楊 坤，胡紅蓮，李大彪，李蘭柱，張劍霞，錢 娜，于良義，白夢婷，郭 琳，高 民

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030）

在規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場中， 為提高奶牛產(chǎn)奶效率， 存在飼喂過量非結(jié)構(gòu)性碳水化合物和可發(fā)酵能量飼料的現(xiàn)象，造成大量揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）在瘤胃積累，使瘤胃液pH 值降低，瘤胃菌群失調(diào)，引發(fā)奶牛亞急性瘤胃酸中毒（subacute ruminal acidosis，SARA）［1］。 奶 牛 長 期 處 于SARA 狀態(tài)會引起采食量、飼料轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)奶量下降，并且導(dǎo)致乳脂率降低。 SARA 也可引起胃腸道損傷、瘤胃炎及機體炎癥級聯(lián)反應(yīng)，如蹄葉炎、肝膿腫、乳腺炎等［2］，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。 據(jù)統(tǒng)計， 美國每年因奶牛SARA 造成約5億～10 億美元的經(jīng)濟損失［3］。 奶牛SARA 發(fā)病率高，不易診斷，臨床表現(xiàn)具有延遲性，在群體養(yǎng)殖中不易被發(fā)現(xiàn)［4］，給飼養(yǎng)管理造成一定難度。 除了飼喂過多能量飼料導(dǎo)致瘤胃酸度過高以外， 影響奶牛對SARA 易感的因素還有很多， 這些因素使奶牛瘤胃內(nèi)環(huán)境紊亂， 瘤胃液pH 值低于正常值，從而誘發(fā)SARA。 瘤胃是奶牛發(fā)酵以及利用飼料營養(yǎng)最大的器官， 而瘤胃上皮細胞為微生物增殖提供溫床， 是瘤胃微生物附著代謝和奶牛吸收營養(yǎng)的主要部位， 瘤胃上皮細胞和瘤胃微生物的協(xié)同作用為機體生長發(fā)育提供能源。 SARA 對奶牛瘤胃上皮細胞結(jié)構(gòu)的完整性和瘤胃菌群造成嚴重影響。 通過參考國內(nèi)外文獻，結(jié)合前人研究進展，從不同生理階段， 擇食行為和耐受性方面分析奶牛SARA 易感因素及SARA 對瘤胃上皮細胞結(jié)構(gòu)功能的影響， 以期為分析奶牛SARA 易感因素，以及SARA 對瘤胃造成功能性損傷研究提供參考。

1 奶牛對SARA 的易感差異及影響因素

奶牛SARA 的易感因素有很多， 但目前國內(nèi)相關(guān)報道相對較少。 研究發(fā)現(xiàn)，SARA 高發(fā)病率奶牛通常處于泌乳早期、初產(chǎn)、采食過量可發(fā)酵能量飼料與低纖維牧草等情況， 其中飼喂過量高能飼料是主要因素［5］。 養(yǎng)殖場通過添加部分飼料添加劑和微生物制劑， 如碳酸氫鈉或酵母培養(yǎng)物降低SARA 的發(fā)病率，盡管如此，多數(shù)規(guī)?；B(yǎng)殖場的奶牛在泌乳早期和中期的SARA 發(fā)病率依然在19%～26%［6］， 說明奶牛對SARA 的敏感性還受其他因素影響。即使在同一養(yǎng)殖模式下，飼喂相同高精料飼料，奶牛瘤胃液pH 值下降程度亦有很大差異，說明奶牛個體對SARA 的耐受性不盡相同。此外，擇食行為、TMR 混合不均、飼養(yǎng)管理因素等也會導(dǎo)致奶牛SARA 的發(fā)生［3］。

1.1 奶牛不同生理階段對SARA 易感性的影響

荷斯坦奶牛泌乳期根據(jù)泌乳及營養(yǎng)代謝等因素可劃分為圍產(chǎn)期、泌乳前期、泌乳中期、泌乳后期、干奶期5 個生理階段。 通過總結(jié)各階段SARA發(fā)病率的高低可判斷不同生理階段奶牛對SARA易感性差異。研究發(fā)現(xiàn)美國大約有19%的泌乳早期奶牛和26%的泌乳中期奶牛受到SARA 困擾［3］。Kleen［7］研究發(fā)現(xiàn)， 泌乳早期和泌乳中期奶牛中SARA 的發(fā)病率分別為11%和18%。 荷蘭地區(qū)的圍產(chǎn)期和泌乳前期奶牛SARA 總發(fā)病率為13.8%，而泌乳中期奶牛SARA 發(fā)病率為26%［5，8］，泌乳后期的發(fā)病情況未見報道。 由此可見， 奶牛SARA 高發(fā)病率常在泌乳前期和泌乳中期， 且泌乳中期發(fā)病率較高。 原因可能是泌乳前期與泌乳中期奶牛由干奶階段向泌乳階段過渡， 干物質(zhì)采食量下降， 維持泌乳消耗大量能量導(dǎo)致能量負平衡（negative energy balance，NEB）引起氧化應(yīng)激、代謝紊亂和機體免疫力下降；另一方面，從圍產(chǎn)期到泌乳前期機體能量需求劇增， 為維持所消耗的能量， 供給精料過多， 瘤胃發(fā)酵后產(chǎn)酸量急劇增加，進而引起機體酸堿失衡，導(dǎo)致泌乳前期和泌乳中期發(fā)生SARA， 又因SARA 缺乏癥狀線索與臨床體征延遲出現(xiàn)，再加上檢測困難［3］，導(dǎo)致泌乳中期SARA 發(fā)病率高于泌乳前期。

不同生長階段奶牛對SARA 易感性也存在明顯差異。 有學(xué)者指出，初產(chǎn)牛瘤胃液pH 值較經(jīng)產(chǎn)牛更易降低、瘤胃揮發(fā)性脂肪酸更易積累，更易發(fā)生代謝性酸中毒［9］，但初產(chǎn)與經(jīng)產(chǎn)牛SARA 發(fā)病率的差異尚未見文獻報道。大量研究表明，初產(chǎn)牛較經(jīng)產(chǎn)牛更易出現(xiàn)能量負平衡、 乳房炎、 酮病和SARA，初產(chǎn)牛的高發(fā)病率可能與營養(yǎng)物質(zhì)缺乏和外界應(yīng)激有關(guān)。謝鐵柱［10］通過試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)產(chǎn)牛與初產(chǎn)牛產(chǎn)后舔舐鹽磚次數(shù)、 每日躺臥持續(xù)時間有顯著差異，而產(chǎn)后14 d 內(nèi)患酮病風險和躺臥時間呈線性相關(guān)，躺臥時間每增加1 h/d，患酮病風險升高3.7%［11］， 可見初產(chǎn)牛較經(jīng)產(chǎn)牛更易發(fā)生酮病，出現(xiàn)NEB 進而降低奶牛免疫力，使SARA 的發(fā)生率提高。 經(jīng)產(chǎn)牛舔舐鹽磚次數(shù)及持續(xù)時間顯著高于初產(chǎn)牛［11］，舔舐鹽磚可以促進唾液分泌，唾液中含有的大量碳酸氫鹽和磷酸鹽隨著舔舐下咽過程進入瘤胃，中和發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸，降低經(jīng)產(chǎn)牛SARA 的發(fā)生率。

1.2 奶牛擇食行為以及個體差異對SARA 易感性的影響

規(guī)?；B(yǎng)殖場中，一些奶牛的遺傳背景相同、飼養(yǎng)管理及飼喂模式一致， 但在生產(chǎn)實踐中檢測發(fā)現(xiàn)不同個體對SARA 的敏感性有較大差異。 養(yǎng)殖過程中，因多種因素致使奶牛出現(xiàn)擇食現(xiàn)象，而這一行為很可能導(dǎo)致奶牛對喜食的日糧成分攝入過度，當易發(fā)酵碳水化合物攝入超量時，會減少物理有效中性洗滌纖維 （physically effective neutral detergent fiber，peNDF） 攝入量， 導(dǎo)致瘤胃中VFA大量生成，同時咀嚼行為減少，不能及時中和瘤胃中產(chǎn)生的過多有機酸， 增加動物發(fā)生SARA 的風險［12］。國外有學(xué)者選取18 頭奶牛飼喂精粗比為6∶4的日糧，飼喂第2 周時根據(jù)瘤胃液pH 值是否低于6.0， 將奶牛分成SARA 易感組和耐受組；36 d 飼喂期結(jié)束后，結(jié)果表明易感組進食時間較短，且在早晨進食后咀嚼時間較少， 脂蛋比較耐受組有降低的趨勢， 血清中的羥基丁酸濃度和膽固醇濃度較耐受組低［13］，說明奶牛對高谷物飼喂的敏感性不同， 與咀嚼活動和血脂的變化有關(guān)， 并且發(fā)現(xiàn)SARA 易感奶牛存在擇食行為， 擇食行為和瘤胃液低pH 值存在顯著負相關(guān)，易感型奶牛采食中短粒度飼料越多，瘤胃液pH 值越低［12］，易感型奶牛出現(xiàn)拒絕采食長粒度飼料， 此現(xiàn)象在耐受型奶牛中未發(fā)現(xiàn)［14］。 張濤等［15］將12 頭奶 牛根據(jù) 瘤胃液pH 值高低分成SARA 易感組與耐受組， 結(jié)果表明，2 組荷斯坦奶牛血液和乳中脂肪酸及代謝物組成存在較大差異， 易感組奶牛氨基酸代謝與乳脂合成能力更強，對長鏈脂肪酸的利用效率更低，且乳品質(zhì)降低。 與此同時，易感組奶牛血液中L-苯丙氨酸含量顯著低于耐受組，而L-苯丙氨酸是機體免疫炎癥反應(yīng)的潛在標志物。綜上所述，奶牛的擇食行為以及對SARA 的耐受性差異是其對SARA 易感的重要原因之一。

2 SARA 對奶牛瘤胃功能的影響

瘤胃是反芻動物暫時存儲食糜以及發(fā)酵的最大器官，是前胃系統(tǒng)中的最大組成部分，瘤胃通過瘤胃液以及附著在瘤胃壁上龐大的微生物菌群協(xié)同消化食糜產(chǎn)生大量有機酸， 以供機體利用，因此， 維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和微生物區(qū)系平衡是保證瘤胃功能不受損傷的關(guān)鍵。 SARA 使奶牛瘤胃液pH 值長期低于生理范圍，過酸環(huán)境使內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，菌群發(fā)生改變，進一步影響瘤胃上皮細胞屏障和吸收功能以及上皮結(jié)構(gòu)的完整性。

2.1 對瘤胃微生物菌群變化的影響

瘤胃中含有大量的真菌、細菌、原蟲，其中細菌占比最大。它們彼此共生，負責將食糜進行分解發(fā)酵并轉(zhuǎn)化為VFA、乳酸、二氧化碳、氨和甲烷等發(fā)酵產(chǎn)物供機體進一步吸收代謝。大量研究表明，瘤胃微生物豐度、穩(wěn)定性與多樣性對瘤胃液pH 值具有高度敏感性。 從門水平上看，瘤胃液pH 值下降會降低變形菌門和擬桿菌門細菌的豐度， 而厚壁菌門和放線菌門豐度升高［16］；林波等［17］通過改變泌乳水牛日糧精粗比發(fā)現(xiàn)，日糧精粗比越高，瘤胃中厚壁菌門與放線菌門豐度亦升高， 變形菌門和擬桿菌門豐度降低，這與李子健等［18］的研究結(jié)果一致。 從屬水平上看，SARA 易感組奶牛瘤胃中不動桿菌屬、普雷沃菌屬、厭氧支原體屬、乳桿菌屬、密螺旋體屬及部分未分類細菌豐度降低，雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬、奇異菌屬豐度升高［16］。 Kim等［19］通過飼喂高谷物飼糧使奶?；糞ARA，結(jié)果導(dǎo)致瘤胃中普雷沃菌屬相對豐度降低， 瘤胃微生物多樣性顯著下降， 但也有人發(fā)現(xiàn)SARA 持續(xù)發(fā)生時，部分真桿菌屬豐度增加，使瘤胃中纖維分解被抑制，纖維分解菌如產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌豐度大幅降低， 而普雷沃菌屬、 巨球型菌屬、乳桿菌屬豐度增加［20］。 韓郭皓等［21］研究表明，隨著飼料精粗比提高，SARA 使瘤胃中產(chǎn)乳酸菌如羅氏菌屬相對豐度急劇上升， 導(dǎo)致大量乳酸積累，而革蘭陰性菌如擬桿菌門豐度下降、裂解死亡進而釋放大量內(nèi)毒素加劇瘤胃損傷，SARA 再度加劇。 總體上說，SARA 使奶牛瘤胃微生物豐度，穩(wěn)定性和多樣性顯著降低， 但一些學(xué)者認為，SARA 并不是引起瘤胃微生物區(qū)系失衡的直接原因。 瘤胃微生物菌群失衡受SARA 與瘤胃生理生化狀態(tài)改變和外界因素共同作用， 而其作用機制有待進一步研究。

2.2 對瘤胃上皮細胞相關(guān)因子表達的影響

飼喂大量高能日糧在瘤胃中發(fā)酵， 導(dǎo)致過度蓄積VFA 引起SARA，產(chǎn)生的多數(shù)VFA 被瘤胃上皮細胞吸收，為機體提供70%以上的能量需要。而VFA 如丁酸對瘤胃發(fā)育成熟起顯著促進作用，是瘤胃上皮發(fā)育的主要刺激物， 但丁酸過量會產(chǎn)生毒性，尤其是在SARA 條件下［22］。奶牛瘤胃有機酸水平過高，pH 值低于閾值， 誘發(fā)瘤胃上皮細胞炎癥反應(yīng)，使上皮促炎相關(guān)因子高度表達，奶牛免疫力降低， 引起瘤胃角化不全和上皮損傷。 在VFA被瘤胃上皮吸收過程中，由于上皮受損VFA 的轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達受影響， 與此同時影響瘤胃上皮細胞約65%基因的轉(zhuǎn)錄［23］。

2.2.1 對瘤胃上皮細胞炎性相關(guān)因子表達的影響

Zhang 等［24］通過飼喂奶牛高精料飼糧發(fā)現(xiàn)，奶牛瘤胃液pH 值下降誘發(fā)SARA，使瘤胃中革蘭陰性菌裂解， 釋放大量內(nèi)毒素如游離脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），激發(fā)了瘤胃上皮細胞免疫活性與炎癥反應(yīng)， 使促炎相關(guān)因子如白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）與瘤胃上皮細胞腫瘤壞死因子（TNF-α）表達量上調(diào)。 張瑞陽［25］利用基因芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，SARA 組與非SARA組奶牛瘤胃上皮細胞有245 個基因存在顯著差異， 細胞因子受體與關(guān)聯(lián)通路顯著富集后進一步發(fā)現(xiàn)， 通路中IL-1β、IL-2、IL-22、 趨化因子配體19（C-C motif chemokine ligand 19，CCL19）、CCL8、趨化因子受體1（C-X3-C motif chemokine receptor 1，CX3CR1）、 趨 化 因 子 配 體6 （C-X-C motif chemokine ligand 6，CXCL6）、TNF-α 表 達 水 平 上調(diào)，說明瘤胃上皮細胞發(fā)生局部炎癥反應(yīng)。 相關(guān)性分析還顯示， 瘤胃上皮細胞炎癥因子與pH 值和LPS 呈顯著相關(guān)，且LPS 可明顯上調(diào)瘤胃上皮細胞中IL-1β、IL-2、IL-8、IL-6 的mRNA 相對表達量，pH 值與TNF-α 的mRNA 相對表達量呈顯著負相關(guān)，進而表明機體發(fā)生SARA 時，可引起瘤胃液pH 值降低，并且LPS 誘導(dǎo)上皮細胞產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)。 局部炎癥反應(yīng)可能會導(dǎo)致細菌破壞機體活性氧 （reactive oxygen species，ROS）平衡，造成上皮細胞氧化應(yīng)激，激活多個信號分子 通 路 如 核 因 子κB （nuclear factor-κB，NFκB）、 絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen activated protein kinase，MAPK）、核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2 （nuclear transcription factor E2-associated factor 2，Nrf2），又誘導(dǎo)各種促炎因子如IL-2、TNF-α、IL-6 加劇局部炎癥反應(yīng)［26］，嚴重時可能促使上皮細胞凋亡。 目前關(guān)于SARA 引起瘤胃上皮細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的炎性介質(zhì)相關(guān)研究較少，除內(nèi)毒素外， 組胺是SARA 發(fā)生期間另一種炎性介質(zhì)， 在奶牛中主要是由瘤胃中氨基酸前體物質(zhì)經(jīng)過酶的脫羧反應(yīng)， 或由酮類化合物經(jīng)脫氨基作用產(chǎn)生的， 其本身不易被瘤胃上皮細胞吸收。 飼喂過多高精料引起SARA 發(fā)生時，改變了瘤胃中氨基酸代謝模式，使瘤胃中以組胺為代表的生物胺含量顯著升高［27］，導(dǎo)致上皮細胞自噬受到抑制，有害物質(zhì)累積，進而發(fā)生炎癥反應(yīng)。 范古玥等［28］研究發(fā)現(xiàn)，奶牛瘤胃上皮細胞雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，m-TOR）自噬通路中部分關(guān)鍵蛋白經(jīng)組胺刺激后表達量發(fā)生變化，其中自噬底物（p62）與磷酸化雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，pmTOR）表達量上升，m-TOR、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3 （microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）表達量下降，因此，組胺過多時可抑制m-TOR 自噬通路， 使瘤胃上皮炎癥損傷加重，但m-TOR 自噬通路如何被組胺抑制，造成奶牛瘤胃上皮細胞炎癥因子過表達，還有待深入研究。

2.2.2 對瘤胃上皮細胞VFA 轉(zhuǎn)運相關(guān)因子表達的影響

奶牛瘤胃上皮細胞膜多為鱗片狀結(jié)構(gòu)，SARA使其結(jié)構(gòu)受損，pH 值調(diào)節(jié)能力與對VFA 的吸收利用能力受到嚴重影響。 瘤胃上皮細胞存在大量VFA 的轉(zhuǎn)運蛋白， 其中膜轉(zhuǎn)運蛋白（membrane transporters，MT） 和 單 羧 酸 轉(zhuǎn) 運 蛋 白（monocarboxylic acid transporter，MAT） 能有效保持上皮細胞內(nèi)外的陰陽離子平衡。 王亞洲［29］通過免疫組化法對MT 與MAT 進行定位發(fā)現(xiàn)，其在瘤胃上皮組織中大量分布， 可通過對鈉離子和氫離子耦合調(diào)節(jié)瘤胃酸堿平衡， 當SARA 嚴重時瘤胃上皮組織的MAT 與MT 的mRNA 相對表達量均受到抑制，pH 值降低、 上皮損傷。 調(diào)節(jié)瘤胃上皮細胞吸收VFA 的相關(guān)基因還有腺瘤下調(diào)因子（adenoma downregulation factor，ADF）、 陰離子交換劑2（anion exchange agent 2，AE2）、 假定陰離子轉(zhuǎn)運蛋白1（putative anion transporter protein 1，pAT1）等，有學(xué)者通過添加高能日糧，降低反芻動物瘤胃液pH值后發(fā)現(xiàn)，VFA 升高時其表達量均上調(diào)［30］。也有體外研究發(fā)現(xiàn)，VFA 含量上升時，瘤胃上皮細胞AE2表達量下調(diào)［31］。目前，受SARA 影響的瘤胃上皮細胞對VFA 轉(zhuǎn)運和吸收作用機制并不清楚。

2.3 對瘤胃上皮細胞緊密連接的影響

瘤胃上皮細胞對外界病原菌和毒素的物理抵抗主要因其緊密連接的方式， 緊密連接（tight junction，TJ）主要通過位于基底外側(cè)膜頂端的上皮細胞環(huán)狀結(jié)構(gòu)在瘤胃上皮形成天然屏障。 SARA引起瘤胃中的革蘭陰性菌細胞壁破裂釋放大量內(nèi)毒素，使緊密連接遭受破壞，細胞間隙增大，緊密連接蛋白表達量下調(diào)，棘突層線粒體降解，進一步引起上皮細胞的通透性增大。 有學(xué)者發(fā)現(xiàn)， 增加AMP-激活蛋白激酶 （AMP-activated protein kinase，AMPK）的活性，加速緊密連接組裝，從而加強細胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)，抑制上皮通透性，增強屏障防御機能［32］。劉軍花［33］研究表明，飼喂高谷物日糧后，隨著SARA 不斷加重，山羊瘤胃上皮角質(zhì)化過度，對短鏈脂肪酸的吸收出現(xiàn)障礙，上皮組織中MAPK 信號通路與細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）激活，ERK1/2 磷酸化引起瘤胃上皮細胞緊密蛋白表達量下調(diào)， 從而抑制MAPK 或ERK1/2 信號通路，可緩解對緊密連接的損傷。瘤胃上皮細胞的顆粒層與棘突層的緊密連接對調(diào)節(jié)細胞通透性、防止內(nèi)毒素侵入起重要作用， 但高谷物日糧誘發(fā)SARA 使上皮細胞角質(zhì)化脫落嚴重， 顆粒層厚度顯著降低， 顆粒層與棘突層的細胞間連接緊密性降低， 并且激活瘤胃上皮細胞的局部免疫反應(yīng)，TNF-α、TNF-λ 表達量上調(diào)［33］，這可能會重新調(diào)整緊密連接蛋白的分布使炎癥加重。目前，緊密連接蛋白與炎癥因子互作的分子機制以及緊密連接的通透性變化關(guān)系尚不明確。

3 小結(jié)

SARA 是集約化奶牛養(yǎng)殖中極易發(fā)生的一種營養(yǎng)代謝病。在生產(chǎn)實踐中為了追求高產(chǎn)奶量，飼喂過多精料的現(xiàn)象普遍存在， 從而導(dǎo)致?lián)]發(fā)性脂肪酸在瘤胃過度積累， 超過其代謝水平誘發(fā)SARA。 SARA 病癥具有隱蔽性和滯后性，給養(yǎng)殖企業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。 通過分析奶牛SARA 易感的幾個因素發(fā)現(xiàn)，奶牛在泌乳中期、初產(chǎn)時SARA 發(fā)病率較高， 且由于遺傳背景和飼養(yǎng)模式不同以及擇食行為等因素， 奶牛對SARA 的易感性存在較大差異。此外，探究了SARA 對瘤胃微生物菌群變化、瘤胃上皮功能以及VFA 轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達的影響， 但SARA 奶牛的瘤胃微生物菌群如何與外界環(huán)境進行互作以及如何影響瘤胃上皮基因表達進而影響上皮細胞對VFA 的利用方面的相關(guān)報道較少，需要進一步深入研究。