徐英黔，邢可心，邱 咸，周 瑤，劉佳佳，胡君一

（1.遼寧科技大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 鞍山 114051；2.浙江華才檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江 紹興 311800）

珍珠是由沙子等外來異物刺激蚌的外套膜，從而產(chǎn)生大量的珍珠質(zhì)，把沙子等異物逐層包裹起來形成的［1］。近年來，因珍珠的功效被逐漸發(fā)掘，珍珠的加工方法也日漸成熟。珍珠在化妝品中一般是加工成珍珠粉，應(yīng)用在粉底、粉餅類彩妝化妝品中；或者加工成珍珠粉水解液，應(yīng)用在護(hù)膚類產(chǎn)品中［2-3］。有研究表明，珍珠粉水解液中含有18種氨基酸、28種微量元素［4］以及牛磺酸、葉琳體等物質(zhì)［5］，具有抗疲勞、抗衰老、美白等功效［6］。珍珠粉水解液分子量小，相比于珍珠粉直接應(yīng)用在化妝品中，更有利于人體皮膚的吸收。

珍珠粉水解液的制備有三種方式：用酸進(jìn)行水解、用單一/復(fù)合酶進(jìn)行酶解或者采用酸-酶聯(lián)用進(jìn)行水解［7-9］。酸水解一般使用乳酸、鹽酸等，但水解液中氨基態(tài)氮含量很低；酸-酶水解方法的水解液中氨基酸含量高，但是制備方式復(fù)雜；酶解方法的條件更加溫和、高效，操作步驟也更簡(jiǎn)便，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

本文將胰蛋白酶和木瓜蛋白酶兩種酶進(jìn)行復(fù)合，對(duì)微米級(jí)珍珠粉進(jìn)行水解制備珍珠粉水解液，以氨基態(tài)氮含量為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，通過單因素及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化復(fù)合酶水解珍珠粉工藝的最佳條件，并對(duì)珍珠粉水解液的皮膚滲透性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料與儀器

珍珠粉，山東冠特生物工程有限公司；1.1-二苯基-2-苦肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH），西亞化學(xué)科技有限公司；茚三酮，山東穗華生物科技有限公司；無水乙醇，分析純，廣州東業(yè)化工；磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鉀，均為分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；木瓜蛋白酶的酶活力100 000 U/g、胰蛋白酶的酶活力100 000 U/g，北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司。

Lambda 750 S紫外分光光度計(jì)，Perkin Elmer；OSB-2100油浴鍋，上海愛朗儀器有限公司；80-2離心機(jī)，常州天瑞儀器有限公司；XQG-2000電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HDT 1000立式擴(kuò)散池系統(tǒng)，月旭科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 珍珠水解液制備工藝流程 稱取珍珠粉3.0 g，放入錐形瓶中，加30 mL去離子水振蕩溶解。加入適量復(fù)合酶，調(diào)節(jié)至酶的適宜溫度及pH值，加熱180 min。反應(yīng)結(jié)束，將其取出，置于95℃熱水浴中，加熱15 min。室溫放置至40℃，以3 800 r/min離心15 min。取上清液，測(cè)定氨基態(tài)的氮含量。

1.2.2 氨基態(tài)氮含量的測(cè)定 將1 mL標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液分別稀釋至20、40、60、80、100 μg/mL。分別加入1 mL去離子水，充分混勻，再加入1 mL 20 mg/L茚三酮溶液，充分搖勻后，90℃水浴加熱15 min，取出后立即降至室溫。再加入7 mL 75%乙醇稀釋。在570 nm處測(cè)其吸光值，繪制氨基態(tài)氮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同條件下，珍珠粉水解液的水解程度用氨基態(tài)氮含量表示［10］。樣品中氨基態(tài)氮含量測(cè)定方法與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn)方法相同。樣品液中的氨基態(tài)氮含量可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.2.3 復(fù)合酶比例的選擇 在酶解溫度40℃、pH=7.0、復(fù)合酶添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%、酶解時(shí)間180 min條件下，將胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按不同質(zhì)量比配成復(fù)合酶，考察胰蛋白酶與木瓜蛋白酶兩者比例對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 在酶解溫度為40℃、pH=7.0、酶解時(shí)間180 min、復(fù)合酶質(zhì)量比為1∶3等相同條件下，考察復(fù)合酶添加量對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響。

在酶解溫度40℃、復(fù)合酶質(zhì)量比為1∶3、復(fù)合酶添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%、酶解時(shí)間180 min等相同條件下，考察pH值對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響。

在酶解溫度40℃、pH=7.0、復(fù)合酶質(zhì)量比為1∶3、復(fù)合酶添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%等相同條件下，設(shè)置不同酶解時(shí)間，考察酶解時(shí)間對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響。

在pH=7.0、復(fù)合酶質(zhì)量比為1∶3、復(fù)合酶添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%、酶解時(shí)間180 min等相同條件下，分別設(shè)置不同的酶解溫度，考察酶解溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以復(fù)合酶添加量、pH值、酶解時(shí)間以及酶解溫度為變量，以氨基態(tài)氮含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素及水平詳見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平Tab.1 Response surface analysis for factor levels

1.2.6 DPPH清除率的測(cè)定 取1 mL珍珠粉水解液（或?qū)φ掌? mg/L抗壞血酸）加入到3 mL 26 μg/mL DPPH無水乙醇溶液中，室溫下，將溶液避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度A0；用無水乙醇代替DPPH溶液，測(cè)定吸光度為A1。DPPH的清除率計(jì)算式［11］

1.2.7 皮膚滲透性實(shí)驗(yàn) 將去除皮下組織的新鮮豬皮洗凈，剪成邊長(zhǎng)2.5 cm的正方形［12］。將角質(zhì)層朝上放置在立式擴(kuò)散池的進(jìn)樣池與接受池之間。在接受池中加滿磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（pH=7.4），加入磁子。向進(jìn)樣池中加入1 mL水解樣品，使其均勻完全覆蓋住皮膚。設(shè)置實(shí)驗(yàn)溫度為32℃，400 r/min攪拌下作用24 h。反應(yīng)結(jié)束后，517 nm處測(cè)定其吸光值，利用接受池中氨基態(tài)氮含量計(jì)算皮膚滲透性［13］。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基態(tài)氮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制的氨基態(tài)氮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。氨基態(tài)氮含量標(biāo)準(zhǔn)方程為：y=0.025 1x-0.067，R2=0.996 9。在0~100 g/mL范圍內(nèi)，氨基態(tài)氮含量與吸光度成線性關(guān)系。

圖1 氨基態(tài)氮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of amino nitrogen content

2.2 復(fù)合酶比例的確定

在酶解溫度40℃、pH=7.0、復(fù)合酶添加量為1.8%、酶解時(shí)間180 min條件下，分別將胰蛋白酶與木瓜蛋白酶按1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1的質(zhì)量比進(jìn)行酶解，得到水解液中氨基態(tài)氮含量，結(jié)果如圖2所示。隨著胰蛋白酶用量的增多，氨基態(tài)氮含量先升高后降低。胰蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶3時(shí)，氨基態(tài)氮含量達(dá)到4.87 μg/ml，處于最大值。胰蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶3為復(fù)合酶的最佳比例。

圖2 復(fù)合酶比例對(duì)氨基態(tài)氮含量影響Fig.2 Effect of compound enzyme proportion on amino nitrogen content

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 復(fù)合酶添加量對(duì)反應(yīng)的影響 在其他條件都不變的情況下，改變復(fù)合酶添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.6%、1.2%、1.8%、2.4%、3.0%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。氨基態(tài)氮含量隨著復(fù)合酶添加量的增加而增加。在復(fù)合酶添加量為1.8%時(shí)，達(dá)到最大值，之后氨基態(tài)氮含量基本保持穩(wěn)定。這說明在底物濃度一定時(shí)，適當(dāng)增加復(fù)合酶的用量，酶解效率可以提高，最適宜的復(fù)合酶添加量為1.8%。

圖3 復(fù)合酶添加量對(duì)氨基態(tài)氮含量影響Fig.3 Effect of enzyme addition on amino nitrogen content

2.3.2 pH值對(duì)反應(yīng)的影響 pH值對(duì)酶的活性影響比較大，酶的空間構(gòu)型隨pH值變化也發(fā)生改變。pH值過高或過低都會(huì)影響酶與底物的正常結(jié)合，從而抑制酶解反應(yīng)。在pH=5、6、7、8時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。隨著pH值增大，氨基態(tài)氮含量先升高再降低。當(dāng)pH=7時(shí)，氨基態(tài)氮含量出現(xiàn)最大值，說明此時(shí)水解程度最高。

圖4 pH值對(duì)氨基態(tài)氮含量影響Fig.4 Effect of pH value on amino nitrogen content

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響 其他條件不變，酶解時(shí)間分別為60、120、180、240、300、360 min時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。酶解時(shí)間在180 min以內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的增加，氨基態(tài)氮含量顯著增大。但在180 min后，氨基態(tài)氮含量基本穩(wěn)定，說明此時(shí)已經(jīng)接近完全水解，氨基態(tài)氮處于飽和狀態(tài)，故最佳的酶解時(shí)間為180 min。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)氨基態(tài)氮含量影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on amino nitrogen content

2.3.4 酶解溫度對(duì)反應(yīng)的影響 只改變酶解溫度為30、40、50、60℃，其他條件不變時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。隨著溫度升高，氨基態(tài)氮含量先升高后降低，40℃時(shí)，氨基態(tài)氮含量達(dá)到最大值。因?yàn)樵?0℃時(shí)，由于環(huán)境溫度過低，影響酶的活性，因此反應(yīng)速率降低；超過40℃后，部分酶會(huì)因溫度過高而失去活性，從而影響該反應(yīng)酶解程度。

圖6 酶解溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on amino nitrogen content

2.4 酶解珍珠粉響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取A（復(fù)合酶添加量）、B（pH值）、C（酶解時(shí)間）、D（酶解溫度）為四因素，各取三個(gè)水平，以氨基態(tài)氮含量作為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，對(duì)本實(shí)驗(yàn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析因素結(jié)果Tab.2 Response surface analysis factor results

利用Design-Expert 10.0軟件進(jìn)行Box-Behnken模型設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到回歸方程

回歸方程及各項(xiàng)方差分析如表3所示?；貧w模型的P（＜0.000 1）＜0.05，說明模型達(dá)到顯著水平；失擬項(xiàng)P=0.056 0＞0.05，模型失擬不顯著，說明在所選各因素的水平值內(nèi)，用此模型對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)是準(zhǔn)確的。觀察各因素的P值，一次項(xiàng)A（復(fù)合酶添加量）、B（pH值）、C（酶解時(shí)間）、交叉項(xiàng)AD及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)模型呈現(xiàn)極顯著性影響（P＜0.01），一次項(xiàng)D（酶解溫度）、交叉項(xiàng)AC對(duì)模型有著影響（P＜0.05）。

表3 氨基態(tài)氮含量響應(yīng)面結(jié)果Tab.3 Response surface results of amino nitrogen content

2.4.2 各因素及交互作用對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響 根據(jù)F值推斷四個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值影響大小為：復(fù)合酶添加量＞pH值＞酶解時(shí)間＞酶解溫度。

以氨基態(tài)氮含量為響應(yīng)值，根據(jù)回歸方程分析四因素之間各交互作用對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響［14］，結(jié)果如圖7所示。隨著復(fù)合酶添加量以及pH值不斷增加，氨基態(tài)氮含量先升高后降低，兩因素有交互作用，其中復(fù)合酶添加量對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響更加明顯。在酶解時(shí)間一定時(shí)，氨基態(tài)氮含量隨著復(fù)合酶添加量的增加先增大后趨于不變，酶解時(shí)間對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響略小于復(fù)合酶的添加量。復(fù)合酶添加量不變，酶解溫度升高，氨基態(tài)氮含量先增加后降低，酶解溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響要小于復(fù)合酶添加量。在酶解時(shí)間一定時(shí)，氨基態(tài)氮含量隨著pH值的增大先增大后減小，酶解時(shí)間和pH值的等高線圖接近于圓形，說明這兩個(gè)因素的交互作用對(duì)于氨基態(tài)氮含量的影響較小。在pH值一定時(shí)，氨基態(tài)氮含量隨著溫度的升高先增大后減小，溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響沒有pH值顯著。酶解溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響遠(yuǎn)沒有酶解時(shí)間的影響大。響應(yīng)面結(jié)果分析與方差分析一致，證明該模型可靠。

圖7 四因素交互作用對(duì)氨基態(tài)氮含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surfaces and contours of effects of four factor interaction on amino nitrogen content

續(xù)圖7四因素交互作用對(duì)氨基態(tài)氮含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surfaces and contours of effects of four factor interaction on amino nitrogen content

根據(jù)二次回歸方程利用Design-Expert 10.0軟件作進(jìn)一步分析得出，氨基態(tài)氮含量最高時(shí)對(duì)應(yīng)的條件為：復(fù)合酶添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.1%，pH=7.0，酶解時(shí)間為202 min，溫度為44℃。在此條件下，氨基態(tài)氮含量預(yù)測(cè)結(jié)果為5.00 μg/mL。

2.4.3 最佳酶解方案驗(yàn)證 根據(jù)軟件的預(yù)測(cè)方案，結(jié)合實(shí)際的可操作性，取酶添加量為2.0%，pH=7.0，酶 解 時(shí) 間 為200 min，溫 度 為44℃，進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，得到氨基態(tài)氮含量平均值為4.98 μg/mL，與模型預(yù)測(cè)的結(jié)果相近，說明該響應(yīng)面模型對(duì)于優(yōu)化酶解珍珠粉工藝有效且可行。

2.4.4 DPPH抑制率測(cè)定 以1 mg/L的抗壞血酸溶液作為對(duì)照，分別測(cè)定抗壞血酸與酶解液在517 nm處吸光度，計(jì)算出酶解液的DPPH抑制率為40.6%。沈喆鸞采用常規(guī)固液提取法提取珍珠粉，得到的提取物對(duì)DPPH的清除率幾乎為0［15］。由此可知，采用復(fù)合酶酶解珍珠粉對(duì)DPPH的抑制率能顯著提高。

2.4.5 皮膚滲透性實(shí)驗(yàn) 樣品中氨基態(tài)氮含量為4.98 μg/mL，通過測(cè)定517 nm處吸光度及氨基態(tài)氮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出接收池中氨基態(tài)氮含量為4.12 μg/mL，滲透率達(dá)到82.7%，遠(yuǎn)高于通過常規(guī)固液提取的珍珠粉。表明酶解后的珍珠粉，分子量更小，更利于皮膚的吸收。

3 結(jié)論

采用復(fù)合酶同步酶解的實(shí)驗(yàn)方法，采用單因素及響應(yīng)面優(yōu)化酶解制備珍珠粉水解液工藝。通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，得到復(fù)合酶酶解珍珠粉的最佳條件為復(fù)合酶中胰蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶3，復(fù)合酶添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%，pH=7.0，酶解時(shí)間200 min，溫度為44℃，氨基態(tài)氮含量達(dá)到4.98 μg/mL。酶解液的DPPH抑制率為40.6%，酶解液對(duì)皮膚的滲透率達(dá)到82.7%，為珍珠粉酶解液在化妝品中應(yīng)用提供參考。