尹夢(mèng)穎，王 穎，戴玙格，李歡歡，范文瑩

（湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北襄陽(yáng) 441053）

0 引言

咖啡因（C8H10N4O2）是一種甲基黃嘌呤的生物堿，其化學(xué)名是1,3,7 -三甲基黃嘌呤或3,7 -二氫-1,3,7 -三甲基-1H -嘌呤-2,6 -二酮，可以從茶葉、咖啡果等植物中提煉而得，也可以通過化學(xué)合成進(jìn)行制備[1-3]。適量使用咖啡因可以起到祛除疲勞、興奮神經(jīng)的作用，在臨床上常用來(lái)治療神經(jīng)衰弱、昏迷復(fù)蘇的癥狀。但是，大劑量或長(zhǎng)期使用咖啡因會(huì)損害肝、胃、腎等內(nèi)臟器官，誘發(fā)呼吸道炎癥、婦女乳腺瘤等疾病，并且易引發(fā)成癮性，一旦停止使用就會(huì)出現(xiàn)精神萎頓、渾身乏軟等各種戒斷癥狀，甚至導(dǎo)致吸食者下一代智力低下、肢體畸形等嚴(yán)重問題[1]。因此，咖啡因被列為受國(guó)家管制的精神藥品[4]?？Х纫虻臄z入量可分為以下等級(jí)：成人每天攝入80～250 mg 咖啡因（1.1～3.5 mg/kg·d-1）為低攝入量，300～400 mg（4～6 mg/kg·d-1）為中攝入量，超過500 mg（7 mg/kg·d-1）為高攝入量[5-7]。

茶葉是中國(guó)傳統(tǒng)飲品，品種產(chǎn)地各不相同，咖啡因含量也存在差別。由于茶葉中咖啡因的攝入主要通過開水浸泡溶出，因此沖泡次數(shù)對(duì)茶葉中咖啡因的釋放量存在影響，研究泡茶過程對(duì)茶水中咖啡因釋放量的影響對(duì)健康飲茶具有重要意義。高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的色譜分離技術(shù)，根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離，具有高柱效、速度快、分辨率高、靈敏度高、柱子可反復(fù)使用、樣品量消耗少、易回收等優(yōu)點(diǎn)[8-16]。

因此，以保康產(chǎn)地綠茶為研究對(duì)象，建立了高效液相色譜分析方法用于研究泡茶過程對(duì)?？诞a(chǎn)地茶葉中咖啡因釋放量的影響。對(duì)高效液相色譜分離檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化考查，并對(duì)分析性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，將其用于考查泡茶過程對(duì)咖啡因釋放量的影響，從而為健康泡茶飲茶提供建議。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

?？挡枞~，產(chǎn)自湖北省襄陽(yáng)市?？档貐^(qū)；咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品，南京森貝伽生物科技有限公司提供；甲醇（色譜純）、乙酸（分析純），西隴科學(xué)股份有限公司提供；超純水。

準(zhǔn)確稱取10.0 mg 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解定容至10 mL，配制為1 000 mg/L 的咖啡因母液，置于-4 ℃中冰箱冷藏備用。不同濃度的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液均由1 000 mg/L 咖啡因母液經(jīng)超純水逐級(jí)稀釋定容而得。

1.2 儀器及設(shè)備

LC-20ADXR 型高效液相色譜儀，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；AL204 型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；KQ-500E 型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；便攜真空泵，武漢恒信世紀(jì)科技有限公司產(chǎn)品。

燒杯、玻璃棒、容量瓶、量筒、移液槍、稱量紙、0.45 μm 微孔濾膜、砂芯過濾裝置、注射器等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 高效液相色譜條件優(yōu)化

選擇ODS-C18型反相柱（4.6 mm×150.0 mm，5 μm）為分離色譜柱，甲醇∶0.05%乙酸水溶液的混合溶液為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)器為SPD-M20A 紫外檢測(cè)器，進(jìn)樣量20 μL。分別對(duì)流動(dòng)相比例和檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行優(yōu)化，選擇對(duì)咖啡因分離檢測(cè)的最優(yōu)條件。

2.2 方法分析性能研究

在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，計(jì)算信噪比為3 時(shí)的咖啡因濃度，即為方法檢出限（LOD）。通過高效液相色譜法檢測(cè)重復(fù)檢測(cè)相同咖啡因樣品，計(jì)算咖啡因峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD，n=7），即為方法重現(xiàn)性。根據(jù)咖啡因濃度和峰面積的線性關(guān)系繪制擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性范圍、線性方程與線性相關(guān)系數(shù)R2。對(duì)茶水樣品進(jìn)行咖啡因加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率，考查方法的準(zhǔn)確性。

2.3 茶水樣品的制備

根據(jù)大眾飲茶習(xí)慣，稱取1 g 干燥的保康茶葉樣品（精確至0.001 g），加入50 mL 沸水，浸泡5 min后收集第一道茶水；繼續(xù)加入50 mL 沸水，浸泡5 min后收集第二道茶水，依次類推收集每次的茶水，并標(biāo)記對(duì)應(yīng)沖泡次數(shù)。取1 mL 茶水，加入20%的甲醇水溶液，定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后用高效液相色譜分離檢測(cè)。通過工作曲線法計(jì)算茶水中的咖啡因含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件的優(yōu)化

3.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在不同檢測(cè)波長(zhǎng)條件下對(duì)0.5 mg/L 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為270，275，280，286 nm。

檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)咖啡因峰面積的影響見表1。

表1 檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)咖啡因峰面積的影響

由表1 可知，檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm 時(shí)的咖啡因峰面積最大，說明此波長(zhǎng)下咖啡因信號(hào)響應(yīng)最強(qiáng)，因此選擇275 nm 為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.1.2 流動(dòng)相的選擇

考查流動(dòng)性中甲醇和0.05%乙酸水溶液的體積比分別為20∶80，25∶85 和30∶70 時(shí)的色譜分離效果。

流動(dòng)相構(gòu)成對(duì)咖啡因保留時(shí)間的影響見圖1。

圖1 流動(dòng)相構(gòu)成對(duì)咖啡因保留時(shí)間的影響

由圖1 可知，甲醇和0.05%乙酸水溶液的體積比對(duì)咖啡因保留時(shí)間及峰形具有明顯影響。隨著流動(dòng)相中甲醇比例的增加，咖啡因的保留時(shí)間逐漸提前，且峰寬更窄。因此，選擇甲醇和0.05%乙酸水溶液的體積比為30∶70 作為流動(dòng)相。

3.2 方法分析性能評(píng)價(jià)

3.2.1 方法檢出限

將配制好的咖啡因母液分別用超純水稀釋到0.025，0.035，0.050，0.075，0.500 mg/L，在3.1 以優(yōu)化好的色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)。最優(yōu)色譜條件為選擇ODS-C18柱(4.6 mm×150.0 mm，5 μm) 為分離色譜柱，甲醇∶水∶乙酸體積比30∶70∶0.05 的混合溶液為流動(dòng)相，SPD-M20A 紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。計(jì)算不同咖啡因濃度下的儀器信噪比，其中儀器信噪比接近等于3 時(shí)的咖啡因濃度即為儀器檢出限（LOD），即0.028 mg/L。

3.2.2 方法精密度

配制質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣7 次，計(jì)算峰面積RSD為0.54%。取第一道茶水樣品，在最優(yōu)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣7 次，計(jì)算峰面積RSD 值為0.28%。

方法精密度考查見表2。

表2 方法精密度考查

表2 結(jié)果所示，該方法對(duì)咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品及實(shí)際樣品均有很好的檢測(cè)精密度，重復(fù)進(jìn)樣的結(jié)果誤差小。

3.2.3 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸

將咖啡因母液分別用超純水稀釋到0.05，0.20，0.50，2.00，5.00，20.00，50.00，100.00，200.00 mg/L，根據(jù)咖啡因質(zhì)量濃度和色譜峰面積繪制擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2 可知，方法線性方程為Y=72 441X-1 122.4，線性范圍為0.10～200 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 2。由此可見，在線性范圍內(nèi)，咖啡因的質(zhì)量濃度和峰面積具有良好的線性關(guān)系。

3.2.4 咖啡因加標(biāo)回收試驗(yàn)

為考查該方法用于實(shí)際樣品分析的準(zhǔn)確性，對(duì)茶水樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)。加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為2.0，5.0，10.0 mg/g。

加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可知，3 個(gè)加標(biāo)質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的咖啡因回收率在94.30%～111.50%，可以滿足茶水實(shí)際樣品檢測(cè)對(duì)準(zhǔn)確度的要求。

3.3 沖泡過程對(duì)咖啡因釋放量影響

參考大眾日常飲茶習(xí)慣，模擬茶葉沖泡過程，通過工作曲線法對(duì)每次茶水中的咖啡因含量進(jìn)行測(cè)定。

沖泡過程對(duì)茶水中咖啡因含量的影響見表4。

表4 沖泡過程對(duì)茶水中咖啡因含量的影響

由表4 可知，每次經(jīng)沸水浸泡的茶水中均有咖啡因釋放，且每次釋放量約為上一次的50%，通過計(jì)算可知1 g 保康產(chǎn)地綠茶中咖啡因總釋放量為36.85 mg。按照成人咖啡因的攝入量等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可知，為避免過量攝入咖啡因造成健康危害，成人每天取?？稻G茶2.2～6.8 g 泡飲（即成人每天攝入80～250 mg 咖啡因?yàn)榈蛿z入量），盡量不超過13.6 g（即咖啡因超過500 mg 為高攝入量）。此外，還可以通過棄去第一道茶水的方式避免咖啡因的過量攝入。

4 結(jié)論

建立了高效液相色譜法用于?？稻G茶沖泡過程對(duì)咖啡因釋放量的影響研究。通過優(yōu)化色譜條件，建立檢出限低、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確的高效液相色譜用于茶水中咖啡因的檢測(cè)，并對(duì)沸水沖泡過程的咖啡因釋放量變化進(jìn)行考查。通過模擬大眾飲茶習(xí)慣，對(duì)每次沖泡的茶水進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茶水中咖啡因的釋放量逐次減半，基于此可為飲茶方式和飲茶量提出合理健康的建議。