田歡歡 馮楊波 趙晉波 羅盅麟 石磊 郝瑛輝 李小飛

食管癌（Esophageal cancer，ESCA）是一種常見的上消化道腫瘤。2018年WHO國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，食管癌在全球范圍內(nèi)所有腫瘤中發(fā)病率位居第7位，死亡率位居第6位[1]。食管癌的發(fā)病率和死亡率在全世界范圍內(nèi)差異很大，歐美等發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率很低，病理類型主要以腺癌為主；亞洲發(fā)展中國家的發(fā)病率很高，病理類型主要以鱗癌為主[2]。我國的食管癌患者數(shù)位居全球第1位，并以鱗狀細(xì)胞癌為主，占比可達(dá)90%以上，全國每年因食管癌死亡人數(shù)可達(dá)19.3萬人[2，3]。食管癌發(fā)病率在我國的分布也是極具特點(diǎn)，在太行山南段的山西、河南、河北交界地區(qū)發(fā)病率最高，并以林州為甚[4]。流行病學(xué)顯示，造成這種情況的原因可能與此地區(qū)喜歡吃咸菜、進(jìn)食過硬過快以及食物和飲用水中缺乏多種微量元素有關(guān)[5]。食管癌的病因復(fù)雜多樣，目前已經(jīng)證實，酗酒和吸煙是食管癌重要的致病原因[6]，另外亞硝胺和一些霉菌及其毒素也是導(dǎo)致食管癌的危險因素，其他因素還包括食物中缺乏多種微量元素和多種維生素、進(jìn)食過快過硬等不良飲食習(xí)慣和食管癌的遺傳易感性[7]。

雖然目前食管癌采取多學(xué)科綜合治療，但5年生存率僅為15%～25%[8]，預(yù)后并不理想。主要因為大多數(shù)食管癌患者早期癥狀不明顯，確診時已是中晚期，喪失手術(shù)機(jī)會[2，9]。對于不可手術(shù)食管癌患者最主要治療為全身治療，包括化學(xué)治療、靶向治療、免疫治療等?；熓菓?yīng)用最廣泛、最成熟的全身治療方法，屬于一線治療；靶向治療目前也取得一定進(jìn)展，但應(yīng)用在臨床的藥物極少，目前只有曲妥珠單抗和雷莫蘆單抗獲得批準(zhǔn)用于晚期食管癌患者[10，11]。近幾年隨著免疫檢查點(diǎn)的不斷研究，免疫治療在食管癌治療中取得重大成果，為晚期食管癌患者帶來了新希望[12]，已成為晚期食管癌患者的二線治療。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)的知識分析了解食管癌相關(guān)的基因表達(dá)，探索該基因與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系，為食管癌患者的免疫治療提供一些幫助。

免疫系統(tǒng)對于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，腫瘤細(xì)胞的生長和清除同樣受到免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[13]。在正常機(jī)體中，免疫系統(tǒng)可以識別和清除腫瘤微環(huán)境中發(fā)生癌變的細(xì)胞，但在某些情況下，癌變的細(xì)胞可能會逃過免疫系統(tǒng)的識別，發(fā)生免疫逃逸，使腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[14]。免疫治療是增強(qiáng)自身免疫應(yīng)答反應(yīng)，使免疫系統(tǒng)重新識別癌變細(xì)胞，從而消除腫瘤的一種治療方法[15]。免疫治療中采用免疫檢查點(diǎn)抑制劑是近幾年最熱門的治療方式。T細(xì)胞是細(xì)胞免疫的基礎(chǔ)，T細(xì)胞免疫應(yīng)答受刺激信號與抑制信號共同調(diào)節(jié)。目前程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）是研究最熱門的抑制信號[16]。

HAVCR2的全稱為T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3，被認(rèn)為是Th1細(xì)胞表面的抑制性分子[17]，HAVCR2與其他TIM家族成員有一個共同的結(jié)構(gòu)，其特征是細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中有5個酪氨酸殘基。關(guān)于其細(xì)胞內(nèi)信號機(jī)制，已知Tyr256/263與HLA-B關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子3（BAT3）和酪氨酸激酶FYN相互作用。HAVCR2是一種表達(dá)于CD4 T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞和單核細(xì)胞表面的受體[18]。研究表明，HAVCR2 可介導(dǎo)T細(xì)胞失能和耗竭，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而影響患者預(yù)后和轉(zhuǎn)歸[19，20]，HAVCR2的表達(dá)在惡性腫瘤的發(fā)生中對免疫功能具有抑制作用。目前HAVCR2基因在食管癌中的研究較少，發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本研究通過下載TCGA數(shù)據(jù)庫中食管癌miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床特征數(shù)據(jù)，分析HAVCR2在食管癌中的發(fā)病機(jī)制及HAVCR2與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料TCGA官網(wǎng)（https://cancergenome.nih.gov/）[21]下載食管癌測序數(shù)據(jù)，得到160例食管癌測序數(shù)據(jù)和11例正常食管組織的數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床信息。將下載的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料數(shù)據(jù)文件解壓成文本文件，利用R軟件程序?qū)?shù)據(jù)整理為可處理的表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)。在Ensemble官網(wǎng)（http://asia.ensemble.org/index）中下載人類基因注釋文件，在R語言程序中將基因Ensemble ID轉(zhuǎn)化為Gene ID，以進(jìn)一步分析。

1.2 統(tǒng)計學(xué)方法通過非參數(shù)檢驗分析HAVCR2基因在食管癌組織和正常食管組織的表達(dá)差異。Oncomine數(shù)據(jù)集中尋找HAVCR2基因在食管癌組織中的表達(dá)證據(jù)。根據(jù)TCGA-ESCA數(shù)據(jù)庫中總生存期數(shù)據(jù)繪制HAVCR2高、低表達(dá)組的Kaplan-Meier生存曲線，并進(jìn)行Log-rank檢驗。通過單因素Cox回歸分析篩選出與總生存期（Overall survival，OS）相關(guān)的差異基因，并繪制包含 Stage、T、N、M、HAVCR2的表格。利用“estimate[22]”包估計每個樣本在腫瘤微環(huán)境中的免疫成分和基質(zhì)成分含量。隨后通過ssGSEA解釋HAVCR2的表達(dá)與免疫細(xì)胞的關(guān)系。利用“pheatmap”包繪制HAVCR2高表達(dá)時免疫細(xì)胞功能狀態(tài)的熱圖。利用CIBERSORT[23]估計腫瘤樣本的腫瘤浸潤免疫細(xì)胞（Tumor-infiltrating immune cell，TIC）豐度，選擇P＜0.05的腫瘤樣本。HAVCR2高、低表達(dá)組之間免疫細(xì)胞差異和免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)差異分析均采用Wilcoxon檢驗。利用基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）闡 述HAVCR2高、低表達(dá)組之間差異表達(dá)的基因所富集的生物學(xué)通路。從MSigDB數(shù)據(jù)庫下載KEGG、BIOCARTA、REACTOME、GO作為GSEA分析的參考基因集，NOMP＜0.05的富集通路被認(rèn)為有意義。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有統(tǒng)計學(xué)分析均利用R語言完成。

2 結(jié)果

2.1 HAVCR2基因在正常組織與食管癌組織中的表達(dá)Oncomine數(shù)據(jù)集（https://www.oncomine.org/re source/login.html）提示，目前暫無相關(guān)證據(jù)支持HAVCR2在食管癌中的研究現(xiàn)狀，見圖1A。通過非參數(shù)檢驗分析HAVCR2在食管癌組織和正常食管黏膜組織的表達(dá)差異，結(jié)果顯示：食管癌組織較正常食管組織高表達(dá)HAVCR2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1B。上述結(jié)果顯示HAVCR2在食管癌中表現(xiàn)為高表達(dá)，由此推測HAVCR2在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，可能與食管癌的惡變有關(guān)。

圖1 HAVCR2在Oncomine數(shù)據(jù)集中現(xiàn)狀以及食管癌組織和正常食管組織中的表達(dá)

2.2 HAVCR2基因表達(dá)與食管癌患者總生存期的關(guān)系為深入了解HAVCR2表達(dá)與患者生存狀況的關(guān)系，探尋可能的預(yù)后指標(biāo)，我們利用食管癌TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生存分析。在TCGA中下載的160例食管癌測序數(shù)據(jù)中，79例測序數(shù)據(jù)有預(yù)后信息，這些癌組織中基因表達(dá)水平高于其中位數(shù)者為高表達(dá)，反之為低表達(dá)。根據(jù)TCGA-ESCA數(shù)據(jù)庫中總生存期數(shù)據(jù)繪制HAVCR2高、低表達(dá)組的Kaplan-Meier生存曲線，并進(jìn)行Log-rank檢驗，見圖2。結(jié)果表明，HAVCR2基因表達(dá)與食管癌患者的總生存期無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.29）。雖然結(jié)果顯示HAVCR2對食管癌患者的總生存期影響不是很顯著，但是這并不能否認(rèn)HAVCR2的表達(dá)在食管癌中所發(fā)揮的作用。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫HAVCR2基因表達(dá)與食管癌患者生存率的關(guān)系

2.3 食管癌患者臨床特征與OS的關(guān)系下載的食管癌測序數(shù)據(jù)中，同時含臨床數(shù)據(jù)和總生存期的測序數(shù)據(jù)有71例。使用單因素Cox回歸分析這71例測序數(shù)據(jù)來探討食管癌患者中HAVCR2表達(dá)和OS之間的關(guān)系，以及食管癌患者的其他臨床特征，見表1。單變量相關(guān)分析顯示，病理分期中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=2.035，P＜0.05）與OS顯著相關(guān)；腫瘤浸潤深度（HR=1.031，P＞0.05）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（HR=3.007，P＞0.05）、HAVCR2表達(dá)（HR=1.105，P＞0.05）等因素與OS無關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是食管癌最主要的轉(zhuǎn)移方式，其引流區(qū)域主要在頸部、胸部和腹部。出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者一般提示死亡率高和預(yù)后差，因此對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢測有重要意義。食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移受腫瘤的分化程度、腫瘤長度及浸潤深度等多種因素共同影響，對N分期的深入了解，有助于手術(shù)方式的選擇。淋巴結(jié)與免疫系統(tǒng)密不可分，這也為HAVCR2的表達(dá)與免疫相關(guān)提供了證據(jù)。

表1 單因素Cox回歸分析食管癌患者臨床特征與生存的關(guān)系

2.4 食管癌HAVCR2表達(dá)與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系為了分析HAVCR2的表達(dá)與免疫微環(huán)境的相關(guān)性，我們使用“estimate”包評價每個食管癌樣本在腫瘤微環(huán)境中的免疫成分（免疫評分）和基質(zhì)成分（基質(zhì)評分），并比較HAVCR2高低表達(dá)與兩個評分組之間的統(tǒng)計學(xué)差異。為闡明食管癌樣本中免疫成分比例和基質(zhì)成分比例與HAVCR2高、低表達(dá)組的關(guān)系，我們利用Wilcoxon檢驗進(jìn)行了差異分析。結(jié)果表明，高表達(dá)HAVCR2食管癌中免疫成分和基質(zhì)成分也高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖3A。隨后通過ssGSEA解釋HAVCR2的表達(dá)與免疫細(xì)胞的關(guān)系，利用“pheatmap”包繪制免疫細(xì)胞功能狀態(tài)熱圖。結(jié)果顯示，與HAVCR2低表達(dá)組相比，高表達(dá)組的estimate總體評分、免疫評分和基質(zhì)評分較高，但腫瘤純度較低，見圖3B。HAVCR2高表達(dá)時，腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞種類及數(shù)量增多，免疫功能可能處于被激活狀態(tài)，進(jìn)一步證實了HAVCR2與免疫的相關(guān)性。。

為進(jìn)一步揭示HAVCR2表達(dá)與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的關(guān)系，我們利用CIBERSORT算法分析了食管癌組織中腫瘤浸潤免疫細(xì)胞各種亞群的比例，并且在食管癌樣本中構(gòu)建了22種免疫細(xì)胞的表達(dá)譜，見圖3C。同時評估了22種免疫細(xì)胞之間可能存在的相關(guān)性。熱圖顯示，不同腫瘤浸潤免疫細(xì)胞亞群的比率也不同。此22種免疫細(xì)胞與CD8 T細(xì)胞相比，CD4活動記憶T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞呈正相關(guān)，而與巨噬細(xì)胞M0呈負(fù)相關(guān)；此22種免疫細(xì)胞與靜止NK細(xì)胞相比，活動NK細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，見圖3D。隨后，我們評估了HAVCR2高、低表達(dá)組的免疫細(xì)胞表達(dá)是否存在差異。結(jié)果表明，在高HAVCR2組和低HAVCR2組之間觀察到幼稚B細(xì)胞、效應(yīng)記憶T-CD4、效應(yīng)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M1/M2存在顯著差異。與低表達(dá)組相比，高表達(dá)組效應(yīng)記憶T-CD4、效應(yīng)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M1/M2數(shù)量增加（P＜0.05），而幼稚B細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.05），見圖3E。分析高、低表達(dá)組常見免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)特征，結(jié)果表明大部分免疫檢查點(diǎn)基因在HAVCR2高表達(dá)組中也高表達(dá)，見圖3F。

圖3 食管癌HAVCR2表達(dá)與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系

為了闡述HAVCR2高、低表達(dá)組之間差異表達(dá)基因（DEGs）所富集的生物學(xué)過程，我們利用基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）探索與HAVCR2基因表達(dá)可能相關(guān)的信號通路。其中KEGG 信號通路分析是以基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息為基礎(chǔ)，預(yù)測蛋白在細(xì)胞活動中的作用，并對信號通路中的關(guān)鍵基因進(jìn)行富集。GO富集分析包括生物學(xué)過程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）、細(xì)胞組分（Cell components，CC）3個獨(dú)立的本體論，其通過建立一套具有動態(tài)形態(tài)的控制集解釋基因及蛋白在細(xì)胞內(nèi)所產(chǎn)生的作用，進(jìn)而分析出DEGs在BP、MF、CC 3個方面的富集情況。本研究只分析了BP部分，并將結(jié)果繪制為氣泡圖，見圖4。結(jié)果顯示：KEGG信號通路富集分析主要富集于2條信號通路：自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通路（Natural killer cell mediated cytotoxicity pathway）、T細(xì)胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway）。BIOCARTA信號通路富集分析主要富集在T細(xì)胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway）。REACTOME信 號通路富集分析主要富集在T細(xì)胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway）、干擾素-γ信號通路（Interferon gamma signaling pathway）。GO分析結(jié)果顯示，食管癌組織與正常組織顯著性DEGs的BP主要富集在T細(xì)胞介導(dǎo)免疫通路（T cell mediated immunity pathway）、T細(xì)胞增殖的正調(diào)控通路（Positive regulation of T cell proliferation pathway）、干擾素γ產(chǎn)生通路（Interferon gamma production pathway）、T細(xì)胞受體信號通路（T cell receptor signaline pathway）等方面。這4種富集通路共同富集了T細(xì)胞受體信號通路。這可能提示，HAVCR2表達(dá)越高的食管癌組織中T細(xì)胞受體信號通路被激活，免疫功能增強(qiáng)，患者的預(yù)后可能更好。但是，食管癌患者的預(yù)后是多種因素共同作用的結(jié)果，單看T細(xì)胞受體信號通路被激活這一項的說服力還不強(qiáng)，需要更深層次的研究。

圖4 富集分析

3 討論

食管癌在我國的發(fā)病率和死亡率都很高，患者的生活質(zhì)量不高，為患者及家屬帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此研究食管癌的預(yù)后和免疫的相關(guān)性很有必要。

本研究中，首先我們在Oncomine數(shù)據(jù)集中尋找HAVCR2基因在食管癌組織中的表達(dá)證據(jù)。其次通過非參數(shù)檢驗分析HAVCR2在食管癌組織和正常食管組織的表達(dá)差異。隨后，根據(jù) TCGA 數(shù)據(jù)庫中總生存期數(shù)據(jù)繪制了HAVCR2高、低表達(dá)組的 Kaplan-Meier生存曲線，并進(jìn)行Log-rank檢驗。結(jié)果表明HAVCR2基因表達(dá)與食管癌患者的總生存期無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，不能夠作為食管癌的預(yù)后因子。隨后，我們進(jìn)行單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，病理分期中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與OS顯著相關(guān)；腫瘤浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、HAVCR2表達(dá)等因素與OS無關(guān)。淋巴結(jié)與免疫系統(tǒng)密不可分，所以我們猜測HAVCR2可能與免疫相關(guān)。隨后，分析了HAVCR2與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系。腫瘤微環(huán)境是指腫瘤發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境，它不僅包括腫瘤所在組織的結(jié)構(gòu)、功能和代謝，而且包括與腫瘤細(xì)胞自身（核和胞質(zhì)）的內(nèi)在環(huán)境[24]。為了分析HAVCR2的表達(dá)與免疫的相關(guān)性，我們使用“estimate”包評價每個食管癌樣本在腫瘤微環(huán)境中的免疫成分和基質(zhì)成分。為闡明食管癌樣本中免疫成分比例和基質(zhì)成分比例與HAVCR2高低表達(dá)的關(guān)系，我們利用 Wilcoxon 檢驗進(jìn)行了差異分析。結(jié)果表明，高表達(dá)HAVCR2食管癌中免疫成分和基質(zhì)成分也高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。隨后通過ssGSEA解釋HAVCR2的表達(dá)與免疫細(xì)胞的關(guān)系，利用“pheatmap”包繪制HAVCR2高表達(dá)時免疫細(xì)胞功能狀態(tài)的熱圖，結(jié)果顯示，與HAVCR2低表達(dá)組相比，高表達(dá)組的estimate總體評分、免疫評分和基質(zhì)評分較高，但腫瘤純度較低。HAVCR2高表達(dá)時，腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞種類及數(shù)量增多，免疫功能處于增強(qiáng)狀態(tài)。為進(jìn)一步揭示HAVCR2表達(dá)與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的關(guān)系，我們利用CIBERSORT 算法分析了食管癌組織中腫瘤浸潤免疫細(xì)胞各亞群的比例，且在食管癌樣本中構(gòu)建了22種免疫細(xì)胞的表達(dá)譜，并評估了HAVCR2高、低表達(dá)組的免疫細(xì)胞表達(dá)是否存在差異。結(jié)果表明，在高HAVCR2組和低HAVCR2組之間觀察到幼稚B細(xì)胞、效應(yīng)記憶T-CD4、效應(yīng)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M1/M2存在顯著差異。隨后，探討了高、低表達(dá)組常見免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)特征。結(jié)果表明大部分免疫檢查點(diǎn)基因在HAVCR2高表達(dá)組中也高表達(dá)。最后闡述高、低組之間差異表達(dá)基因所富集的生物學(xué)過程，我們利用基因集富集分析探索與HAVCR2基因表達(dá)可能相關(guān)的信號通路，4種富集通路共同富集了T細(xì)胞受體信號通路。這就說明，HAVCR2表達(dá)越高的食管癌組織中T細(xì)胞受體信號通路被激活，免疫功能可能增強(qiáng)。

目前研究表明，HAVCR2在自身免疫、感染和癌癥等疾病中都發(fā)揮作用[18]。在乳腺癌中，HAVCR2在CD4+和CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)主要與乳腺癌較差的預(yù)后、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分級有關(guān)[25]。在鼻咽癌中，HAVCR2可通過SMAD7-SMAD2-SNAIL1信號通路與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)[26]。還有研究表明HAVCR2與PD-1具有協(xié)同作用，共同阻斷HAVCR2和PD-1有助于恢復(fù)抗腫瘤免疫和增加T細(xì)胞活性[27]。但是目前HAVCR2在食管癌中的研究還不充分，具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來，隨著免疫治療的不斷發(fā)展以及TCGA等公共數(shù)據(jù)庫對食管癌中預(yù)后標(biāo)志物及致病機(jī)制分析的應(yīng)用，為食管癌患者預(yù)后的預(yù)測及致病分子機(jī)制和治療的研究提供了新的思路。

總之，HAVCR2在食管癌中高表達(dá)，并且可以激活免疫功能。本研究揭示了HAVCR2與食管癌臨床特征有一定的關(guān)聯(lián)性，為進(jìn)一步研究食管癌的致病機(jī)制和臨床治療方法提供了幫助。但本研究有局限性：首先，樣本量不大，研究結(jié)論說服力不強(qiáng)；其次，本研究數(shù)據(jù)來源于公共數(shù)據(jù)庫，缺乏一定的基礎(chǔ)實驗；再次，蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔(dān)者，目前對蛋白質(zhì)的表達(dá)還缺乏相應(yīng)的研究，這些不足將在后續(xù)工作中逐步完善。