魯歡樂,倪紅妙,張宇東,劉 媛

魯歡樂,倪紅妙,張宇東,劉媛,杭州市第九人民醫(yī)院重癥醫(yī)學檢驗科 浙江省杭州市 330112

0 引言

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury,DILI)是由各種藥物及其代謝產(chǎn)物誘發(fā)的肝損傷,是最常見和最嚴重的一種藥物不良反應,可導致急性肝衰竭,甚至死亡,迄今仍缺乏特效治療手段,因此研究客觀、特異、簡便診斷和病情評估方法意義重大[1].現(xiàn)階段DILI的診斷常依據(jù)患者用藥史、肝功能檢測、臨床癥狀體征、肝組織活檢等,存在流程繁瑣、特異性低、有一定創(chuàng)傷等缺點,在DILI患者初步篩查中應用受限,故有必要研究便捷性的診斷方法.血清鐵蛋白(serum ferritin,SF)是評估機體鐵儲存量的有效指標,根據(jù)既往資料[2],SF在肝損傷患者中水平高于無肝損傷者.單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)在放射性肝損傷小鼠中水平升高,可反映小鼠肝損傷情況[3].高遷移率族蛋白-1(high mobility group protein-1,HMGB1)在利福平致肝損傷小鼠中水平升高,阻斷HMGB1可通過抑制HMGB1-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑減輕利福平導致的小鼠肝損傷[4].故推測SF、MCP-1、HMGB1可能與DILI有關,并有助于DILI的診斷,但現(xiàn)階段關于這方面的臨床報道鮮見,基于此本研究對此進行探討,旨在為臨床診治DILI提供參考,報告如下.

1 材料和方法

1.1 材料 選取2018-01/2021-02我院收治的184例DILI患者作為研究對象進行前瞻性研究,其中154例可明確用藥名稱,30例未能明確具體用藥.導致DILI的藥物種類有中草藥32例(主要有蜂膠糖脂舒軟膠囊、維C銀翹片、雷公藤多甙片、小柴胡),保健品類66例(主要有健腦類、益腎類等),解熱鎮(zhèn)痛消炎藥30例(主要有對乙酰氨基酚、安乃近、布洛芬、別嘌醇),抗生素22例(主要有阿奇霉素、頭孢類抗菌素、克林霉素),抗腫瘤藥4例(環(huán)磷酰胺),除保健品類40例患者說明存在過量服用外,剩余患者均主訴遵醫(yī)囑或售賣商家建議的劑量用藥,未過量用藥.納入標準: (1)DILI的診斷參考《藥物性肝損傷診治指南》[5]中標準(見圖1);(2)首次確診;(3)入組前無相關治療史;(4)年齡≥18歲.排除標準: (1)肝癌患者;(2)用藥前肝功能異常者;(3)用藥前有病毒性肝炎、自身免疫性肝炎者.并選取同期酒精性肝病(16例)、非酒精性脂肪肝病(54例)患者70例作為非DILI肝病組以及體檢中心70例健康人群作為對照組.本研究獲醫(yī)院倫理委員會審核通過,患者及家屬充分知情,自愿加入,并簽署書面知情同意書.

圖1 患者入組流程圖.DILI: 藥物性肝損傷;ALT: 谷丙轉(zhuǎn)氨酶;AST: 谷草轉(zhuǎn)氨酶;TBIL: 總膽紅素;ALP: 堿性磷酸酶;RUCAM: Roussel Uclaf因果關系評價表.

1.2 方法

1.2.1 DILI嚴重程度分級: 參考《藥物性肝損傷診治指南》[5]將DILI嚴重程度分為0-5級,其中1級為輕度患者(輕度組),2級為中度患者(中度組),3級為重度患者(重度組).

1.2.2 檢測方法: DILI患者在治療前、治療后,對照組在入院后清晨采集空腹肘部靜脈血5 mL,應用酶聯(lián)免疫吸附法檢測SF、MCP-1、HMGB1水平,SF試劑盒購于天津潔瑞醫(yī)學生物工程有限公司,MCP-1試劑盒購于上海瑞番生物科技有限公司,HMGB1試劑盒購于深圳市科潤達生物工程有限公司;采用全自動生化分析儀(美國貝克曼DXC800)檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)水平;采用血凝儀檢測凝血酶原時間,計算國際標準化比值(international normalized ratio,INR).

1.2.3 治療方法及轉(zhuǎn)歸: 《藥物性肝損傷診治指南》[5],停用可疑肝損傷藥物,避免再次使用同類藥物,并權衡停藥后對肝損傷加重的風險,根據(jù)DILI的類型選取藥物治療,重癥患者必要時考慮肝移植.本研究中,輕度和中度患者經(jīng)對應治療后,肝功能逐漸恢復正常,重度患者中5例接受肝移植后無病死發(fā)生,肝功能逐漸改善,14例經(jīng)綜合評估后,在患者充分知情前提下,給予藥物治療,肝功能明顯改善.

1.3 觀察指標 (1)比較各組一般資料;(2)比較各組SF、MCP-1、HMGB1水平.(3)分析SF、MCP-1、HMGB1與ALT、AST、TBIL、ALP關系;(4)分析各指標與DILI嚴重程度關系;(5)分析DILI嚴重程度的相關影響因素;(6)各指標及聯(lián)合診斷DILI的價值.

統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù),樣本量的選取依據(jù)多個樣本均數(shù)比較所需樣本含量計算方法,利用SPSS 22.0軟件計算得出,計量資料符合正態(tài)分布的以mean±SD表示,多組間比較以單因素方差分析,兩兩比較以LSD-t檢驗,組間以獨立樣本t檢驗,計數(shù)資料用n(%)表示,行χ2檢驗,應用Pearson分析SF、MCP-1、HMGB1與ALT、AST、TBIL、ALP關系,應用Spearman分析SF、MCP-1、HMGB1與DILI嚴重程度關系,采用多分類Logistic回歸方程分析DILI嚴重程度的相關影響因素,應用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic,ROC)及ROC下面積(area under the curve,AUC)分析SF、MCP-1、HMGB1及聯(lián)合診斷DILI的價值.P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料比較 各組年齡、性別、飲酒史、吸煙史、體質(zhì)量指數(shù)、慢性病史、DILI分型比較,差異無統(tǒng)計學意義;ALT、AST、TBIL、ALP、INR: 重度組＞中度組＞輕度組和非DILI肝病組＞對照組(P＜0.05).見表1.

表1 各組一般資料比較

2.2 各組SF、MCP-1、HMGB1比較 治療前SF、MCP-1、HMGB1: 重度組＞中度組＞輕度組＞非DILI肝病組＞對照組,兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);重度組、中度組、輕度組治療后SF、MCP-1、HMGB1均低于治療前(P＜0.05).見表2.

表2 各組SF、MCP-1、HMGB1比較(mean±SD)

2.3 SF、MCP-1、HMGB1與肝功能指標關系 以DILI患者治療前各指標為源數(shù)據(jù),應用Pearson進行相關性分析,結(jié)果顯示,SF、MCP-1、HMGB1與ALT(r=0.895、0.768、0.863,P均＜0.001)、AST(r=0.804、0.804、0.866,P均＜0.001)、TBIL(r=0.789、0.794、0.752,P均＜0.001)、ALP(r=0.812、0.722、0.834,P均＜0.001)呈正相關(P＜0.05).

2.4 SF、MCP-1、HMGB1與DILI嚴重程度關系 以DILI患者治療前各指標為源數(shù)據(jù),應用Spearman進行相關性分析,結(jié)果顯示,治療前SF(r=0.665,P＜0.001)、MCP-1(r=0.693,P＜0.001)、HMGB1(r=0.728,P＜0.001)與DILI嚴重程度正相關.見圖2.

圖2 SF、MCP-1、HMGB1與DILI嚴重程度關系.SF: 鐵蛋白;MCP-1: 單核細胞趨化蛋白-1;HMGB1: 高遷移率族蛋白-1;DILI: 藥物性肝損傷.

2.5 多分類Logistic回歸方程分析 以DILI嚴重程度為因變量(輕度、中度、重度依次賦值1、2、3),納入各組比較P＜0.05的指標作為自變量(SF、MCP-1、HMGB1低水平賦值1,高水平賦值2),應用多分類Logistic回歸方程分析,結(jié)果顯示,將ALT、AST、TBIL、ALP、INR控制后,治療前SF、MCP-1、HMGB1仍是DILI病情程度的相關影響因素(P＜0.05).見表3.

表3 多分類Logistic回歸方程分析

2.6 SF、MCP-1、HMGB1診斷價值 以DILI患者治療前各指標為陽性樣本,以對照組為陰性樣本,繪制各指標的ROC曲線,并應用Logistic二元回歸擬合構建各指標聯(lián)合的ROC診斷模型,結(jié)果顯示,治療前SF、MCP-1聯(lián)合HMGB1診斷DILI及鑒別重度DILI的AUC最大,見圖3和4、表4.

表4 ROC分析結(jié)果

圖3 SF、MCP-1、HMGB1診斷DILI價值.SF: 鐵蛋白;MCP-1: 單核細胞趨化蛋白-1;HMGB1: 高遷移率族蛋白-1;DILI: 藥物性肝損傷.

3 討論

ALT、AST、TBIL、ALP是傳統(tǒng)肝功能指標,發(fā)生肝損傷時,其活性可明顯升高,因此被視為診斷DILI的常用參考指標.但由于ALT、AST、TBIL、ALP亦可能在進行性肌營養(yǎng)不良、心肌梗死等疾病中升高,并易受飲食、睡眠等因素影響,導致診斷特異性不足,臨床應用受限,所以研究新的診斷標志物是必要的[6].本研究顯示,SF、MCP-1、HMGB1與ALT、AST、TBIL、ALP呈正相關,表明SF、MCP-1、HMGB1與傳統(tǒng)肝功能指標變化趨勢一致,可能在評估DILI中的具有一定實際.

其中SF是機體儲存鐵的一種形式,常由肝細胞合成,之后儲存于肝實質(zhì)細胞的胞漿中,生理狀態(tài)下,血清中含量較少.既往研究顯示[7,8],鐵過載是肝移植患者肝臟缺血再灌注損傷的相關危險因素,并能區(qū)分肺炎患者是否發(fā)生肝損傷.本研究顯示,DILI患者SF較健康體檢者升高,且隨著DILI嚴重程度加重,逐漸升高,與劉萍萍等[9]報道相似,證實SF與DILI的發(fā)生及嚴重程度有關.DILI患者存在肝細胞炎性反應,激活巨噬細胞后,增加了SF合成,且肝細胞碎屑性壞死、變性壞死等,可使胞漿中SF釋放入血,從而引起外周血SF水平升高.當SF＞169.21 μg/L,診斷SF的AUC為0.870,敏感度為80.43%,特異度為88.57%,呈現(xiàn)出較高的診斷效能,能為臨床診斷DILI提供客觀參考依據(jù).由于DILI患者SF越高,病情程度越嚴重,故臨床應加強對高水平患者病情評估、監(jiān)測及干預,避免發(fā)生急性肝衰竭、死亡,以改善患者預后.

MCP-1是一種趨化因子,由內(nèi)皮細胞、成骨細胞、平滑肌細胞等分泌,可作用于單核細胞和巨噬細胞[10,11].本研究顯示,與健康體檢人群相比,DILI患者MCP-1較高,提示MCP-1與DILI有關,且MCP-1越高,DILI越嚴重.Li等[12]報道,肝細胞損傷時,MCP-1水平升高,且MCP-1可介導炎癥反應的擴大,采用一定措施抑制MCP-1合成和釋放,則能減輕急性肝衰竭病情.敲除MCP-1趨化性細胞因子受體2后,可保護肝細胞免受氧化應激、炎癥反應的損傷[13].佐證了MCP-1在肝損傷中所起的作用.MCP-1結(jié)合趨化性細胞因子受體2后,具有吸附單核細胞移動的功能,并能調(diào)控血管內(nèi)皮細胞黏附分子表達,使激活的單核/巨噬細胞在肝損傷部位聚集,引起肝細胞的炎癥損傷,MCP-1水平越高,肝炎性損傷越嚴重,因此與DILI患者病情程度有關[14].當MCP-1＞246.82 pg/mL時,診斷DILI的AUC為0.803,敏感度為59.78%,97.14%,呈現(xiàn)出一定診斷價值,可為臨床提供參考信息.

圖4 SF、MCP-1、HMGB1鑒別不同病情DILI價值.SF: 鐵蛋白;MCP-1: 單核細胞趨化蛋白-1;HMGB1: 高遷移率族蛋白-1;DILI: 藥物性肝損傷.

HMGB1廣泛存在于細胞質(zhì)、細胞外、細胞核,不同位置發(fā)揮不同的生物學功能,在細胞壞死時可被動釋放至外周循環(huán),免疫細胞活化時可主動分泌至外周循環(huán),因此外周血中HMGB1是細胞炎癥和壞死的指標[15].本研究顯示,DILI患者HMGB1高于對照組,且HMGB1與DILI嚴重程度呈正相關,表明HMGB1有助于DILI的診斷和病情程度的評估.Starkey Lewis等[16]研究顯示,乙酰氨基酚用藥過量后,可導致急性肝損傷,并伴有HMGB1水平的升高,本研究觀點與之相似.HMGB1參與DILI的機制可能有: (1)HMGB1能趨化中性粒細胞向炎癥部位的聚集,擴大炎性反應,介導肝細胞的損害、凋亡;(2)HMGB1肽鏈上包含3個對氧化還原反應敏感的半胱氨酸殘基,可介導氧化反應,引起肝細胞的氧化應激損傷[17,18].當HMGB1＞3.83 ng/mL,診斷DILI的AUC為0.859,敏感度為72.83%,特異度為88.57%,能為臨床診斷提供量化的數(shù)據(jù)參考.

另SF、MCP-1聯(lián)合HMGB1診斷DILI的AUC最大,故建議臨床聯(lián)合檢測三者對DILI進行診斷,以提高診斷準確性.其原因可能是,SF、MCP-1聯(lián)合HMGB1涵蓋了DILI發(fā)生的更多機制,所以聯(lián)合應用時診斷價值更高.同時三者聯(lián)合鑒別重度DILI的AUC亦最大,提示聯(lián)合檢測三者能提高對重度DILI的鑒別價值,從而為臨床診治提供可靠的參考.本研究不足之處在于,DILI包括肝細胞型、膽汁淤積型、混合型,不同類型的DILI患者,三個指標間有無差異本研究未進行統(tǒng)計分析尚不明確,亦需后續(xù)進行分類比較進行證實.

4 結(jié)論

綜上,外周血SF、MCP-1、HMGB1與DILI及其嚴重程度有關,在DILI診斷及病情評估呈現(xiàn)出較高應用價值,可作為診斷和評估DILI病情程度的生物標志物,為臨床提供參考信息.

文章亮點

實驗背景

現(xiàn)階段全球上市藥物中有＞1100種藥物具有潛在肝毒性,使藥物性肝損傷(drug-induced liver injury,DILI)的病因、機制、診斷和治療在全球越來越受到重視,但由于其誘因較多,發(fā)病機制復雜等,導致臨床快速診斷困難.

實驗動機

當前DILI仍無特效治療手段,并缺乏客觀、特異、便捷的診斷指標和病情標志物,本研究旨在為DILI的初步篩查診斷和病情評估提供一種便捷方法,為臨床診治DILI提供客觀參考依據(jù).

實驗目標

本研究主要探討血清鐵蛋白(serum ferritin,SF)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、高遷移率族蛋白-1(high mobility group protein-1,HMGB1)與DILI嚴重程度的關系及三者聯(lián)合應用的診斷價值,為DLILI初步的無創(chuàng)篩查診斷和肝損傷程度的快速評估提供參考.

實驗方法

本研究采用前瞻性研究方法,可減少數(shù)據(jù)的偏倚,并運用皮爾森(Pearson)/斯皮爾曼(Spearman)進行相關性分析,說明SF、MCP-1、HMGB1與病情程度關系,同時多分類Logistic回歸方程能闡明SF、MCP-1、HMGB1對DILI嚴重程度的獨立影響效應和標志物的潛質(zhì),且本研究首次采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic,ROC)分析獲取的各診斷參數(shù)能為臨床提供量化的診斷參考.

實驗結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)SF、MCP-1、HMGB1在DILI中表達明顯異常,并隨著DILI嚴重程度加重逐漸遞增,校正了各混雜因素后,三者仍是DILI病情程度的相關影響因素,可作為診斷及病情評估的指標.

實驗結(jié)論

DILI的快速、無創(chuàng)、準確診斷迄今仍是消化內(nèi)科的難點和棘手問題,本研究創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)了外周血SF、MCP-1、HMGB1可作為DILI的生物標志物,在DILI的診斷與病情評估中呈現(xiàn)出巨大的潛在應用前景.

展望前景

本研究設置非DILI肝病組和健康人群作為對照,通過龐大的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,體現(xiàn)SF、MCP-1、HMGB1在DILI中的敏感性和特異性,但納入樣本量較少,下一步仍需積累更多的病例,進行進一步的驗證.