張 輝，王子堅(jiān)*，胡彥龍

（1.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730046；2.平?jīng)鍪袆?dòng)物衛(wèi)生服務(wù)中心，甘肅 平?jīng)?744000）

牛傳染性鼻氣管炎最早發(fā)生于歐洲，在我國(guó)屬于外來病，1980年從新西蘭進(jìn)口的奶牛中發(fā)現(xiàn)此病，此后全國(guó)各地陸續(xù)出現(xiàn)牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）感染的報(bào)道。該病難以根治的原因是病牛長(zhǎng)期乃至終生帶毒，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體的抵抗力降低時(shí)，潛伏在神經(jīng)細(xì)胞中的病毒就被重新激活，導(dǎo)致持續(xù)性感染并不斷向體外排毒，所以很難控制和消滅本病，極大地影響了肉牛育肥、奶牛產(chǎn)奶、種牛育種以及日常役用，給養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1 病毒簡(jiǎn)介

1.1 病毒特性

牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）是皰疹病毒科皰疹病毒α-亞科水痘病毒屬的成員[1]，是一種直徑約為130～220 nm的球形有囊膜的雙鏈DNA病毒，具有皰疹病毒典型的形態(tài)特征，主要由3部分構(gòu)成，從內(nèi)到外分別是核衣殼、被膜和囊膜。病毒的核心由雙股DNA和蛋白質(zhì)組成，核衣殼又分為內(nèi)層、中層和外層，衣殼和囊膜之間是被膜，是一層無定型不均勻的物質(zhì)，囊膜由脂質(zhì)雙層膜形成，表面分散著決定病毒侵襲功能的糖蛋白[2]。該病毒本身對(duì)乙醚和酸敏感，在中性溶液中很穩(wěn)定，在4 ℃下可保存1個(gè)月左右，-70 ℃可保存數(shù)年，大多數(shù)消毒藥都對(duì)其有消殺作用。截至目前，分離到的不同毒株證實(shí)，牛傳染性鼻氣管炎病毒只存在一種血清型及一種抗原性[3]。

1.2 主要的囊膜蛋白

隨著基因測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，牛傳染性鼻氣管炎病毒已完成全基因組測(cè)序，主要的囊膜蛋白gB、gC、gD和gE已被鑒定定位，這些囊膜蛋白在刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫的基礎(chǔ)上還能產(chǎn)生中和抗體，可以借助補(bǔ)體的作用加速感染細(xì)胞的裂解，與病毒吸附、侵入和擴(kuò)散過程密切相關(guān)。gB蛋白是動(dòng)物機(jī)體能夠識(shí)別的主要免疫原，在病毒感染細(xì)胞和介導(dǎo)中和反應(yīng)過程中扮演著重要角色[4]；gC作為病毒吸附蛋白，在病毒復(fù)制過程中是非必需的，但它能夠與受體細(xì)胞相互作用從而侵入細(xì)胞[5]；gD蛋白在病毒復(fù)制過程中以及誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)時(shí)發(fā)揮著重要作用，能夠同時(shí)引起細(xì)胞免疫和體液免疫[6]；gE蛋白作為跨膜蛋白，暴露在病毒囊膜外的區(qū)域是動(dòng)物機(jī)體識(shí)別后產(chǎn)生中和抗體的靶點(diǎn)[4]。

1.3 致病機(jī)理

目前牛傳染性鼻氣管炎病毒侵入宿主細(xì)胞的過程還沒有被完全了解。研究顯示，牛傳染性鼻氣管炎病毒侵入宿主細(xì)胞是由表面特異性的吸附蛋白gB和gC與敏感細(xì)胞表面的病毒受體相互作用，進(jìn)而吸附到細(xì)胞表面隨后侵入宿主細(xì)胞。病毒侵入宿主細(xì)胞后，在相關(guān)酶的作用下脫去核衣殼后將病毒DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)，再利用宿主細(xì)胞的蛋白合成自身的衣殼蛋白，經(jīng)包被修飾后，組裝成成熟的病毒顆粒釋放到細(xì)胞外，使新的細(xì)胞不斷被感染。被牛傳染性鼻氣管炎病毒感染的細(xì)胞隨血液擴(kuò)散，進(jìn)一步導(dǎo)致組織器官感染，從而引起疾病發(fā)生。雖然病毒在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)復(fù)制時(shí)，會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，但是牛傳染性鼻氣管炎病毒有許多逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的機(jī)制，致使病毒逃避檢測(cè)和免疫細(xì)胞的消除作用，這就使病毒能夠在動(dòng)物中維持終身感染[7]。當(dāng)遇到長(zhǎng)途運(yùn)輸、母牛分娩以及飼養(yǎng)環(huán)境發(fā)生較大變化時(shí)，都有可能使?jié)摲牟《颈患せ?，?dǎo)致持續(xù)性感染并不斷向體外排毒，進(jìn)而引起繼發(fā)性感染。

2 臨床癥狀

病牛和帶毒牛作為主要的傳染源，其潛伏期一般為4～6 d，有時(shí)可達(dá)20 d以上，該病可以通過空氣、飛沫、精液和接觸水平傳播，也可以通過胎盤垂直傳播。根據(jù)感染牛群的感染部位和侵害組織的不同，主要表現(xiàn)為呼吸道發(fā)炎、生殖道感染、腦膜腦炎、眼炎、流產(chǎn)5種臨床癥狀。

呼吸道型常出現(xiàn)在天氣較冷的季節(jié)，病情較輕者有時(shí)不易發(fā)現(xiàn)，急性病例主要表現(xiàn)為病初高熱、精神沉郁、食欲下降、呼吸困難，有多量黏膿性鼻漏，鼻黏膜充血，奶牛產(chǎn)奶量巨減，病牛有時(shí)可見帶血腹瀉。多數(shù)病例病程持續(xù)在10 d以上，整體表現(xiàn)為發(fā)病率高、死亡率低。

生殖道感染型大多是由配種造成的，病初表現(xiàn)為發(fā)熱、食欲下降、尿頻并伴有疼痛感，病畜生殖器官發(fā)炎充血，生殖器會(huì)出現(xiàn)白色病灶，可發(fā)展成膿包，大量小膿包使陰戶及陰道處形成灰色壞死膜，脫落后露出發(fā)紅的破損表皮，急性期消退后大概經(jīng)10～14 d痊愈。

腦膜腦炎型主要以犢牛最為常見，病畜主要表現(xiàn)為體溫升高、共濟(jì)失調(diào)、興奮驚厥、口吐白沫、倒地后角弓反張、四指劃動(dòng)等神經(jīng)癥狀，病程短但病死率高。

眼炎型一般無明顯的全身反應(yīng)，有時(shí)和呼吸道型一同出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為結(jié)膜充血、水腫，角膜混濁，眼角有漿液性膿性分泌物，死亡率低。

流產(chǎn)型是病毒經(jīng)呼吸道感染牛后，隨從血液循環(huán)進(jìn)入胎膜、胎兒所致，大多數(shù)母牛流產(chǎn)或分娩后胎衣不下，感染胎兒一般在1周左右死亡，隨后排出體外，妊娠母牛感染本病后造成的流產(chǎn)率高達(dá)50%以上。

3 診斷方法

牛傳染性鼻氣管炎在國(guó)際動(dòng)物貿(mào)易以及進(jìn)出境動(dòng)物中是重點(diǎn)檢疫對(duì)象，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為B類傳染病，我國(guó)將其劃為二類動(dòng)物疫病。根據(jù)臨診癥狀和病史通?？梢宰鞒龀醪皆\斷，通過病理組織學(xué)診斷、病毒的分離鑒定、免疫學(xué)檢測(cè)以及核酸分子檢測(cè)等檢測(cè)技術(shù)可以進(jìn)一步確診。核酸分子檢測(cè)技術(shù)中的聚合酶鏈反應(yīng)和熒光定量PCR與病原學(xué)檢測(cè)方法和血清學(xué)診斷方法相比較，具有快速、高特異性和高敏感性等優(yōu)勢(shì)，因此在牛傳染性鼻氣管炎的臨床診斷上得到了廣泛應(yīng)用。

3.1 病理組織學(xué)診斷

牛傳染性鼻氣管炎病毒可在牛腎、睪丸、胸腺細(xì)胞以及牛胚胎腎細(xì)胞（MDBK）上生長(zhǎng)產(chǎn)生病變，并有核內(nèi)包涵體形成，采集病牛有明顯病變部位的眼結(jié)膜、上呼吸道、鼻腔等上皮組織制成切片后，用Lendrum包涵體染色法染色，借助顯微鏡觀察涂片或病料組織切片，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核被染成藍(lán)色，包涵體被染成紅色[8]，就是牛傳染性鼻氣管炎病毒的特征性顯微病變。

3.2 病毒的分離鑒定

根據(jù)病牛的臨診癥狀，可以采集感染發(fā)熱期的鼻液或眼分泌物，母牛外陰部黏膜、陰道分泌物以及流產(chǎn)胎兒胸腔液或胎盤子葉，公牛精液或包皮生理鹽水洗滌物，有神經(jīng)癥狀的可采集腦組織。將采集的病料經(jīng)處理后接種到牛腎細(xì)胞上培養(yǎng)，后期如果產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），可進(jìn)行中和試驗(yàn)、熒光抗體試驗(yàn)來鑒定病毒，或者進(jìn)一步分離病毒進(jìn)行電鏡觀察鑒定。

3.3 免疫學(xué)檢測(cè)方法

免疫學(xué)檢測(cè)方法最常見的主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、中和試驗(yàn)（VN）以及間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）。牛傳染性鼻氣管炎病毒主要的囊膜蛋白gB、gC、gD和gE等已被鑒定定位，利用這些囊膜蛋白和單克隆抗體技術(shù)研制的雙抗體夾心法、間接以及阻斷ELISA已被廣泛應(yīng)用于牛傳染性鼻氣管炎病毒的診斷。當(dāng)牛感染牛傳染性鼻氣管炎病毒后，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生特異性抗體，特異性抗體與該病毒能夠發(fā)生特異性結(jié)合，利用這一原理可用標(biāo)準(zhǔn)毒株的免疫血清同分離到的毒株進(jìn)行中和試驗(yàn)，也可用標(biāo)準(zhǔn)毒株同檢測(cè)血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，但該試驗(yàn)操作繁瑣、試驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作要求高，并不適用于大量樣本的檢測(cè)。間接免疫熒光試驗(yàn)先讓特異性抗體同檢測(cè)樣本中的抗原結(jié)合，再利用熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育，最后通過熒光顯微鏡觀察特異性熒光達(dá)到檢測(cè)的目的。間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒具有操作簡(jiǎn)單、快速、敏感度較高的優(yōu)點(diǎn)，但產(chǎn)生的非特異性熒光有可能影響診斷結(jié)果。

3.4 分子診斷技術(shù)

目前已廣泛應(yīng)用于傳染病的分子診斷技術(shù)主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、熒光定量PCR（qPCR）和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）等，其中建立牛傳染性鼻氣管炎病毒的PCR檢測(cè)方法，主要是根據(jù)IBRV基因組編碼不同的蛋白，設(shè)計(jì)特異性引物，利用體外酶在特定條件下促合成特異DNA片段進(jìn)而達(dá)到檢測(cè)的目的，該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。qPCR檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒主要是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，與普通PCR相比，可進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單快速、特異性強(qiáng)和敏感性高的優(yōu)點(diǎn)。LAMP是利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下，短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，反應(yīng)能產(chǎn)生大量的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過擴(kuò)增產(chǎn)物來判斷牛傳染性鼻氣管炎病毒是否存在。

4 防控措施

4.1 國(guó)外防控策略

20世紀(jì)80年代，美國(guó)在全球首次提出牛傳染性鼻氣管炎的根除計(jì)劃，緊接著瑞士、芬蘭、德國(guó)等國(guó)家陸續(xù)提出并啟動(dòng)該病的根除計(jì)劃。瑞士、芬蘭提供撲殺補(bǔ)償，對(duì)檢疫發(fā)現(xiàn)的陽(yáng)性牛只進(jìn)行撲殺，不采用免疫接種的方法，雖然其為此付出了很大的代價(jià)，但防制效果顯著，均成功根除該病。1997年德國(guó)啟動(dòng)牛傳染性鼻氣管炎的強(qiáng)制根除計(jì)劃，先采取免疫接種的方式，然后再進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)非疫苗感染的陽(yáng)性牛進(jìn)行強(qiáng)制撲殺，最終達(dá)到凈化的目的，花費(fèi)5年時(shí)間基本根除了該病。美國(guó)、荷蘭等國(guó)家主張使用疫苗預(yù)防該病，這種防控策略僅僅是控制了牛傳染性鼻氣管炎，并沒有被根除該病。

4.2 防控建議

牛傳染性鼻氣管炎病毒的生物學(xué)特性決定了控制和消除本病的難度，病毒生存能力強(qiáng)，分布范圍廣，在不同地區(qū)、不同環(huán)境和不同牛種中都有檢出，目前也僅有少數(shù)歐洲國(guó)家耗費(fèi)大量的人力、物力、財(cái)力才得以消滅該病。近年來，我國(guó)部分地區(qū)牛傳染性鼻氣管炎流行較為嚴(yán)重。2010—2019年的陽(yáng)性率呈現(xiàn)波動(dòng)式起伏，趨勢(shì)線顯示陽(yáng)性率逐年上升，可見我國(guó)牛傳染性鼻氣管炎防控形勢(shì)日趨嚴(yán)重[9]。

目前，我國(guó)牛傳染性鼻氣管炎陽(yáng)性率高，若采取撲殺陽(yáng)性牛的措施，造成的經(jīng)濟(jì)損失較大。應(yīng)綜合考慮多方面因素，可借鑒德國(guó)實(shí)施的“免疫-檢疫-撲殺”策略來根除該病。在國(guó)內(nèi)已經(jīng)建立了gE-阻斷ELISA來區(qū)分自然感染和免疫接種的方法[10]，因此要因地制宜，結(jié)合當(dāng)?shù)亓餍星闆r進(jìn)行防控。在無疫養(yǎng)殖場(chǎng)區(qū)，若檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性牛則直接撲殺；存在病毒污染的養(yǎng)殖場(chǎng)區(qū)，先免疫接種基因缺失標(biāo)記疫苗，然后再進(jìn)行鑒別診斷，最后對(duì)檢出的自然感染的陽(yáng)性牛進(jìn)行撲殺。結(jié)合日常飼養(yǎng)管理，力求通過免疫接種、日常監(jiān)測(cè)和檢疫監(jiān)管等多種方式，從而達(dá)到預(yù)防、控制和消滅本病的目的。

廣大養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）在做好飼養(yǎng)管理、提供充足營(yíng)養(yǎng)、搞好日常消毒的基礎(chǔ)上，一是做好免疫接種，在經(jīng)常發(fā)病的地區(qū)或者本病潛在地區(qū)，要有計(jì)劃地給牛群進(jìn)行免疫接種，及時(shí)保護(hù)易感動(dòng)物；二是加強(qiáng)日常監(jiān)測(cè)，接種疫苗后并不能阻止野毒感染，要按時(shí)定期檢測(cè)，利用鑒別診斷技術(shù)一經(jīng)發(fā)現(xiàn)有野毒感染，應(yīng)立即采取隔離、封鎖、撲殺、消毒等綜合性防控措施，死亡動(dòng)物和淘汰病畜要嚴(yán)格進(jìn)行無害化處理，防止病毒再次擴(kuò)散；三是強(qiáng)化檢疫監(jiān)管，特別要加強(qiáng)進(jìn)口牛及其產(chǎn)品的檢疫，防止引入傳染源和帶入病毒。同時(shí)，做好產(chǎn)地檢疫、調(diào)運(yùn)監(jiān)管和凍精的檢疫監(jiān)管，確保能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)和淘汰陽(yáng)性或疑似陽(yáng)性牛，并做好隔離觀察和采樣檢測(cè)工作，確定活牛健康后方可混群飼養(yǎng)。

5 結(jié)語

隨著我國(guó)畜牧業(yè)的快速發(fā)展，牛產(chǎn)業(yè)規(guī)?；?、集約化程度不斷提升，牛傳染性鼻氣管炎的廣泛流行，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。各級(jí)政府、主管部門和養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）應(yīng)高度重視牛傳染性鼻氣管炎的防控工作，持續(xù)加大新技術(shù)的科研攻關(guān)，加強(qiáng)疫病防控知識(shí)的宣傳培訓(xùn)，強(qiáng)化免疫接種和鑒別診斷，淘汰自然感染的陽(yáng)性牛，最終達(dá)到控制、凈化的目的，進(jìn)而助力牛產(chǎn)業(yè)健康穩(wěn)定高質(zhì)量發(fā)展。