姚為民，張德清，楊永安*

(1.楚雄師范學(xué)院云南省高校分子光譜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南楚雄 675000;2.楚雄師范學(xué)院光譜應(yīng)用技術(shù)研究所，云南楚雄 675000)

1 引言

近年來(lái)，隨著農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量的提高以及人們對(duì)高品質(zhì)農(nóng)作物的需求，各類農(nóng)藥產(chǎn)品被大面積使用。但農(nóng)藥大多有著強(qiáng)烈的毒性，其毒性哪怕是微量也會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定影響，這極大地增加了人們生產(chǎn)生活中的健康隱患。福美雙作為一種農(nóng)藥合理地使用能夠有效防治稻谷立枯病、馬鈴薯番茄晚疫病、草莓灰霉病等植物疾病，促進(jìn)農(nóng)作物的生長(zhǎng)。但福美雙對(duì)于魚(yú)類有毒且對(duì)人皮膚和粘膜有刺激性，過(guò)多的使用會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境以及人們生活健康產(chǎn)生影響。目前對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法大都屬于化學(xué)方法，存在著前處理復(fù)雜，分析時(shí)間長(zhǎng)，損壞樣品等弊端。所以尋找一種對(duì)福美雙殘留進(jìn)行快速、便捷的檢測(cè)方法就顯得尤為重要。

表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)技術(shù)是一種先進(jìn)的表面分析技術(shù)，能提供吸附分子豐富的結(jié)構(gòu)信息[1]，具有簡(jiǎn)便、高效、高靈敏度的特征，在農(nóng)藥檢測(cè)領(lǐng)域有著很廣闊的應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用SERS技術(shù)已經(jīng)在相關(guān)的農(nóng)藥檢測(cè)領(lǐng)域取得了顯著的成效[2-7]。根據(jù)繆緒超等[8]和歐陽(yáng)杰等[9]對(duì)于疏水性基底的研究，以及Xin-yi Chou等對(duì)于玫瑰花瓣[10]、胡櫻子等對(duì)天然荷葉[1]的表面增強(qiáng)拉曼光譜研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)表面疏水性形成的基底與表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)強(qiáng)弱有著一定的聯(lián)系。植物的結(jié)構(gòu)耦元與化學(xué)耦元協(xié)同作用表現(xiàn)出超疏水性，但就大部分植物而言(如荷葉、玫瑰花等)其生長(zhǎng)大多有階段性，對(duì)用其來(lái)進(jìn)行表面增強(qiáng)基底的制備產(chǎn)生一定的限制。紫竹梅在許多地方(比如云南)一年四季都能生長(zhǎng)且對(duì)環(huán)境要求不高，其葉片在宏觀和納米尺度下具備特殊的表面形貌，可在 165°的靜態(tài)接觸角下表現(xiàn)出超高疏水性[11]。故本文以紫竹梅葉片為基質(zhì)，利用葉片表面的疏水性，通過(guò)滴加納米銀膠溶液形成納米銀膜制備實(shí)驗(yàn)所需的SERS基底，探索一種基底制備簡(jiǎn)單的快速有效檢測(cè)福美雙殘留的方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑

共焦顯微拉曼光譜儀(美國(guó)賽默飛世爾分子光譜產(chǎn)品)、超聲波清洗機(jī)(康潔PS-D30)、去離子純水機(jī)(18.25 MΩ)、紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(TU-1901系列)、離心機(jī)(TGL-16G)、掃描電鏡(美國(guó)FEI Inspect F50)、羅丹明6G(R6G，95%，阿拉丁)、硝酸銀(99.99%，阿拉丁)、檸檬酸三鈉(99%，天津市化學(xué)試劑三廠)、福美雙固體粉末(97%，北京百靈威科技有限公司)、無(wú)水乙醇(99.7%，天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司)、丙酮(99.5%，成都市科龍化工試劑廠)。

2.2 微波法納米銀膠的制備

采用微波加熱法制備納米銀膠[12]，用去離子水配置13 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸鈉溶液和10-3mol/L的硝酸銀溶液500 mL，將二者混合后充分?jǐn)嚢?，放入微波中加?0分鐘，自然冷卻后得到銀膠溶液。對(duì)制備的銀膠溶液進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光吸收光譜表征如圖1所示，從圖1中可以看到制備的銀膠吸收峰的位置為414 nm，吸收峰較單一，說(shuō)明已經(jīng)成功地制備出了銀膠溶液，能夠用來(lái)進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼散射光譜研究。將所制備的銀膠放入離心管中，共十管,每管1 mL，用離心機(jī)對(duì)銀膠進(jìn)行離心(轉(zhuǎn)速為6000 r/min)，離心30分鐘后，用移液槍吸出上清液后，將10管沉積物匯聚到一管并加入去離子水配備為1 mL銀膠濃縮液。將最終得到的1 mL銀膠濃縮液用去離子水按1∶5、1∶10、1∶15稀釋成不同濃度備用。

2.3 紫竹梅葉基底的制備、優(yōu)化及表征

1)紫竹梅葉基底的制備

將紫竹梅葉片上下表面洗干凈(不破壞表面結(jié)構(gòu))，待表面水分干燥后，我們?cè)谄渖舷卤砻娴紊喜煌♂対舛鹊?微升銀膠溶液，由于葉片表面具有超疏水性，使得銀膠以小球的形式靜置(如圖2a所示)，待其蒸發(fā)濃縮后在葉片表面可得到一小塊高濃度銀納米粒子膜即實(shí)驗(yàn)所需的基底(紫竹梅葉基底)。在基底上滴8微升福美雙溶液，該溶液在基底表面收縮成一個(gè)小球形(如圖2b所示)，說(shuō)明所制備的紫竹梅葉基底仍然具有較好的超疏水性。

2)紫竹梅葉基底的表征

通過(guò)掃描電子顯微鏡拍攝的基底的照片如圖3 a-c(5 μm放大)，發(fā)現(xiàn)不同濃度的銀膠疏水濃縮后形成的銀聚合體是分散附著在葉片表層片狀蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)之上，并且銀聚合體在葉片表面的分布是不均勻的。原因是銀膠在干燥過(guò)程中，銀納米粒子是在作無(wú)規(guī)則地劇烈運(yùn)動(dòng)中的，由于受到紫竹梅葉表面片狀物的阻擾，銀納米粒子在間隙處作無(wú)規(guī)則運(yùn)動(dòng)過(guò)程中形成聚合體并隨機(jī)地在表面分布。未被銀粒子覆蓋到的區(qū)域?yàn)樽现衩啡~片的表面蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)，總體呈現(xiàn)出多孔、多片狀。這種結(jié)構(gòu)會(huì)使得液體直接與葉片表面的片狀突起接觸，這時(shí)大量的孔狀結(jié)構(gòu)就充當(dāng)了一層薄薄的空氣層，使得紫竹梅葉片具有超疏水性。銀膠濃度高的基底，銀納米粒子聚合體分布較密，銀膠濃度低的基底，銀納米粒子聚合體分布較稀疏。原因是我們?cè)谧现衩啡~片基底上滴的都是相同體積的8微升銀膠溶液，由于紫竹梅葉片的超疏水性，不同濃度的銀膠溶液在基底表面形成的小球基本上是一樣大的。在相同的區(qū)域內(nèi)，濃度高的銀膠銀納米粒子運(yùn)動(dòng)后隨機(jī)形成的聚合體密度就要大一些。通過(guò)比較圖3 d-e，在1 μm級(jí)別放大下，可以進(jìn)一步看到被覆蓋區(qū)域的銀粒子基本吸附在了片狀突起上和相鄰片狀突起相連中間的間隙處，并且可以看到由于葉片表面的疏水濃縮效應(yīng)，不同濃度銀膠下聚合體的銀粒子排布都很緊密，這使得SERS“熱點(diǎn)”更容易形成。同時(shí)葉片表面的銀膠并沒(méi)有破壞葉片表面原有的微觀結(jié)構(gòu)，這使得紫竹梅葉基底也具有非常好的疏水性，這可以進(jìn)一步地增強(qiáng)樣品的SERS信號(hào)。同時(shí)在三種濃度下的電鏡圖還可看出，圖3d(5倍稀釋)中在紫竹梅葉表面聚合體的銀納米粒子分布更緊密，覆蓋的區(qū)域更大。

圖3 不同稀釋濃度的銀膠制備基底的掃描電鏡圖。a-c：5 μm下稀釋5、10、15倍濃度銀粒子分布；d-f：1 μm下稀釋5、10、15倍濃度銀粒子分布

2.4 探針?lè)肿覴6G與農(nóng)藥福美雙樣品的制備

1)探針?lè)肿覴6G樣品的制備

將羅丹明6G固體粉末(R6G)用去離子水按10-1倍濃度稀釋配置成5×10-9、10-10、10-11、10-12mol/L的四份不同濃度的羅丹明6G溶液。在基底上用移液槍分別滴加8微升不同濃度R6G溶液，待試劑自然干燥后置于共焦顯微Raman光譜儀中進(jìn)行檢測(cè)。R6G作為探針?lè)肿佑脕?lái)探究并優(yōu)化我們所制得的紫竹梅葉基底的SERS增強(qiáng)效果。

2)農(nóng)藥福美雙樣品的制備

將福美雙粉末溶于無(wú)水乙醇制備成5×10-4mol/L溶液，然后用去離子水稀釋到5×10-6、5×10-7、5×10-8mol/L備用。在優(yōu)化后的紫竹梅葉基底上用移液槍分別滴加8微升不同濃度待檢測(cè)溶液，待樣品自然干燥后置于共焦顯微Raman光譜儀中進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 實(shí)驗(yàn)參數(shù)

為了在拉曼光譜檢測(cè)時(shí)減小背景噪音對(duì)檢測(cè)的影響，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜儀信號(hào)采集的積分時(shí)間和曝光次數(shù)在降低背景噪音上有一定的作用，背景噪音強(qiáng)度與積分的時(shí)間成反比，與曝光次數(shù)成正比，綜合考慮后本實(shí)驗(yàn)所有拉曼光譜使用參數(shù)為：10倍物鏡，曝光2秒，累積次數(shù)為10次，激光波長(zhǎng)532 nm，激光功率1.0 mW。

3 結(jié)果與討論

3.1 基底對(duì)R6G探針?lè)肿拥腟ERS分析

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖4中可以看出，在 608 cm-1、1358 cm-1、1507 cm-1、1647 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)的R6G特征峰，次強(qiáng)峰則出現(xiàn)在769 cm-1、1179 cm-1、1309 cm-1、1570 cm-1處。其中1309 cm-1、1358 cm-1、1507 cm-1、1570 cm-1、1647 cm-1處為與苯環(huán)相關(guān)的一系列C=C雙鍵伸縮振動(dòng)峰，1179 cm-1、769 cm-1、608 cm-1處為苯環(huán)的面內(nèi)、面外變形振動(dòng)峰[13]。通過(guò)對(duì)葉片正、反面基底的SERS光譜多次測(cè)試分析，表明葉片正、反面基底都具有很好的增強(qiáng)效果，且正、反兩面的增強(qiáng)情況相差不大。

圖4 紫竹梅葉片正面(a)、反面(b)的SERS光譜(R6G: 5×10-9 mol/L)

圖5為不同稀釋倍數(shù)銀膠基底的SERS光譜, 圖6為不同濃度銀膠基底在608 cm-1、1358 cm-1、1507 cm-1處的拉曼強(qiáng)度比較。根據(jù)圖5和圖6可以看到隨著銀膠稀釋倍數(shù)的增大，銀膠基底對(duì)于探針?lè)肿覴6G的SERS信號(hào)會(huì)逐漸減弱。在稀釋了5倍的情況下有著更好的信號(hào)增強(qiáng)效果，并且在測(cè)試過(guò)程中能夠找到更多的增強(qiáng)區(qū)域。這與圖3基底的表面形貌是相吻合的，在5倍稀釋下銀粒子的覆蓋面積更廣，銀納米粒子濃縮地更緊密，使得容易形成更多的“熱點(diǎn)”。

圖5 不同稀釋倍數(shù)紫竹梅葉基底的SERS光譜(R6G: 5×10-9 mol/L)

圖6 不同濃度銀膠基底對(duì)于幾個(gè)特征峰的增強(qiáng)比較

圖7為R6G不同稀釋濃度的SERS光譜，根據(jù)圖7的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不難看出，當(dāng) R6G濃度稀釋到5×10-11mol/L時(shí)，仍然能看到明顯的R6G特征峰，說(shuō)明所制備的紫竹梅葉基底能夠檢測(cè)分析物到很低的濃度，是一種增強(qiáng)效果非常好的SERS基底。

圖7 不同濃度R6G的SERS光譜(A 5×10-9,B 5×10-10,C 5×10-11 mol/L)

3.2 福美雙固體粉末的拉曼光譜分析

取微量的福美雙固體粉末置載玻片上放入拉曼光譜儀中進(jìn)行光譜檢測(cè)，所得結(jié)果如圖8所示，可觀察到其主要特征峰出現(xiàn)在 396 cm-1、561 cm-1、976 cm-1、1373 cm-1處，并且在180 cm-1、317 cm-1、363 cm-1、444 cm-1、853 cm-1、1045 cm-1、1092 cm-1、1150 cm-1、1240 cm-1、1400 cm-1、1460 cm-1處也都有明顯的次強(qiáng)峰。根據(jù)郭昆等[14]文獻(xiàn)，其各峰歸屬如表1所示。

圖8 福美雙固體粉末的拉曼光譜

3.3 福美雙溶液的SERS光譜檢測(cè)與分析

將制備好的不同濃度福美雙樣品放入拉曼光譜儀中進(jìn)行光譜分析，所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示(圖中A、B、C、D檢測(cè)濃度依次為5×10-5、5×10-6、5×10-7、5×10-8mol/L)，由圖9可明顯看出，在5×10-8mol/L限度內(nèi)，光譜中438 cm-1、557 cm-1、931 cm-1、1036 cm-1、1140 cm-1、1376 cm-1、1438 cm-1、1504 cm-1處均有明顯福美雙的特征峰。通過(guò)對(duì)比福美雙固體粉末的特征峰(見(jiàn)表1)，發(fā)現(xiàn)樣品實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與固體本身數(shù)據(jù)存在著一定范圍內(nèi)的差別，這是由于SERS檢測(cè)是對(duì)依附在基底表面的福美雙分子散射所產(chǎn)生的光譜進(jìn)行采集，基底上的銀納米顆粒并不是完全均勻和一致的，使得銀納米顆粒對(duì)福美雙分子吸附時(shí)其結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的改變，以至于檢測(cè)得到的特征峰相較于固體特征峰出現(xiàn)一定的差異。

表1 福美雙固體粉末光譜和SERS光譜的特征峰及其歸屬

圖9 不同濃度福美雙的SERS光譜(A 5×10-5,B 5×10-6,C 5×10-7,D 5×10-8 mol/L)

由圖9可知，在福美雙濃度低至5×10-8mol/L時(shí)位于557 cm-1、1036 cm-1、1376 cm-1、1438 cm-1和1504 cm-1處仍能夠看到很明顯的特征峰。說(shuō)明所制備的紫竹梅葉基底對(duì)福美雙的檢測(cè)濃度可以到5×10-8mol/L。低于最新國(guó)標(biāo)(2021年)福美雙濃度為0.1 mg/kg(4.16×10-7mol/L)的最大殘留限量。說(shuō)明該基底可作為福美雙農(nóng)藥殘留一種快速有效的檢測(cè)方法。

4 結(jié)論

本文用紫竹梅葉片來(lái)制作SERS基底，相較于用其它具有超疏水性的植物，紫竹梅一年四季都能生長(zhǎng)，且用微波法制備的銀膠長(zhǎng)期保存都是比較穩(wěn)定的，方便長(zhǎng)期都能用二者來(lái)制作大量的基底。由于紫竹梅葉片及其制備的基底都有很好的超疏水性，因此所制備的紫竹梅葉片基底對(duì)于拉曼信號(hào)具有很好的增強(qiáng)效果。實(shí)驗(yàn)得到對(duì)于探針?lè)肿覴6G的檢測(cè)濃度可達(dá) 5×10-11mol/L。對(duì)不同稀釋濃度的銀膠制備的基底進(jìn)行了分析，得到銀膠濃度對(duì)基底表面形貌及增強(qiáng)效果有一定的影響，稀釋了5倍的銀膠溶液在紫竹梅葉片疏水濃縮效應(yīng)作用下形成的基底具有更多的 “熱點(diǎn)”，增強(qiáng)效果更佳。這結(jié)論與電鏡照片得到的基底表面形貌是相互印證的。利用稀釋5倍的銀膠基底對(duì)福美雙進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)限度可達(dá)到5×10-8mol/L，低于國(guó)標(biāo)對(duì)于福美雙的最大殘留限量，能夠?qū)ΩＣ离p殘留進(jìn)行快速有效地檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)方法的基底制備沒(méi)有特殊的要求，在一般的實(shí)驗(yàn)室中就能完成，便于在各個(gè)地方實(shí)施和應(yīng)用。