%[2]。其臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽、痰中帶血,部分患者可伴有呼吸困難或胸痛,ALI發(fā)展至嚴重階段被稱為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)[3]。導致ALI患者的原因有很多,如感染、休克、嚴重非胸部創(chuàng)傷、重度燒傷、大量輸血、急性胰腺炎及藥物中毒,或吸入煙塵、氧中毒及放射性損傷等[4]。由于ALI患者病死率居高不下,故早期快速診斷以及探索有效的治療方法意義重大。

近年來,越來越多的研究證明間充質(zhì)干細胞(MSC)及其分泌的外泌體可以治療ALI,MSC可以分泌多種細胞因子,MSC來源的外泌體(MSC-exo)則可以通過所攜帶的miRNA和蛋白質(zhì)作用于靶細胞,通過不同的機制來干預和調(diào)控ALI的發(fā)展[5-6]。MSC釋放的外泌體不僅有類似于干細胞的趨化作用,而且其免疫原性較弱,具有非常好的發(fā)展前景[7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)其他細胞如肺泡上皮細胞、內(nèi)皮祖細胞等分泌的外泌體也對ALI的修復發(fā)揮一定作用。

1 外泌體的概念與生物學特性

外泌體是直徑30～100 nm的囊泡樣小體,屬于一種細胞外囊泡(EV),由多種細胞主動向胞外分泌,包含復雜RNA和蛋白質(zhì)。其首次發(fā)現(xiàn)于20世紀80年代,Trams等[8]觀察到網(wǎng)織紅細胞在成熟期間會分泌一種含有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的小囊泡,介導轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的清除。在此后的十余年間,外泌體僅被看作是細胞清除代謝廢物的工具[9]。直到20世紀90年代末,Zitvogel等[10]研究表明,外泌體可能是細胞間通訊的重要媒介,這才重新激起了人們對外泌體研究的興趣。人體中幾乎所有類型的細胞都能產(chǎn)生外泌體,它可以從多種體液中被分離出來,包括血液、尿液、肺泡灌洗液(BALF)、唾液和腦脊液等。外泌體通過內(nèi)體和質(zhì)膜2種途徑產(chǎn)生,其中研究最多的是內(nèi)體途徑(即先由質(zhì)膜出芽形成早期內(nèi)體,然后早期內(nèi)體萌發(fā)腔內(nèi)囊泡形成囊泡小體,最終囊泡小體與質(zhì)膜融合釋放外泌體),也可以從質(zhì)膜直接出芽形成(即質(zhì)膜途徑)。

外泌體參與多種生理和病理過程,具有促凝和抗凝作用、促炎和抗炎作用、促血管生成等多種生物學活性。外泌體具有以下特點:①結(jié)構(gòu)特殊,特性穩(wěn)定,可以長時間低溫保存且不改變其活性;②體積小,可避免微循環(huán)阻塞;③外泌體表面有磷脂膜,可保證多種生物活性成分不易被酶降解。相比于細胞,外泌體在治療方面更具優(yōu)勢和應用潛力。因此,外泌體的研究在醫(yī)學領(lǐng)域日益受到矚目。

目前研究證實,外泌體是細胞間的通訊方式之一,可以完成細胞間遺傳物質(zhì)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的交換[11]。外泌體通過不同的途徑將信息傳遞給靶細胞,主要包括:①外泌體膜上的蛋白直接與靶細胞膜上的蛋白接觸,觸發(fā)胞內(nèi)信號級聯(lián);②外泌體胞膜與靶細胞胞膜融合,釋放其內(nèi)容物進入靶細胞;③靶細胞直接吞噬外泌體并將其內(nèi)化為組成部分。

2 外泌體的生物學功能

細胞凋亡的調(diào)控異常會導致多種疾病,ALI是由于細胞凋亡和肺部炎癥反應過度而導致組織損傷加重。其中脂多糖(LPS)誘導肺損傷后的細胞凋亡是導致ALI的主要途徑之一。Liu等[1]研究表明,骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)來源的外泌體(BMSC-exo)可有效抑制LPS誘導肺損傷后肺泡巨噬細胞(AMs)中的自噬體和自溶酶體斑點的形成,進而阻止LPS誘導的AMs凋亡。Mao等[12]研究表明,BMSC-exo在硫芥(SM)導致的ALI中具有抗細胞凋亡的作用。SM是一種可導致ALI的劇毒化學試劑。結(jié)果顯示,注射BMSC-exo 24 h后,凋亡細胞數(shù)量顯著減少。

外泌體不僅可以抑制細胞凋亡,同時具有促炎或抗炎作用。ALI時出現(xiàn)肺內(nèi)炎癥反應不可控,大量炎癥細胞和炎癥因子釋放。AMs是駐留在肺組織中的主要免疫細胞,它通過釋放過量的炎癥細胞因子,促進中性粒細胞浸潤和肺組織損傷,這在ALI發(fā)病機制中起核心作用。肺泡上皮細胞(AEC)是一種具有較大表面積的肺部結(jié)構(gòu)細胞,在肺損傷過程中AEC通常最先被破壞。而外泌體在AMs和AEC之間的信息傳遞中發(fā)揮重要作用。Sui等[13]研究表明,巨噬細胞培養(yǎng)液用LPS處理后,分離純化出外泌體,檢測到外泌體中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β和IL-6的水平顯著升高,說明用LPS誘導巨噬細胞后,該細胞分泌的外泌體具有促炎作用。Liu等[14]研究證實,AECs來源的外泌體(AECs-exo)可能是造成膿毒癥急性肺損傷炎癥加重的原因之一。實驗發(fā)現(xiàn)AECs分泌的外泌體中的miRNAs可以將炎癥信號傳遞給活化的巨噬細胞,進而引發(fā)肺內(nèi)炎癥,這表明AEC-exo在膿毒癥急性肺損傷中具有促炎作用。

Li等[15]使用LPS和MSC-exo處理Ⅱ型肺泡上皮細胞(MLE-12),觀察炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-10)的表達。結(jié)果顯示,與LPS處理組相比,經(jīng)MSC-exo處理的細胞中炎癥因子表達顯著下調(diào),提示MSC-exo具有抗炎作用。Liu等[1]的實驗發(fā)現(xiàn)LPS刺激后的血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高,隨后在靜脈或氣管內(nèi)注射BMSC-exo,TNF-α、IL-1β和IL-6的水平可顯著受到抑制。上述表明BMSC-exo可以有效減輕LPS引起的炎癥反應。

3 外泌體治療ALI可能的作用機制

3.1 外泌體通過調(diào)控信號傳導通路發(fā)揮作用 PI3K/Akt信號通路調(diào)控多種生理過程,包括細胞凋亡、增殖和分化。Mizuta等[16]研究證實,在組蛋白導致的ALI中,使用脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSCs)外泌體的抑制劑GW4869后,Akt磷酸化水平下調(diào),這說明Akt磷酸化是由ADSCs來源的外泌體(ADSCs-exo)誘導的。ADSCs-exo在上調(diào)Akt磷酸化水平的同時,也激活了PI3K/ Akt信號通路,從而減輕組蛋白導致的ALI。上述結(jié)果證明了ADSCs-exo通過PI3K/Akt信號通路減輕肺損傷程度。已知機體在受到感染后,炎癥反應需要啟動NF-κB信號通路。Li等[15]選取了Ho-1、GPX-1、Nrf-2、NF-κb和GR等5個與NF-κb信號通路相關(guān)的基因,探討MSC-exo能否通過NF-κb信號通路改善LPS誘導的ALI。結(jié)果顯示,輸注MSC-exo后,上述5個基因的表達受到顯著調(diào)控,并且炎癥反應程度減輕,證明了MSC-exo可通過NF-κB信號通路改善LPS誘導的ALI。

3.2 外泌體通過miRNA發(fā)揮作用 近幾年的研究表明,外泌體中的miRNA在細胞間微通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用,外泌體通過促進miRNA從一個細胞轉(zhuǎn)移到靶細胞而成為細胞間通訊的重要使者[17-18]。

內(nèi)皮祖細胞(EPC)可參與損傷血管的修復,減輕血管滲漏和炎癥反應,并增強細菌清除[19-20]。Zhou等[21]研究指出EPC來源的外泌體(EPC-exo)在膿毒癥中可以預防內(nèi)皮功能障礙和肺損傷,原因之一是它們攜帶了miRNA-126。miRNA-126是一種重要的血管生成信號調(diào)節(jié)因子,可以維持血管內(nèi)皮細胞和血管壁的完整性。實驗表明EPC-exo能夠?qū)iRNA-126轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細胞中,從而降低與ARDS發(fā)展相關(guān)的基因表達。此外,靜脈注射EPC-exo可減輕小鼠膿毒癥急性肺損傷,其原因也是依賴于miRNA-126的存在。

Yi等[22]為了證明MSC-exo分泌miRNA-30b-3p對LPS處理的MLE-12細胞的影響,將過表達miRNA-30b-3p的MSC-exo注射入ALI小鼠中,檢測MLE-12 細胞的增殖、凋亡情況。結(jié)果顯示,攜帶miRNA-30b-3p的MSC-exo可通過促進MLE-12增殖和抑制其凋亡對LPS導致的ALI發(fā)揮治療作用,緩解ALI小鼠肺損傷。

Xu等[23]使用光氣誘導大鼠ALI后,從大鼠BALF中分離出外泌體,發(fā)現(xiàn)外泌體促進了MSC增殖和IL-10釋放。通過miRNA譜分析,發(fā)現(xiàn)miRNA-28-5p在促進MSC增殖中發(fā)揮作用,且miRNA-28-5p可以激活PI3K/Akt信號通路。

Li等[18]從大鼠的MSC中提純出外泌體,發(fā)現(xiàn)miRNA-124-3p在MSC-exo中大量表達。將MSC-exo 注射入ALI大鼠中,發(fā)現(xiàn)MSC-exo miRNA-124-3p可提高ALI大鼠存活率,并增強其肺組織中谷胱甘肽/超氧化物歧化酶活性。經(jīng)miRNA-124-3p處理的大鼠BALF中巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞的數(shù)量顯著減少。上述結(jié)果表明,MSC-exo攜帶的miRNA-124-3p可改善ALI應激損傷。

3.3 外泌體通過調(diào)控自噬發(fā)揮作用 自噬是指細胞吞噬自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡,與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其包裹內(nèi)容物,借此實現(xiàn)細胞代謝和某些細胞器更新。自噬在生理和病理過程中都可發(fā)生,其在ALI中所起的作用尚未完全闡明。Liu等[1]研究表明BMSC-exo在LPS刺激后的肺泡巨噬細胞中顯著降低了Beclin-1表達。Beclin-1基因是一種自噬相關(guān)基因,與Bcl-2基因相互拮抗而調(diào)控自噬。BMSC-exo通過抑制肺泡巨噬細胞自噬而減輕LPS導致的ALI。而Wei等[2]研究表明,人臍帶間充質(zhì)干細胞(hucMSCs)釋放的外泌體通過增強自噬和抑制炎癥因子表達而緩解LPS誘導的ALI。

4 間充質(zhì)干細胞來源的外泌體在新冠肺炎治療中發(fā)揮作用

2020年，由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎在全球爆發(fā)。新冠肺炎患者死亡的主要原因是低氧性呼吸衰竭,最終導致ARDS[24]。新冠肺炎的大流行給全球公共衛(wèi)生和國際經(jīng)濟帶來巨大的負面影響[25]。外泌體含有與其來源細胞相似的成分,如MSC-exo與MSC在功能上一致,而MSC-exo有更多的優(yōu)勢,如穿透血液屏障、有較低的免疫原性、無腫瘤發(fā)生風險、可以大規(guī)模制造等,而且MSC-exo成本更加低廉,因此MSC-exo成為治療新冠肺炎潛在治療方案之一[26-27]。

Sengupta等[28]對24例新冠肺炎患者進行了臨床試驗研究以評估BMSC-exo的安全性和有效性。BMSC-exo經(jīng)靜脈注射后,細胞因子風暴顯著減輕,患者缺氧情況顯著改善,且72 h內(nèi)無不良反應。Zhang等[29]表明表達hACE2的外泌體可以與細胞上的hACE2競爭性結(jié)合SARS-CoV-2的刺突蛋白,從而阻斷病毒侵入宿主細胞。Khalaj等[30]認為外泌體作為一種新冠肺炎的新型治療方法具有巨大的潛力,外泌體可降低肺炎癥反應,使受損肺泡上皮和內(nèi)皮細胞再生修復,防止肺纖維化。

在新冠肺炎大流行期間,我們一直在探尋關(guān)于外泌體治療新冠肺炎合理有效的方法,并在臨床試驗方案中評估其安全性和有效性,這些研究成果對于SARS-CoV-2來說是非常有價值的。

5 總結(jié)與展望

不同細胞來源的外泌體作用差別很大。如MSC-exo可以預防早期缺氧引起的肺部炎癥,修復內(nèi)皮屏障,減輕肺水腫,恢復肺泡清除率,改善急性肺損傷患者的呼吸功能;而BALF中巨噬細胞的外泌體則會分泌促炎因子,促進肺部發(fā)生炎癥反應;肺泡上皮細胞釋放的外泌體可將炎癥信號傳遞給活化的巨噬細胞而引發(fā)肺內(nèi)炎癥;EPC-exo則可以通過miR-126減輕ALI。

與藥物治療相比,外泌體治療方法有很大的優(yōu)勢:①外泌體免疫原性較低,可以避免免疫應答激活;②外泌體作為一種新型療法,其尺寸小可深入到大多數(shù)組織內(nèi)部;③外泌體有良好的生物穩(wěn)定性,可裝載藥物;④外泌體可保持良好的生物相容性,能攜帶多種類型的生物分子;⑤外泌體可對其表面特異性受體進行加工,以實現(xiàn)將治療性分子作用于靶細胞等。這都使得其在治療ALI中存在良好的應用前景。