吳 南，李國壯，吳志宏，仉建國，邱貴興

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院 1骨科 2骨骼畸形遺傳學(xué)研究北京市重點實驗室 3脊柱畸形大數(shù)據(jù)研究與應(yīng)用重點實驗室 4疑難重癥及罕見病國家重點實驗室 5醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心，北京 100730

先天性脊柱側(cè)凸(congenital scoliosis，CS)是起因于胚胎期脊柱發(fā)育異常的先天性脊柱畸形，具有進(jìn)展快、畸形重、并發(fā)癥多等特點，如未得到及時診斷和治療，隨著年齡增長及身體發(fā)育，畸形逐漸加重，將影響患者的心肺功能。脊柱畸形的加重也可造成神經(jīng)功能損害，患者出現(xiàn)雙下肢感覺及運(yùn)動功能異常，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量及壽命。CS患者常合并椎管內(nèi)畸形、先天性心臟病、泌尿系統(tǒng)及消化道畸形等多種先天發(fā)育障礙[1]，手術(shù)治療極為困難，且嚴(yán)重畸形可能需要多次矯形手術(shù)，給患者及家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理壓力[2]。

2018年，國家衛(wèi)生健康委員會、科技部、工業(yè)和信息化部、國家藥品監(jiān)督管理局、國家中醫(yī)藥管理局等五部門聯(lián)合發(fā)布了《第一批罕見病》目錄，共涉及121種疾病，CS即包含其中[3]。2021年，國務(wù)院辦公廳在《國家殘疾預(yù)防行動計劃(2021—2025年)》中明確聚焦骨骼肌肉等先天性結(jié)構(gòu)畸形，開展篩查診治等工作，促進(jìn)早發(fā)現(xiàn)早治療，減少先天性骨骼畸形所致的殘疾。2022年，全國衛(wèi)生健康工作會議提出深入推進(jìn)健康中國行動，推進(jìn)脊柱側(cè)彎監(jiān)測等學(xué)校健康工作，教育部也在答復(fù)政協(xié)提案的函中表示將脊柱彎曲異常納入學(xué)生常見病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)。但是，目前對于CS的篩查方式匱乏，針對病因的治療尚無良策。因缺乏早期預(yù)測手段，患者多在出現(xiàn)外觀畸形時才被發(fā)現(xiàn)，治療方法僅能以保守性的支具或創(chuàng)傷性的手術(shù)控制病情發(fā)展。因此，探索CS早期的診斷方法和有效的病因?qū)W干預(yù)靶點是當(dāng)前國際研究的熱點。

近10年來，北京協(xié)和骨科團(tuán)隊相繼牽頭建立了“系統(tǒng)解析脊柱畸形及相關(guān)合并癥”(Deciphering disorders Involving Scoliosis and COmorbidities，DISCO，http://discostudy.org/)研究協(xié)作組，構(gòu)建了我國首個國際領(lǐng)先的骨骼畸形遺傳研究體系，發(fā)現(xiàn)并論證了TBX6基因無效變異聯(lián)合常見亞效等位基因共同導(dǎo)致CS，首次定義了一種全新的CS疾病亞型——TBX6相關(guān)先天性脊柱側(cè)凸(TBX6-associated congenital scoliosis，TACS)，搭建了TACScore預(yù)測系統(tǒng)以評估臨床TACS的患病風(fēng)險，建立了TACS基因劑量模型。該模型獲得了世界廣泛認(rèn)可，被命名為“中國模型”，為學(xué)界深入理解CS的分子機(jī)制提供了重要依據(jù)。同時，我國首個骨骼畸形遺傳門診在北京協(xié)和醫(yī)院建立，實現(xiàn)了研究成果的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

1 一種古老而又年輕的疾病——CS

CS是指由胚胎期脊柱發(fā)育異常引起的先天性脊柱畸形，根據(jù)其椎體發(fā)育異常情況，可分為形成障礙型(CS Ⅰ型)、分節(jié)不良型(CSⅡ型)及混合型(CSⅢ型)三種[4]。CS在新生兒中的發(fā)病率約為(0.5～1)/1000[5]。在臨床上，CS指因椎體結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致脊柱Cobb角>10°，大體表現(xiàn)為直立時兩肩不等高、胸廓不對稱，出現(xiàn)一側(cè)腰部皺褶皮紋、向前彎腰出現(xiàn)兩側(cè)背部不對稱(“剃刀背”)，有時可見兩側(cè)骨盆不對稱等。此外，CS還可伴發(fā)其他系統(tǒng)缺陷，如椎管內(nèi)畸形、先天性心臟病以及先天性腎輸尿管發(fā)育異常等。

CS具有進(jìn)展快、畸形重、并發(fā)癥多等特點，部分患者可進(jìn)展為嚴(yán)重的脊柱側(cè)凸或后凸畸形，造成神經(jīng)功能損害甚至癱瘓。此外，有的患者可并發(fā)胸廓發(fā)育異常，嚴(yán)重影響心肺功能，甚至導(dǎo)致心肺功能衰竭而死亡。CS患者通常年齡較小，心肺功能差，手術(shù)風(fēng)險高，有時需多次手術(shù)矯形，給患者及家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，成為嚴(yán)重影響我國國民尤其是兒童和青少年健康的重大疾病。

CS是一種古老而又年輕的疾病。說其古老是因為早在1885年出版的BodilyDeformitiesandTheirTreatment一書中即有關(guān)于CS的詳細(xì)描述，作者根據(jù)其臨床觀察推測CS的成因為佝僂病所致的椎體結(jié)構(gòu)缺陷，骨骼形態(tài)異?；蛱簩m內(nèi)位置異常等[6]；截至目前使用最廣泛的CS分型仍為Winter等[4]于1968年根據(jù)椎體形態(tài)異常提出的分型。說其年輕是因為CS病因復(fù)雜，國內(nèi)外對其病因?qū)W的認(rèn)識直至近年才有所突破。

近些年，隨著基因分析技術(shù)的不斷成熟和成本大幅下降，對CS的分子遺傳學(xué)研究愈發(fā)深入，其中以單基因遺傳模型的研究成果最為顯著。大規(guī)?；蚪M分析技術(shù)的臨床應(yīng)用，使研究人員得以運(yùn)用先進(jìn)的遺傳學(xué)分析方法，系統(tǒng)解析CS單基因致病因素，探索CS的致病機(jī)制，提高其分子診斷率。

2 TBX6基因在脊柱發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用

脊柱發(fā)育起源于中胚層，依據(jù)其位置和未來將發(fā)育成的結(jié)構(gòu)，將中胚層自脊索向兩側(cè)分為軸旁中胚層、間質(zhì)中胚層和側(cè)板中胚層。軸旁中胚層將分化為節(jié)段性結(jié)構(gòu)，稱為體節(jié)，此過程稱為體節(jié)發(fā)生。體節(jié)是脊柱發(fā)育的前體，可進(jìn)一步分化為生骨節(jié)和生皮肌節(jié)。每側(cè)體節(jié)腹內(nèi)側(cè)面分出的生骨節(jié)細(xì)胞逐漸移向胚胎中線的脊索周圍，圍繞神經(jīng)管和脊索形成脊柱。起初生骨節(jié)組織的節(jié)段包繞脊索與體節(jié)對應(yīng)，當(dāng)進(jìn)一步發(fā)育時，每個生骨節(jié)的尾端部分變致密，并與下位生骨節(jié)的頭端連接起來，形成新的節(jié)段稱椎骨原基，即后來的椎體。椎體形成后不久，在其背面伸出密集的間充質(zhì)，形成神經(jīng)弓，包圍脊髓。腹面形成肋突，肋突在胸椎形成肋骨，在頸椎、腰椎與橫突相合。椎骨原基形成軟骨，而后骨化為椎體。

脊柱的分節(jié)及包繞神經(jīng)管是一個復(fù)雜的演化發(fā)育過程，在發(fā)育過程中干擾軸旁中胚層、體節(jié)或軸骨的發(fā)生均可導(dǎo)致脊椎的發(fā)育缺陷，形成半椎、楔椎、蝴蝶椎、融合椎、移行椎等先天性骨性畸形，從而導(dǎo)致CS。體節(jié)發(fā)生過程主要受到WNT、FGF和Notch信號通路的調(diào)節(jié)，接受最為廣泛的體節(jié)發(fā)生模型為時鐘波前模型，于1976年由Cooke等[7]首次提出。Pourquie[8]進(jìn)一步驗證了分節(jié)時鐘的存在，識別出Notch信號通路在體節(jié)形成中發(fā)揮重要作用。循環(huán)基因的表達(dá)具有周期性，在形成一個體節(jié)的過程中通過前體節(jié)中胚層(presomitic mesoderm，PSM)形成一個表達(dá)波。Notch信號通路對于相鄰節(jié)段混雜的PSM細(xì)胞的分離和體節(jié)內(nèi)前后方向的形成至關(guān)重要[9]。在時鐘波前模型中，PSM在Notch信號通路的作用下逐漸分割為重復(fù)的體節(jié)。分節(jié)時鐘和波前由一系列相關(guān)基因和信號通路產(chǎn)物組成。參與Notch信號通路調(diào)節(jié)過程的TBX6基因在體節(jié)發(fā)生過程中起重要作用。

TBX6基因是脊柱發(fā)育過程中的重要基因，被稱為T-box 6，是T-box家族的一員。TBX6基因定位于16號染色體短臂1區(qū)1帶2亞帶，大小為6095 bp，包含9個外顯子。對于TBX6的研究主要是通過研究位于小鼠基因組的第7號染色體的同源基因Tbx6進(jìn)行[10]。Tbx6編碼一條長1.9 kb的轉(zhuǎn)錄因子，首先在小鼠原腸胚階段中的早期原條和新招募的近軸中胚層表達(dá)，發(fā)育后期Tbx6的表達(dá)僅限于前體節(jié)、近軸中胚層和尾芽。Tbx6在尾芽的表達(dá)一直持續(xù)至受精后12.5 d，在受精后13.5 d停止。因此，Tbx6的表達(dá)在原條、尾芽和PSM的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。另外，Tbx6突變影響了軸旁中胚層的分化[11]。TBX6與時鐘波前模型相關(guān)基因或TBX6本身的相互作用可導(dǎo)致體節(jié)發(fā)育異常，從而導(dǎo)致CS[12-13]。

3 發(fā)現(xiàn)CS重要致病模型并實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用

北京協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊基于牽頭建立的多中心、多人種DISCO國際協(xié)作組，運(yùn)用自主研發(fā)的隊列基因數(shù)據(jù)分析體系(Peking Union Medical college hospital Pipeline，PUMP)，領(lǐng)導(dǎo)了多項世界多中心、多人種研究。運(yùn)用多種先進(jìn)的遺傳學(xué)分析方法，結(jié)合體內(nèi)體外功能實驗，闡釋了TBX6復(fù)合變異導(dǎo)致CS的致病機(jī)制及特點，定義了一種全新的CS亞型——TACS，提出并推動TACS的“中國模型”走向世界舞臺。

3.1 構(gòu)建我國首個國際領(lǐng)先的骨骼畸形遺傳研究體系

依托骨骼畸形遺傳學(xué)研究北京市重點實驗室及中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院脊柱畸形大數(shù)據(jù)研究與應(yīng)用重點實驗室等平臺，北京協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊牽頭建立DISCO國際協(xié)作組，與世界范圍內(nèi)各研究組開展廣泛合作，建立CS遺傳咨詢與研究體系。通過主持多項世界多中心、多人種骨骼畸形及相關(guān)疾病隊列研究，開發(fā)了國際領(lǐng)先的疾病隊列基因組分析體系PUMP，搭建了從樣本采集、數(shù)據(jù)解讀到臨床轉(zhuǎn)化的全鏈條平臺。基于PUMP，針對骨骼畸形發(fā)生的不同生物學(xué)過程進(jìn)行多維度探索，進(jìn)一步解析CS及骨骼同源胚層疾病的遺傳病因。

3.2 發(fā)現(xiàn)并論證TBX6基因無效變異聯(lián)合常見亞效等位基因共同導(dǎo)致CS

早在2010年，北京協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊首次報道了CS患者中TBX6基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，提示TBX6基因的遺傳變異與CS發(fā)病相關(guān)，并可能在中國漢族人群CS的易感性中發(fā)揮重要作用[14]。國際上亦有一些文獻(xiàn)報道TBX6基因變異可能與脊柱畸形相關(guān)[15-16]。北京協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊進(jìn)一步聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)團(tuán)隊率先完成CS全基因組拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)分析，發(fā)現(xiàn)高達(dá)10%的病例16p11.2區(qū)域存在大片段缺失型CNV，并將這一區(qū)域的TBX6基因確定為致病基因，這是迄今發(fā)現(xiàn)的對CS貢獻(xiàn)最大的單個致病位點。此外，在家系樣本中觀察到“不完全外顯”現(xiàn)象，提示TBX6基因的罕見CNV本身不足以導(dǎo)致CS，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)TBX6的罕見變異通常需要聯(lián)合一個常見的亞效SNP共同致病，該研究是目前對CS遺傳病因最重要的詮釋，為CS提供了最大宗的病因?qū)W證據(jù)[17]，也開啟了學(xué)界對同一基因中常見變異聯(lián)合罕見突變共同致病這一全新遺傳機(jī)理的認(rèn)識，即對疾病遺傳學(xué)研究中占主導(dǎo)地位的“常見變異致常見疾病”傳統(tǒng)模型進(jìn)行了理論延伸，也對疾病遺傳學(xué)研究中漸行漸熱的“罕見變異致常見疾病”模型進(jìn)行了實例論證，闡釋常見變異可與罕見突變共同作用導(dǎo)致疾病發(fā)生的遺傳機(jī)理，為人類遺傳學(xué)研究和研究成果的臨床應(yīng)用提供了全新思路。

3.3 首次定義一種全新的CS疾病亞型——TACS

為進(jìn)一步闡明具有臨床指導(dǎo)意義的CS表型，北京協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊牽頭收集了世界多中心、多人種的CS疾病隊列，通過對TBX6基因變異及其上游區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)TBX6變異導(dǎo)致的CS均表現(xiàn)為半椎體或蝴蝶椎，且多集中于脊柱下段受累。通過基因型-表型關(guān)聯(lián)分析，首次定義了一種全新的CS疾病亞型——TACS，并成功建立了TACScore預(yù)測系統(tǒng)以評估TACS的患病風(fēng)險[18]。在此基礎(chǔ)上，團(tuán)隊將開發(fā)的TACS分子診斷及臨床風(fēng)險評估模型融入到臨床診療流程，實現(xiàn)了針對TACS的精準(zhǔn)預(yù)測，其研究成果先后得到了法國[19]、日本[20-21]、意大利[22]和中國香港[23]4個研究組分別在歐洲、日本和中國南方人群隊列的獨立重復(fù)。

為進(jìn)一步解析TACS的發(fā)病機(jī)制，團(tuán)隊?wèi)?yīng)用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了Tbx6無義和亞效等位基因小鼠，成功建立了TBX6劑量梯度模型與CS表型之間的確切關(guān)系，并在小鼠模型中再現(xiàn)了人類TBX6無效變異聯(lián)合亞效等位基因的遺傳模型，發(fā)現(xiàn)Tbx6基因編輯的小鼠模型與TACS患者表型完全一致[24]。Tbx6基因敲除小鼠模型成功模擬了人類TBX6基因變異導(dǎo)致的CS表型，為研究TBX6基因在人類CS致病機(jī)理方面提供了有效的動物模型。

由TBX6基因復(fù)合雜合突變所致的TACS為主要累及胸腰段的半椎體或蝴蝶椎等單純先天性脊柱畸形，屬于TACS Ⅰ型。但仍有部分TACS患者的臨床表型更嚴(yán)重，在延續(xù)性工作中，團(tuán)隊通過分析525例中國及美國的多人種數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)并驗證了11個與CS相關(guān)的罕見突變，其中包括6個新的TBX6致病突變位點，擴(kuò)展了TBX6基因的致病譜，建立了TACS的基因劑量模型，依據(jù)更加嚴(yán)重的表型對應(yīng)更大劑量的基因缺失的現(xiàn)象，團(tuán)隊提出了TACS Ⅱ型的概念，豐富了CS的分子分型[25]。上述研究成果得到了國內(nèi)外同行的廣泛認(rèn)可，并將發(fā)現(xiàn)的全新TBX6致病遺傳模型命名為“中國模型”。

3.4 將研究成果實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化

為促進(jìn)研究成果的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用，北京協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊將前期建立的TACScore模型應(yīng)用于臨床工作，通過成本-效益分析，發(fā)現(xiàn)TACScore相較于全外顯子組測序，平均可為每例TACS患者節(jié)省臨床成本約3000元，將診斷速度提高13.6 d，從而改善患者的預(yù)后[26]。

臨床解讀二代測序數(shù)據(jù)流程繁復(fù)，遺傳學(xué)家需解讀近千個致病基因的變異位點方能找到可能的致病基因。為進(jìn)一步提高骨骼畸形臨床遺傳咨詢數(shù)據(jù)分析的速度，團(tuán)隊運(yùn)用人工智能技術(shù)，開發(fā)了基于表型的致病基因預(yù)測模型PhenoApt[27]。該預(yù)測模型是團(tuán)隊自主研發(fā)的、基于人工智能算法的基因解讀工具，填補(bǔ)了國內(nèi)該領(lǐng)域的空白。

在北京協(xié)和醫(yī)院的支持下，骨科團(tuán)隊開設(shè)了我國首個骨骼畸形遺傳門診，美國、日本等世界各地權(quán)威學(xué)者前來訪問并給予高度評價。團(tuán)隊參與組織北京協(xié)和醫(yī)院多學(xué)科會診百余次，運(yùn)用分子診斷方法指導(dǎo)制訂診療計劃數(shù)十次，并積極探索基于骨骼畸形病因?qū)W診斷的新診療方案，如制訂個性化手術(shù)方案、用藥方案及干預(yù)方案等，以改善患者預(yù)后，降低患者醫(yī)療負(fù)擔(dān)，真正實現(xiàn)了精準(zhǔn)醫(yī)療的閉環(huán)。

4 小結(jié)與展望

北京協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊圍繞“解析CS及同源胚層疾病遺傳病因”為研究主線，建立多中心、多人種DISCO國際研究協(xié)作組，形成國際領(lǐng)先的疾病隊列遺傳數(shù)據(jù)分析體系PUMP，開設(shè)我國首個骨骼畸形遺傳門診。從揭示致病基因、探索致病機(jī)制、成果臨床轉(zhuǎn)化三個方面開展延續(xù)性工作，構(gòu)建我國首個國際領(lǐng)先的骨骼畸形遺傳研究體系，揭示了骨骼畸形及相關(guān)疾病的重要遺傳病因；首次發(fā)現(xiàn)TBX6變異是CS最重要的致病基因，提出TACS這一新的分子亞型，獲得世界廣泛認(rèn)可；切實提升了我國骨科尤其是脊柱畸形遺傳學(xué)研究的整體水平和國際地位。

未來，團(tuán)隊將繼續(xù)以臨床需求為導(dǎo)向，把握高通量測序技術(shù)所產(chǎn)生的大數(shù)據(jù)機(jī)遇，聚焦CS這一嚴(yán)重影響我國國民尤其是兒童和青少年健康的重大疾病，基于人工智能及大數(shù)據(jù)分析方式，尋找CS及同源胚層疾病新的遺傳病因和機(jī)制，完善CS的分子分型，實現(xiàn)對CS患者的早篩早診早治，推進(jìn)致病基因篩查的研究和應(yīng)用，探索建立疾病預(yù)防干預(yù)技術(shù)體系，開發(fā)并完善相關(guān)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)。

作者貢獻(xiàn)：吳南負(fù)責(zé)論文構(gòu)思與寫作；李國壯負(fù)責(zé)論文初稿撰寫；吳志宏、仉建國、邱貴興負(fù)責(zé)論文構(gòu)思及審校。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突