宋 歌，夏 嬌，肖 強*

(1.湖北民族大學 林學園藝學院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000)

目前已有大量關(guān)于黃精化學成分的研究，其主要化學成分包括甾體皂苷類、多糖類、黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油等[3]，具有增強免疫、降血糖、保肝、抗腫瘤、抗炎等作用[4].已有關(guān)于湖北黃精根部皂苷成分生物活性的研究[5-6]，但針對湖北黃精葉片揮發(fā)油成分的研究仍較少.因此本研究選取湖北黃精葉片作為研究對象，能對湖北黃精植株不同部位揮發(fā)油成分及特性的研究進行補充.

揮發(fā)油常見的提取方法有水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2萃取法、超聲波輔助提取法、同時蒸餾萃取法等[7].其中，同時蒸餾萃取法是將含有樣品組分的水蒸氣和萃取溶劑蒸汽混合、冷凝，通過反復循環(huán)實現(xiàn)高效萃取[8]；此方法操作簡便，設(shè)備簡單，具有良好的重現(xiàn)性和較高的萃取率[9].超臨界CO2萃取法使用超臨界流體作溶劑，能對溫度和壓力均高于臨界點的流體進行物質(zhì)提取和分離[10]，具有防止氧化、熱解及保持生物活性等優(yōu)點.本文將利用這2種方法中提取介質(zhì)和作用機理的不同，對比分析2種提取方式在所提取成分的組成、抗氧化活性方面的影響，以探索相對更具優(yōu)勢的提取方式，為湖北黃精生產(chǎn)中葉片副產(chǎn)物的深入研究及開發(fā)利用提供依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 實驗材料與試劑

實驗樣品產(chǎn)自湖北省恩施市高橋壩基地，為種植4～5 a的無病斑無蟲害湖北黃精新鮮葉片，于2021年10月初采集，先在陰涼處室溫干燥，之后低溫粉碎備用.

實驗試劑包括石油醚、無水硫酸鈉、抗壞血酸(Vc)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、無水乙醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、過硫酸鉀、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS).

1.2 實驗儀器

包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司，6890N-5975C)、快速低溫冷卻循環(huán)機(寧波新芝生物科技股份有限公司，DKL-5010)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA)、紫外-可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司，TU-1901).

2 實驗方法

2.1 湖北黃精葉片揮發(fā)油的2種提取方法

同時蒸餾萃取法：將湖北黃精葉片粉末置于同時蒸餾萃取裝置中，加入去離子水，加熱保持溶液沸騰；裝置另一端連接裝有石油醚的圓底燒瓶，并連接快速低溫冷卻循環(huán)機，將溫度設(shè)置為40 ℃，提取6 h，取出；接著去除餾出液中的殘余水分并濃縮，用棕色瓶收集后密封并放入冰箱，4 ℃條件下保存?zhèn)溆?

(2)培養(yǎng)基。菌株CEH-ST79的保存、活化及發(fā)酵采用ATCC213 改良培養(yǎng)基[7]，馬鈴薯干腐病病原菌的培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基[9]。

超臨界CO2萃取法：稱取300 g湖北黃精葉片粉末置于超臨界萃取罐中.設(shè)置萃取條件為：35 ℃，3 500 psi，靜態(tài)萃取3 h，動態(tài)萃取3 h；收集萃取后的揮發(fā)油，放入冰箱并在4 ℃條件下保存?zhèn)溆?

2.2 湖北黃精葉片揮發(fā)油GC-MS條件及成分分析

2.2.1 氣相色譜條件 色譜柱柱溫為70 ℃，進樣口溫度為280 ℃，柱內(nèi)載氣流量為60 mL/min，載氣為高純He.升溫程序為：從70 ℃開始保持2 min；以10 ℃/min的速度升至255 ℃，保持25 min；再以10 ℃/min的速度升至270 ℃，保持5 min.

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用EI離子源(電子轟擊源)，電離電壓為70 eV，離子源溫度為230 ℃，質(zhì)量范圍為30～550 AMU.

2.2.3 定性和定量分析 將實驗得到的質(zhì)譜圖用NIST標準質(zhì)譜庫進行分析，通過與標準圖譜對照，得出2種方法提取的揮發(fā)油樣品主要成分.之后利用圖譜上的峰面積，使用歸一化法計算各成分的相對百分含量.

2.3 湖北黃精葉片揮發(fā)油的抗氧化活性測定

2.3.1 DPPH自由基清除率測定 參照Cai等[11]的方法，將提取的湖北黃精葉片揮發(fā)油用無水乙醇配制成100、200、300、400、500 μg/mL質(zhì)量濃度梯度的樣品溶液；取2 mL樣品溶液并加入5 mmol/L的DPPH-乙醇溶液2 mL，混勻，室溫下避光反應30 min，最后于517 nm波長處測定吸光度Am；再以2 mL無水乙醇替代DPPH溶液并測定吸光度At1，以2 mL無水乙醇替代樣品溶液測定吸光度A01.平行測定3次，并以Vc作為陽性對照，按式(1)計算清除率.

(1)

2.3.2 羥基自由基清除率測定 參照吳穎等[12]的方法，將提取的湖北黃精葉片揮發(fā)油用無水乙醇配置成50、100、150、200、250 μg/mL質(zhì)量濃度梯度的樣品溶液；取1.6 mL樣品溶液依次加入6 mmol/L的FeSO40.4 mL，8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL，9 mmol/L水楊酸溶液1 mL，于37 ℃條件下水浴加熱15 min，最后于510 nm處測定樣品吸光度An；再用1.6 mL去離子水代替樣品溶液測定吸光度A02，以1 mL蒸餾水替代H2O2溶液測定吸光度At2.平行測定3次，并以Vc作為陽性對照，按式(2)計算清除率.

(2)

2.3.3 超氧陰離子自由基清除率測定 參考吳穎等[12]的方法，將提取的湖北黃精葉片揮發(fā)油用無水乙醇配制成100、200、300、400、500 μg/mL質(zhì)量濃度梯度的樣品溶液，取1 mL樣品溶液，依次加入50 mmol/L Tris-緩沖液(pH=7.4)1.4 mL，5 mmol/L鄰苯三酚溶液0.2 mL，混勻后靜置5 min，最后在320 nm波長下測定吸光度Ay；再以10 mmol/L鹽酸溶液0.2 mL替代鄰苯三酚溶液并測定吸光度At3，以1 mL去離子水替代樣品溶液并測定吸光度A03.平行測定3次，并以Vc作為陽性對照，按式(3)計算清除率.

(3)

2.3.4 ABTS自由基清除率測定 ABTS溶液需用無水乙醇稀釋，使其在734 nm波長下的吸光度為0.700±0.020，即得到ABTS工作液[13].將提取的湖北黃精葉片揮發(fā)油用無水乙醇配制成100、200、300、400、500 μg/mL質(zhì)量濃度梯度的樣品溶液，取1 mL樣品溶液并加入3 mL ABTS工作液，搖勻后，室溫避光保存10 min，最后在734 nm波長下測定吸光度Az；再以1 mL無水乙醇替代樣品溶液并測定吸光度A04，以3 mL無水乙醇替代ABTS工作液并測定吸光度At4.平行測定3次，并以Vc作為陽性對照，按式(4)計算清除率.

(4)

3 結(jié)果與分析

3.1 同時蒸餾萃取法及超臨界CO2萃取法提取湖北黃精葉片揮發(fā)油GC-MS結(jié)果

由圖1和表1可知，同時蒸餾萃取法提取的湖北黃精葉片揮發(fā)油共鑒定出26種化合物.含量超過10%的有3種，其中2，3-二氫苯并呋喃含量最高(46.63%)，其次是α-亞麻酸(18.40%)和棕櫚酸(13.27%)，占揮發(fā)油總成分的78.0%.含量在1%～10%之間的有4種，分別是4-乙烯基-2-甲氧基苯酚(8.63%)、植物醇(2.08%)、2，6-二叔丁基對甲酚(2.05%)和苯乙醛(1.02%).其余19種化合物含量均在0.1%～1.0%之間.

由圖2和表2可知，超臨界CO2萃取法提取的湖北黃精葉片揮發(fā)油共鑒定出19種化合物.含量超過10%的有3種，其中α-亞麻酸含量最高(37.77%)，其次是(3β，24S)-柱頭甾-5-烯-3-醇(12.29%)和10-十九烷醇(11.34%)，占揮發(fā)油總成分的61.40%.含量在1%～10%之間的有14種，有棕櫚酸(6.41%)、芥酸酰胺(6.37%)、植物醇(4.08%)、天然維生素E(3.31%)、正二十烷(2.65%)、豆甾醇(1.89%)、(9Z，12Z，15Z)-9，12，15-十八碳三烯-1-醇(1.79%)、(Z，Z)-七烷-1，8，11-三烯(1.77%)等.其余2種化合物含量在0.5%～1.0%之間.

表1 湖北黃精葉片揮發(fā)油成分及相對含量(同時蒸餾萃取法)Tab.1 Volatile components and relative contents from the leaves of Polygonatum zanlanscianense Pamp.(simultaneous distillation extraction)

表2 湖北黃精葉片揮發(fā)油成分及相對含量(超臨界CO2萃取法)Tab.2 Volatile components and relative contents from the leaves of Polygonatum zanlanscianense Pamp.(supercritical CO2 extraction)

3.2 同時蒸餾萃取法及超臨界CO2萃取法提取湖北黃精葉片揮發(fā)油成分對比分析

由表3可見，同時蒸餾萃取法和超臨界CO2萃取法提取的湖北黃精葉片揮發(fā)油成分中，均含有酸類、酚類、醇類、酯類、酮類和烯烴類化合物.呋喃類是同時蒸餾萃取法提取的揮發(fā)油中含量最高的化學成分(46.63%)，酸類是超臨界CO2萃取法提取的揮發(fā)油中含量最高的化學成分(44.18%).同時蒸餾萃取法提取的揮發(fā)油中化合物種類數(shù)大于超臨界CO2萃取法，化合物種類更加豐富.

3.3 同時蒸餾萃取法及超臨界CO2萃取法提取湖北黃精葉片揮發(fā)油抗氧化活性分析

3.3.1 DPPH自由基清除能力 由圖3(a)可知，在100～500 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，同時蒸餾萃取法和超臨界CO2萃取法提取的湖北黃精葉片揮發(fā)油對DPPH自由基都具有清除作用，且清除能力隨質(zhì)量濃度遞增均呈增強的趨勢.采用同時蒸餾萃取法提取的揮發(fā)油清除DPPH自由基的IC50為192.94 μg/mL，超臨界CO2萃取法提取的揮發(fā)油清除DPPH自由基的IC50為342.28 μg/mL，Vc對照組的IC50為178.45 μg/mL.同時蒸餾萃取法提取的揮發(fā)油抗氧化能力顯著高于超臨界CO2萃取法，但抗氧化效果稍弱于Vc對照組.

3.3.2 羥基自由基清除能力 由圖3(b)可知，2種萃取方式提取的湖北黃精葉片揮發(fā)油對羥基自由基均有較好的清除效果，且有濃度依賴效應；但二者都低于Vc對羥基自由基的清除率.同時蒸餾萃取法提取的揮發(fā)油清除羥基自由基的IC50為112.38 μg/mL，超臨界CO2萃取法提取的揮發(fā)油清除羥基自由基的IC50為193.64 μg/mL，Vc對照組的IC50為52.41 μg/mL.同時蒸餾萃取法提取的揮發(fā)油對羥基自由基清除能力顯著高于超臨界CO2萃取法.

表3 不同提取方式提取湖北黃精葉片揮發(fā)油成分對比Tab.3 Comparison of volatile components extracted from leaves of Polygonatum zanlanscianense Pamp.by different extraction methods

3.3.3 超氧陰離子自由基清除能力 由圖3(c)可知，湖北黃精葉片揮發(fā)油和Vc在鄰苯三酚自氧化化學體系中均能在一定程度上清除超氧陰離子，且清除率隨揮發(fā)油質(zhì)量濃度的增加呈上升趨勢，但都低于Vc.同時蒸餾萃取法提取的揮發(fā)油清除超氧陰離子自由基的IC50為237.61 μg/mL，超臨界CO2萃取法提取的揮發(fā)油清除超氧陰離子自由基的IC50為322.15 μg/mL，Vc對照組的IC50為72.46 μg/mL.

3.3.4 ABTS自由基清除能力 由圖3(d)可知，在0～500 μg/mL質(zhì)量濃度區(qū)間內(nèi)，湖北黃精葉片揮發(fā)油對ABTS自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而提高，但清除率低于Vc.同時蒸餾萃取法提取的揮發(fā)油清除ABTS自由基的IC50為371.44 μg/mL，超臨界CO2萃取法提取的揮發(fā)油清除ABTS自由基的IC50為416.63 μg/mL，Vc

圖3 湖北黃精葉片揮發(fā)油抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of volatile oil from leaves of Polygonatum zanlanscianense Pamp.

清除ABTS自由基的IC50為147.36 μg/mL.總體而言，同時蒸餾萃取法提取的揮發(fā)油對ABTS自由基的清除活性大于超臨界CO2萃取法.

4 討論

采用同時蒸餾萃取法和超臨界CO2萃取法提取湖北黃精葉片揮發(fā)油，并通過GC-MS方法鑒定出同時蒸餾萃取法提取的揮發(fā)油中有26種化合物成分，包含12種類別，主要成分為呋喃、酸以及酚類化合物，占揮發(fā)油總組分的90%以上；超臨界CO2萃取法提取的湖北黃精葉片揮發(fā)油共鑒定出19種化合物，包含9種類別，主要成分為酸、醇類化合物，占揮發(fā)油總組分的80%以上.余紅等[14]測定的多花黃精根狀莖揮發(fā)油成分中，與本實驗測得的相同成分有正十二烷、2，6-二叔丁基對甲酚、鄰苯二甲酸二丁酯，其他成分在本實驗中未檢出；這可能與黃精品種、測定部位、采集季節(jié)、揮發(fā)油提取方法和成分分析方法等因素有關(guān).本研究初步鑒定了湖北黃精葉片揮發(fā)油的主要成分，為湖北黃精葉片的提取和利用提供了理論依據(jù).

超臨界CO2萃取法所需的溫度低、時間短、且在密閉的提取系統(tǒng)中進行,可避免一些易氧化或易發(fā)生見光反應的化學成分的損失，同時又適用于脂溶性、低沸點、熱敏性物質(zhì)的提取[15].研究表明，烴類、酯類、部分醇類化合物在超臨界CO2流體中的溶解度較大[16]，因此本研究中超臨界CO2萃取法提取的湖北黃精葉片揮發(fā)油中檢測出了同時蒸餾萃取提取的揮發(fā)油中未檢測出的烷烴類物質(zhì)(正二十烷、正二十七烷、十三烷)，且烯烴、醇類和酯類物質(zhì)的含量高于同時蒸餾萃取提取的揮發(fā)油.但超臨界CO2萃取法提取的揮發(fā)油化合物種類比較有限，同時蒸餾萃取法提取的揮發(fā)油中的化合物種類數(shù)更多.

此外，對2種提取方法得到的揮發(fā)油分別進行抗氧化活性測定.采用同時蒸餾萃取提取的揮發(fā)油抗氧化活性略高于CO2超臨界萃取法提取的揮發(fā)油.這種抗氧化活性的差異可能與2種提取方式提取的揮發(fā)油成分不同有關(guān)，不同結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的化合物的抗氧化作用不同[17].酚類物質(zhì)具有清除自由基的作用，是很強的體外抗氧化劑；而本實驗中同時蒸餾萃取法提取的揮發(fā)油中酚類含量(12.12%)遠大于超臨界CO2萃取法(0.62%)，故推測超臨界CO2萃取法提取的揮發(fā)油整體抗氧化性較差，與實驗結(jié)果一致.

5 結(jié)論

通過GC-MS方法初步對比分析了同時蒸餾萃取法和超臨界CO2萃取法提取的湖北黃精葉片揮發(fā)油成分，結(jié)果表明2種方法提取到的揮發(fā)油種類與含量差異較大；采用同時蒸餾萃取法提取的湖北黃精葉片揮發(fā)油成分和種類更多.測定湖北黃精葉片揮發(fā)油對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基、ABTS自由基的清除能力，結(jié)果表明在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，湖北黃精葉片揮發(fā)油具有一定的抗氧化活性，同時蒸餾萃取法比超臨界CO2萃取法提取的揮發(fā)油成分抗氧化活性更高，證明同時蒸餾萃取法提取湖北黃精葉片揮發(fā)油更具優(yōu)勢.另外，同時蒸餾萃取法能避免超臨界CO2萃取法設(shè)備投資費用大、工藝技術(shù)要求高的問題，但投入實際生產(chǎn)應用還需要開展更深入的研究.