楊奉源，范譯心，鄧文卓，杜曉陽，李 鈾,2*

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030）

麻蜥屬（ Eremias ）作為蜥蜴目（Lacertiformes）蜥蜴科（Lacertian）的一屬，全世界有30余個(gè)物種，廣泛分布于非洲、歐洲以及亞洲中西部的溫帶和暖溫帶。在中國(guó)有麗斑麻蜥（Eremias argus）、山地麻蜥（Eremias brenchleyi）、敏麻蜥（Eremias arguta）、密點(diǎn)麻蜥（Eremias multiocellata）、荒漠麻蜥（Eremias przewalskii）、快步麻蜥（Eremias velox）、網(wǎng)紋麻蜥（Eremias grammica）和蟲紋麻蜥（Eremias vermiculata）8個(gè)物種，主要分布于秦嶺-淮河一線以北[1]。麻蜥是典型的草原和荒漠動(dòng)物，其生存環(huán)境揭示了重要生態(tài)屏障的諸多特點(diǎn)，可作為評(píng)估生態(tài)環(huán)境的重要參考因素[2]。麗斑麻蜥和山地麻蜥等物種還具有顯著藥用價(jià)值[3]。由于自然環(huán)境的不斷變化，麻蜥屬的生存環(huán)境也發(fā)生了較大改變，密點(diǎn)麻蜥被列入《國(guó)家保護(hù)的有益的或者有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究?jī)r(jià)值的陸生野生動(dòng)物名錄》《世界自然保護(hù)聯(lián)盟2013年瀕危物種紅色名錄》，可見對(duì)其進(jìn)行保護(hù)與深入研究迫在眉睫。

遺傳多樣性是指存在于生物個(gè)體內(nèi)、單個(gè)物種內(nèi)以及物種之間的基因多樣性，是一定時(shí)空范圍內(nèi)生物遺傳變異的結(jié)果，其研究多從染色體、蛋白質(zhì)和核酸3個(gè)層面應(yīng)用多種技術(shù)分析生物遺傳物質(zhì)的變化情況。對(duì)于某一特定物種而言，其地理分布、生活環(huán)境、食性以及生存地域優(yōu)勢(shì)物種的不同，作為外界環(huán)境因素都會(huì)影響物種的遺傳多樣性。本文對(duì)麻蜥屬蜥蜴的遺傳多樣性進(jìn)行了相關(guān)研究。

1 研究現(xiàn)狀

麻蜥由于分布范圍廣，生存環(huán)境差異顯著，種間存在遺傳信息交互，提升了遺傳多樣性。有研究基于13個(gè)蛋白編碼基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果顯示，整個(gè)麻蜥屬是一個(gè)單系群，荒漠麻蜥和密點(diǎn)麻蜥遺傳距離較近，與麗斑麻蜥和山地麻蜥分聚成一個(gè)并系群，敏麻蜥、快步麻蜥、網(wǎng)紋麻蜥和蟲紋麻蜥與該并系群的親密度逐層遞減。劉金龍等[4]通過2種分子標(biāo)記研究亞洲中部干旱區(qū)快步麻蜥的系統(tǒng)地理學(xué)分布，結(jié)果顯示快步麻蜥在山脈隆升、冰期循環(huán)等環(huán)境因素的影響下逐漸形成多個(gè)分支。陳紹勇等[5]在對(duì)麗斑麻蜥地理種群繁殖特征的研究中提出，運(yùn)動(dòng)能力、躲避天敵能力、繁殖能力等因素在長(zhǎng)期自然選擇的作用下能改變其性狀。可見麻蜥屬遺傳多樣性的成因多見于物種遷徙、環(huán)境因素變化及自然選擇等方面，而多樣的研究方法為揭示其內(nèi)在聯(lián)系提供了可靠手段。

2 研究方法

2.1 核型分析

2.1.1內(nèi)容 核型即染色體核型，通過判斷核型的共同特征，如公式、染色體相對(duì)長(zhǎng)度、位置等，比較染色體的數(shù)量、形態(tài)，進(jìn)而判斷其發(fā)生演化的程度，并推測(cè)產(chǎn)生差異的原因[6]。

2.1.2方法 選取樣本動(dòng)物正常分裂細(xì)胞組織直接制片，對(duì)于不同麻蜥樣本分別觀察50～100個(gè)分裂相，并在其中選取5～10個(gè)較清晰的，利用秋水仙素處理使其停留在分裂中期[7]，顯微鏡下觀察染色體的數(shù)量及形態(tài)特征，并進(jìn)行比對(duì)完成核型分析。

萬宏富等[8]采用常規(guī)骨髓細(xì)胞制片法對(duì)甘肅民勤縣的荒漠麻蜥的染色體進(jìn)行核型分析，通過核型演化情況進(jìn)一步闡明了荒漠麻蜥的系統(tǒng)學(xué)地位；戴鑫等[9]以大腿骨髓細(xì)胞為原料研究6種麻蜥的核型差異，并基于著絲粒、二倍體數(shù)、銀帶核型等參考因素的不同，分別討論了6種麻蜥物種的分化情況。

2.1.3特點(diǎn) 對(duì)于存在明顯遺傳差異的個(gè)體可通過核型分析簡(jiǎn)單而高效地辨明，且在演化過程中目標(biāo)物種是否經(jīng)歷過三倍體的形成并導(dǎo)致后續(xù)生殖隔離的出現(xiàn)，核型分析是一種較為直觀的檢測(cè)手段。由于核型分析僅通過光學(xué)顯微鏡觀察染色體的形態(tài)學(xué)特征，因此對(duì)于遺傳差異較小的變化監(jiān)測(cè)還尚存困難，對(duì)于遺傳差異的成因還缺乏更深層面的理論解釋。

2.2 線粒體基因分析

2.2.1內(nèi)容 線粒體DNA（mtDNA）是動(dòng)物體內(nèi)唯一長(zhǎng)期、穩(wěn)定存在的核外基因組，與核糖體DNA相比其分子質(zhì)量較小、呈環(huán)形，且為單倍體，在世代間沒有基因重組，呈嚴(yán)格母系遺傳，廣泛用于動(dòng)物起源進(jìn)化、物種鑒定、疾病診斷、衰老及動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀的核外基因效應(yīng)研究。

2.2.2方法 對(duì)線粒體基因組各片段相對(duì)應(yīng)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得產(chǎn)物送樣測(cè)序，由于線粒體基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，故對(duì)于測(cè)序結(jié)果的篩選校對(duì)后排除錯(cuò)誤或重復(fù)的堿基序列，能實(shí)現(xiàn)對(duì)該物種mtDNA基因組全序列的測(cè)序。對(duì)測(cè)定的麻蜥種屬線粒體基因組的進(jìn)一步分析，可參考Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)的麻蜥mtDNA序列。可通過MEGA軟件確定線粒體的結(jié)構(gòu)和堿基含量。通過整合不同種麻蜥的mtDNA基因組，可根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，應(yīng)用極大似然法、貝葉斯法或主成分分析法等建立系統(tǒng)進(jìn)化樹[10]。

郭憲光等[11]基于線粒體16SrRNA基因序列研究麻蜥屬部分物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并利用貝葉斯算法估計(jì)種間分化情況；蘇珊[12]對(duì)2種麻蜥的線粒體中性標(biāo)記（COI、Cytb）進(jìn)行差異比較，了解各物種在不同地區(qū)的種群遺傳結(jié)構(gòu)以及基因流水平，發(fā)現(xiàn)麻蜥種群間的形態(tài)分化以及代謝率與環(huán)境相關(guān)；鐘文等[13]對(duì)新疆地區(qū)5個(gè)不同地域的密點(diǎn)麻蜥線粒體DNA采用多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)了荒漠麻蜥、山地麻蜥與密點(diǎn)麻蜥的親緣關(guān)系，更進(jìn)一步明晰了該地區(qū)麻蜥的遺傳進(jìn)化情況。

2.2.3特點(diǎn) 以線粒體基因作為分子標(biāo)記研究麻蜥種屬的進(jìn)化關(guān)系能夠從基因?qū)用孢M(jìn)一步揭示各種屬的遺傳差異，進(jìn)而反饋區(qū)分研究物種的祖先與后代、同系分支等差異。MEGA軟件分析線粒體的結(jié)構(gòu)組成，能體現(xiàn)單一物種線粒體基因組特征、起始密碼子與終止密碼子的差異。對(duì)于其中的tRNA基因，也可以反映出其經(jīng)典二級(jí)結(jié)構(gòu)。以此為基礎(chǔ)可進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，通常應(yīng)用極大似然法、最大簡(jiǎn)約法、貝葉斯法和距離法，能夠準(zhǔn)確直觀反映出麻蜥屬的遺傳距離和關(guān)系，可結(jié)合環(huán)境因素判斷種群的遷移情況與親緣關(guān)系。

2.3 微衛(wèi)星分子標(biāo)記

2.3.1內(nèi)容 微衛(wèi)星DNA又叫簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat,SSR），是一類由1～6個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)排列的DNA序列，在原核生物和真核生物基因組分布廣泛且呈現(xiàn)出較高的多態(tài)性水平，因而被開發(fā)成分子標(biāo)記并得到廣泛應(yīng)用。對(duì)中性分子標(biāo)記而言，多態(tài)性水平通常與突變率呈正相關(guān)。

2.3.2方法 取物種的組織提取基因組DNA，并選取特異性引物采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物做等位基因分型。在SSR的多態(tài)性分析中，常結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，通過研究其等位基因頻率、雜合度、遺傳平衡等說明物種變異程度的高低。由于物種存在遷移，因此種間基因可能發(fā)生流通，從而推動(dòng)物種的進(jìn)化過程。為了進(jìn)一步研究物種遺傳進(jìn)化規(guī)律，探明種群遷移帶來的影響，可結(jié)合基因流分析更深入地研究不同種間的進(jìn)化關(guān)系。

趙丹等[14]通過擴(kuò)增胎生蜥蜴組織提取的微衛(wèi)星DNA，利用Quantity One軟件分析親代與子代等位基因的差異，并用Gervus計(jì)算多態(tài)性信息含量，用于研究遺傳多樣性。趙丹等[15]發(fā)現(xiàn)目前GenBank公布我國(guó)已針對(duì)15種蜥蜴開發(fā)出278個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、尼龍膜富集法、AFLP富集法、基因組文庫(kù)法等可用于微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)，并將結(jié)果應(yīng)用于遺傳學(xué)分析、親權(quán)情況、種群結(jié)構(gòu)分析等方面。

2.3.3特點(diǎn)SSR在生物體內(nèi)分布廣泛，因此帶來較高的多態(tài)性，適用于研究遷徙頻繁、生活環(huán)境復(fù)雜、分布廣泛且習(xí)性不盡相同的物種，能夠體現(xiàn)其進(jìn)化演變歷史，因此在近年來關(guān)于麻蜥屬遺傳相關(guān)的研究中，微衛(wèi)星作為分子標(biāo)記成為應(yīng)用熱門。

2.4 SNP（單核苷酸多態(tài)性）

2.4.1內(nèi)容 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism）為染色體基因中單個(gè)核苷酸發(fā)生突變（一般為單個(gè)堿基出現(xiàn)的缺失、倒序、置換、插入等），作為第三代分子標(biāo)記被廣泛使用[16]。

2.4.2方法 對(duì)于SNP最為直接準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是直接測(cè)序，通過對(duì)擴(kuò)增得到的不同樣本的相同基因，使用設(shè)計(jì)的特異性載體結(jié)合檢測(cè)，可以準(zhǔn)確得到單個(gè)核苷酸的突變類型和位置。除此之外，還可設(shè)計(jì)DN芯片，應(yīng)用變性高效液相色譜和質(zhì)譜檢測(cè)等方法，是一類隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展形成的高通量、自動(dòng)化程度較高的新型檢測(cè)方法。

目前SNP作為一類新型分子標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于其他爬行類研究，可為今后麻蜥屬的研究提供參考。祁玥[7]在關(guān)于南疆沙蜥系統(tǒng)地理學(xué)的研究中，選取采樣的南疆沙蜥DNA構(gòu)建GBS文庫(kù)，篩選獲得高質(zhì)量SNPs并進(jìn)行雜合度分析，包括觀測(cè)雜合度和期望雜合度，并基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置參數(shù)，應(yīng)用Treebest1.9.2軟件計(jì)算遺傳距離，分析南疆沙蜥的種群遺傳結(jié)構(gòu)，證明各個(gè)群體間遺傳差異顯著。

2.4.3特點(diǎn) 與多數(shù)分子標(biāo)記一樣，SNP在生物體內(nèi)數(shù)量多且分布較為廣泛，遺傳變異相對(duì)穩(wěn)定也使得其結(jié)果更具代表性，且SNP多屬于二等位基因，便于自動(dòng)化分析，適用于對(duì)大基數(shù)樣本的快速分析[17]。

3 討論

對(duì)于麻蜥屬蜥蜴遺傳多樣性的分析，目前研究趨勢(shì)從核型表征方面已經(jīng)逐漸轉(zhuǎn)向基因?qū)用?，?duì)于不同種類分子標(biāo)記的應(yīng)用也已成為研究熱點(diǎn)。不同的分子標(biāo)記其本質(zhì)都是對(duì)于基因突變應(yīng)用的新詮釋，分子標(biāo)記所要求具有的特點(diǎn)共性都是具有較高的多態(tài)性，便于基于突變研究物種進(jìn)化情況和種間關(guān)系，同時(shí)穩(wěn)定性與檢測(cè)方式的準(zhǔn)確性也成為選擇分子標(biāo)記的參考標(biāo)準(zhǔn)。以遺傳變異為動(dòng)力的遺傳多樣性研究，即遺傳信息在傳遞過程中可能發(fā)生基因?qū)用娴耐蛔兓蛑亟M而造成遺傳信息的變化，進(jìn)而形成了物種的遺傳多樣性變化，包括不同群體和同一群體不同個(gè)體的遺傳多樣性。對(duì)于動(dòng)物群體遺傳多樣性的研究能夠系統(tǒng)追溯該動(dòng)物群體的生物進(jìn)化歷史，分子標(biāo)記的使用也應(yīng)根據(jù)其特點(diǎn)綜合分析。微衛(wèi)星DNA相比線粒體DNA的分子量更小，多態(tài)性水平更高，能夠反映短期內(nèi)物種的進(jìn)化關(guān)系；線粒體DNA序列變異速度相對(duì)于微衛(wèi)星DNA較慢，能夠反映相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)物種的遺傳結(jié)構(gòu)，在對(duì)遺傳結(jié)構(gòu)研究的時(shí)間尺度上形成了較全面的相互補(bǔ)充。而分散取樣又能夠從空間尺度印證遺傳多樣性對(duì)種群棲息地分布帶來的影響。第三代分子標(biāo)記SNP則擁有簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確的分析優(yōu)勢(shì)，可結(jié)合上述2種分子標(biāo)記進(jìn)一步提升研究層次。利用分子標(biāo)記對(duì)遺傳距離的獲取可為現(xiàn)存生物的進(jìn)化潛能評(píng)估提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，結(jié)合進(jìn)化時(shí)間尺度的分析能預(yù)測(cè)未來進(jìn)化趨勢(shì)，而氣候、土壤條件、濕度等一系列生境因子又能夠反作用于生物的進(jìn)化過程，從而進(jìn)一步擴(kuò)大生物遺傳多樣性。