曹剛剛，冀利峰，徐芳芳，李宣衡，曾化偉

（1.安徽養(yǎng)生天下生物科技有限公司，安徽亳州 236831；2.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽淮北 235000）

食用酵素是采用動(dòng)物、植物、菌類等作為原料，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的具有多種生物活性成分的對(duì)人體健康有益的發(fā)酵食品[1]。酵素的產(chǎn)品形式多樣，包括液體、粉體、膏體、顆粒、片劑、膠囊等[2]。固體酵素產(chǎn)品多經(jīng)液態(tài)發(fā)酵，經(jīng)過(guò)噴霧或者冷凍干燥獲得酵素粉，再經(jīng)過(guò)不同的工藝加工成各種產(chǎn)品[3]。

酵素發(fā)酵是一個(gè)微生物共生的系統(tǒng)，涉及酵母、乳酸菌和醋酸菌等多種菌種[4]，因此是一個(gè)復(fù)雜的微生物共生系統(tǒng)[5-7]。醋桿菌屬（Acetobacter）的細(xì)菌常出現(xiàn)在花、果、蜜蜂、葡萄酒、蘋果酒、醋、“紅茶菌”及“納豆”中[8-11]，為非運(yùn)動(dòng)性的專性好氧性細(xì)菌，能在2%～11%醋酸的強(qiáng)酸性條件下氧化乙醇產(chǎn)生醋酸[12]。醋酸桿菌與醋酸發(fā)酵中的有機(jī)酸等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化有關(guān)，對(duì)于風(fēng)味物質(zhì)的形成至關(guān)重要[13-16]。研究報(bào)道在鎮(zhèn)江香醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，醋酸桿菌與56 種風(fēng)味的產(chǎn)生相關(guān)，和乙酸-2-苯乙酯、糠醛、苯甲醛、3 -羥基-2 -丁酮和3 -乙酸-2 -丁酮含量呈正相關(guān)，也與揮發(fā)性酯類、雜環(huán)芳香物、谷氨酸、亮氨酸、纈氨酸和丙氨酸含量的變化有關(guān)[17]。乳桿菌屬（Lactobacillus）廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵，除能產(chǎn)生乳酸及改善產(chǎn)品風(fēng)味及質(zhì)構(gòu)外[18-20]，還能產(chǎn)生潛在降膽固醇、抗糖尿病、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)功能的代謝產(chǎn)物及胞外多糖[21]?！昂笊敝傅氖且嫔?jīng)加工處理后的益生菌代謝物成分統(tǒng)稱，包括菌體與代謝產(chǎn)物[22]。事實(shí)上，一些乳桿菌即使被滅活也能發(fā)揮促進(jìn)健康的作用。這些化合物包括改善乳糖消化的β -半乳糖苷酶、γ -氨基丁酸、共軛亞油酸、生物活性肽、酚類化合物等[23]。

酵素釀造過(guò)程中，乳酸菌發(fā)酵并且積累乳酸是這個(gè)發(fā)酵工藝的核心關(guān)鍵，對(duì)產(chǎn)品成分、產(chǎn)品風(fēng)味和發(fā)酵進(jìn)程都有顯著影響[24-26]。如果乳酸菌不能在合適條件下深度發(fā)酵，勢(shì)必造成底物大量發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙醇，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為乙酸，造成醋酸大量積累，導(dǎo)致最終產(chǎn)品總酸過(guò)高，而且乙酸占比過(guò)高[27]。產(chǎn)品風(fēng)味尖酸刺激，感官體驗(yàn)差。因此，選擇多種原料和培養(yǎng)基質(zhì)，模擬不同的發(fā)酵條件（不同溫度、通風(fēng)條件、接種程序）進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程的監(jiān)控，以期建立乳酸強(qiáng)化、總酸降低、風(fēng)味優(yōu)良的酵素發(fā)酵工藝。

1 材料和方法

1.1 材料

釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae（市售）、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum（實(shí)驗(yàn)室貯藏）、巴斯德醋酸桿菌Acetobacter pasteurianus（實(shí)驗(yàn)室貯藏）；蘋果、梨、黃瓜、胡蘿卜、山楂，均為市售。

葡萄糖、磷酸、磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、酚酞等，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；乙腈、甲醇、冰乙酸，均為色譜純，DL-乳酸AR（85%～90%），上海麥克林生化科技有限公司提供。

DNS 試劑：稱取3,5 -二硝基水楊酸10 g，置于600 mL 水中，逐漸加入氫氧化鈉10 g，在50 ℃水浴中磁力攪拌溶解，再依次加入酒石酸甲鈉200 g、重蒸苯酚2 g 和無(wú)水亞硫酸鈉5 g，待全部溶解并澄清后，冷卻至室溫，用水定容至1 000 mL，過(guò)濾。貯存于棕色試劑瓶中，于暗處放置7 d 后使用。

1.2 培養(yǎng)基

（1）酵母菌種子培養(yǎng)基。葡萄糖10 g/L，新鮮馬鈴薯200 g/L。

（2）醋酸菌種子培養(yǎng)基。葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L、pH 值5.5。

（3）植物乳桿菌培養(yǎng)基（標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基）。蛋白陳10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水至1 000 mL。校正pH 值6.2，分裝后于121 ℃下高壓滅菌15～20 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 殘?zhí)堑臏y(cè)定

配制不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，與DNS試劑反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品液適當(dāng)稀釋，使糖質(zhì)量濃度為0.1～1.0 mg/mL，取稀釋后的糖液1.0 mL 于15 mL 刻度試管中，加DNS 試劑2.0 mL，沸水煮沸2 min，冷卻后用水補(bǔ)足到15 mL 刻度，于波長(zhǎng)540 nm 處測(cè)定光密度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出葡萄糖數(shù)（mg/mL），根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出樣品中糖含量。

1.3.2 生物量的測(cè)定

菌體生長(zhǎng)的測(cè)定：吸取0.2 mL 待測(cè)液，加入0.25 mol/L HCl 溶液或蒸餾水5 mL，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)光密度值，OD 值與菌體干重和活菌數(shù)均有一定的相關(guān)性。因此，OD 值是一種十分簡(jiǎn)便的表示菌體生長(zhǎng)狀況的參數(shù)。

1.3.3 總酸含量的測(cè)定

取發(fā)酵液1 mL，用去離子水稀釋10 倍，以0.1%酚酞為指示劑，0.10 mol/L NaOH 滴定至變色，計(jì)算總酸含量（以乳酸計(jì)）。

1.3.4 有機(jī)酸含量的測(cè)定

（1）色譜條件。Waters UPLC 超高效液相色譜儀，色譜分離柱：Waters AQ-C18色譜柱（1.9 μm，2.1 mm×150 mm）；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：20 mmol/L pH 值2.2 磷酸鹽緩沖液；柱溫40 ℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

流動(dòng)相組成見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相組成

（2）超高效液相檢測(cè)樣品的制備。取酵素樣品1.5 mL，經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾處理后，裝入標(biāo)記好的進(jìn)樣瓶備用。

（3）外標(biāo)工作曲線的確定。

外標(biāo)工作曲線見(jiàn)表2。

表2 外標(biāo)工作曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件下植物乳桿菌純培養(yǎng)情況

不同培養(yǎng)條件下植物乳桿菌純培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同培養(yǎng)條件下植物乳桿菌純培養(yǎng)結(jié)果

由圖1 可知，植物乳桿菌在12 h 后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在30 ℃下培養(yǎng)的生物量高于37 ℃。不同溶氧條件下生物量沒(méi)有顯著差異，由于植物乳桿菌為兼性厭氧型乳酸菌。因此說(shuō)明在靜置發(fā)酵體系和有攪拌通風(fēng)的發(fā)酵體系中，都可以進(jìn)行發(fā)酵積累乳酸。與生物量相反的是，37 ℃培養(yǎng)相比30 ℃培養(yǎng)乳酸的積累量更多，但差距不大。同樣溫度條件下，靜置培養(yǎng)比搖瓶培養(yǎng)更有利于乳酸發(fā)酵?？紤]到酵素釀造的實(shí)際情況及能耗等，優(yōu)先選擇30 ℃作為后續(xù)發(fā)酵條件。

2.2 采用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基不同混菌發(fā)酵工藝下總酸、乳酸、乙酸和殘?zhí)呛壳闆r

在明確了植物乳桿菌的發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究不同工藝條件下，3 種典型酵素釀造微生物協(xié)同發(fā)酵的不同工藝。

項(xiàng)目中比較的幾種混合菌種發(fā)酵工藝見(jiàn)表3。

表3 項(xiàng)目中比較的幾種混合菌種發(fā)酵工藝

以實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基為基質(zhì)不同混菌發(fā)酵工藝下總酸、乳酸、乙酸和殘?zhí)呛恳?jiàn)圖2。

圖2 以實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基為基質(zhì)不同混菌發(fā)酵工藝下總酸、乳酸、乙酸和殘?zhí)呛?/p>

由圖2 可知，工藝1 和工藝2 的產(chǎn)酸水平最高，其中工藝2 的總酸含量最高，達(dá)到22.6 g/L。工藝1的總酸中乙酸占比達(dá)到60%且乳酸含量較低，醋味重，感官刺激性較強(qiáng)，風(fēng)味不協(xié)調(diào)。工藝3、工藝4、工藝5 均采用第二或者第三階段接種醋酸菌，此三者產(chǎn)酸水平均較低，不足15 g/L。尤其是工藝4，總酸中乳酸占比最低，風(fēng)味也最差。

工藝2、工藝3 及工藝5 的乳酸占比較高。這3 種工藝的共同點(diǎn)是在第一階段接種植物乳桿菌。推測(cè)起始培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)豐富，含有蛋白胨等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較多，各微生物生長(zhǎng)較好，尤其植物乳桿菌生長(zhǎng)和積累乳酸的量都較多。

5 種發(fā)酵工藝的殘?zhí)嵌疾欢?，范圍?.1～1.4 g/L。由圖2 可見(jiàn)在發(fā)酵后期接種醋酸菌有利于培養(yǎng)基中碳水化合物的完全利用。工藝2 采用了2 次接種植物乳桿菌，殘?zhí)呛孔畹汀?/p>

2.3 以混合果蔬汁為基質(zhì)的不同混菌發(fā)酵工藝下總酸、乳酸、乙酸和殘?zhí)呛?/h3>

采用原料比例為蘋果、梨、黃瓜、胡蘿卜、山楂的質(zhì)量比例為3∶2∶1∶3∶1，打漿后按照30%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)加水稀釋，加入適量葡萄糖調(diào)整果蔬汁的糖度至10 °Brix，發(fā)酵總時(shí)間為10 d。

可以發(fā)現(xiàn)，在植物性原料中，由于蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較少，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基差距顯著。采用果蔬汁作為主要發(fā)酵基質(zhì)，5 種工藝產(chǎn)酸水平都更高。同樣，工藝1 和工藝2 總酸相對(duì)更高，但是總酸中乳酸的占比相較標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基更低，發(fā)酵液刺激性更強(qiáng)，風(fēng)味不佳。但是工藝5，既在發(fā)酵前期接種乳酸菌可以強(qiáng)化乳酸發(fā)酵，后期再依次進(jìn)行酵母和醋酸菌發(fā)酵的工藝會(huì)顯著提高發(fā)酵液中乳酸的含量，發(fā)酵液的氣味和感官品質(zhì)最佳。

以混合果蔬汁為基質(zhì)在不同混菌發(fā)酵工藝下總酸、乳酸、乙酸和殘?zhí)呛恳?jiàn)圖3。

圖3 以混合果蔬汁為基質(zhì)在不同混菌發(fā)酵工藝下總酸、乳酸、乙酸和殘?zhí)呛?/p>

3 結(jié)論

酵素發(fā)酵制備過(guò)程涉及多種微生物，產(chǎn)生多種對(duì)產(chǎn)品感官風(fēng)味有影響的有機(jī)酸、醇類、氨基酸和酯類[28]，特別是有機(jī)酸的含量和組成，對(duì)于酵素的感官品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用，酵素發(fā)酵通常會(huì)產(chǎn)生草酸、檸檬酸、蘋果酸、乙酸、乳酸[29]。對(duì)于人體來(lái)說(shuō)，乳酸是機(jī)體正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生的代謝物，從外界攝入適量的乳酸能夠刺激胃液分泌，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，避免體內(nèi)毒素堆積，抑制有害菌生長(zhǎng)，維持腸道菌群的平衡[30]。蘋果酸能夠參與人體新陳代謝和能量轉(zhuǎn)化，有助于代謝的正常運(yùn)行，可以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在人體內(nèi)吸收與代謝，包括乙酸、丙酸在內(nèi)的短鏈脂肪酸，對(duì)人體腸黏膜屏障的維持、腸道動(dòng)力的調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤效應(yīng)等具有重要作用，對(duì)腸道疾病的預(yù)防與治療有十分重要的研究?jī)r(jià)值[31]。

通過(guò)研究了不同的工藝條件對(duì)酵素發(fā)酵感官品質(zhì)的影響，特別是有機(jī)酸的變化，發(fā)現(xiàn)不同的溫度，即30 ℃和37 ℃發(fā)酵，對(duì)生物量和發(fā)酵產(chǎn)酸影響較小，靜置發(fā)酵相對(duì)搖瓶發(fā)酵更有利于發(fā)酵產(chǎn)酸，同樣對(duì)生物量和有機(jī)酸的組成影響較小，實(shí)際發(fā)酵過(guò)程為保證發(fā)酵體系均勻，可以采用間歇振蕩的方式，發(fā)酵接種工序的設(shè)置是造成有機(jī)酸組成變化的最大影響因素，也導(dǎo)致酵素風(fēng)味的巨大改變，5 種發(fā)酵工藝中，工藝1 和工藝2 在發(fā)酵第一階段接種醋酸菌，發(fā)酵產(chǎn)總酸最多，但是風(fēng)味不佳；工藝3 和工藝5均在第一階段接種植物乳桿菌，發(fā)酵總酸相對(duì)較少而乳酸比例較高，其中工藝1 總酸最高而乳酸占比最低，風(fēng)味刺激性最差，工藝5 總酸最低而乳酸含量最高，乳酸的占比也最高，味道豐滿、厚重、刺激感較少。

在酵素的實(shí)際生產(chǎn)中，第一階段接種植物乳桿菌進(jìn)行乳酸發(fā)酵對(duì)無(wú)菌環(huán)境要求較高，容易染菌，需要在操作和原料滅菌的環(huán)節(jié)提高操作水平和無(wú)菌程度，需要制定詳細(xì)的操作規(guī)范。接種醋酸菌的功能之一在于轉(zhuǎn)化無(wú)氧發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇，但是醋酸菌的代謝活動(dòng)會(huì)消耗乳酸，因此乳酸菌發(fā)酵積累的乳酸保持到發(fā)酵結(jié)束需要在一定程度上壓制醋酸菌的代謝活力[32]。在發(fā)酵控制上可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件進(jìn)行有效控制，相關(guān)的詳細(xì)工藝條件還需進(jìn)一步深入研究。