羅 婭，楊 敏，葛 聰

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130；2.電子科技大學(xué)成都學(xué)院商學(xué)院，成都 611731）

胞質(zhì)3-磷酸甘油醛脫氫酶（cytosolic glyceralde‐hyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPC）是一類極易受到氧化還原修飾的蛋白質(zhì)[1]，基于這個(gè)特性，該蛋白質(zhì)功能往往受到細(xì)胞內(nèi)的氧化還原態(tài)勢(shì)所影響。植物細(xì)胞經(jīng)有氧代謝產(chǎn)生副產(chǎn)物活性氧（reac‐tive oxygen species，ROS），最常見(jiàn)的是過(guò)氧化氫（hy‐d rogen peroxide，H2O2）、超氧陰離子（superoxide an‐ion，O2-·）和羥基自由基（hydroxyl radical，OH-）[2]。通?；钚匝醯纳珊徒到庥杉?xì)胞精細(xì)調(diào)控，使其保持極低的穩(wěn)態(tài)活性氧濃度（<10-8M）。然而，干旱、鹽、冷和熱等各種非生物脅迫破壞細(xì)胞的代謝平衡，導(dǎo)致植物中ROS產(chǎn)生過(guò)多，從而造成氧化應(yīng)激影響植物生長(zhǎng)發(fā)育[3]。

植物響應(yīng)非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通過(guò)ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)磷酸化[4]。脫落酸（Abscisic acid，ABA）是植物調(diào)控非生物脅迫響應(yīng)中的重要植物激素，調(diào)節(jié)H2O2的產(chǎn)生，影響細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度，在氧化應(yīng)激的調(diào)控中擔(dān)任信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的角色。ABA的核心信號(hào)通路主要通過(guò)蔗糖非依賴蛋白激酶 2（sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 2，SNRK2）的激活和磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)、氣孔關(guān)閉和植物生長(zhǎng)發(fā)育等一系列的生理生化反應(yīng)[5]。在ABA介導(dǎo)非生物脅迫調(diào)控中，通過(guò)SNRK2可以激活細(xì)胞膜上的還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphoric acid，NADPH）氧化酶產(chǎn)生 ROS，導(dǎo)致H2O2進(jìn)入植物細(xì)胞共同參與調(diào)節(jié)非生物脅迫[6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，GAPC參與了植物H2O2依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程，通過(guò)“兼職”或以初生代謝方式的轉(zhuǎn)變來(lái)響應(yīng)氧化脅迫[7]。本文將對(duì)GAPC在ABA與H2O2介導(dǎo)氧化代謝及響應(yīng)非生物脅迫的潛在功能作介紹。

1 GAPDH的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與功能

1.1 GAPDH的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）是糖代謝途徑糖酵解和糖異生中的關(guān)鍵酶。因GAPDH高度保守，常被用作內(nèi)參基因使用[8]。根據(jù)GAPDH的多種細(xì)胞定位，將GAPDH分為以下4類同工型：①GAPC，位于細(xì)胞質(zhì)，特異地以NAD+為輔酶，磷酸化甘油醛-3-磷酸并氧化形成1，3-二磷酸甘油酸（1，3-Di‐phosphoglyceric acid，1，3-BPG）；②NP-GAPDH，位于細(xì)胞質(zhì)，被認(rèn)為是催化糖酵解“旁路”反應(yīng)的酶，直接將3-磷酸甘油醛氧化為3-磷酸甘油酸，同時(shí)生成 NADPH[9]；③GAPA/B，位于葉綠體，以 NADP+為輔酶，將1，3-二磷酸甘油酸還原為甘油醛-3-磷酸，是卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶，參與光合作用CO2的固定[10]；④質(zhì)體GAPDH（plastid glyceraldehyde-3-phos‐phate dehydrogenase，GAPCp），參與非綠色質(zhì)體糖酵解能量的產(chǎn)生[11]。

所有GAPDH蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)及氨基酸序列高度保守，且各種晶體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)其活性位點(diǎn)也相對(duì)保守[12]。細(xì)菌/哺乳動(dòng)物和酵母分別擁有1種GAPDH和3種GAPDH（GAPA、GAPB、GAPC），擬南芥有GAPA1、GAPA2、GAPB、GAPC1、GAPC2、GAPCp1和GAPCp2共7個(gè)不同的GAPDH[13]。其中GAPC還參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞代謝及脅迫反應(yīng)等生物過(guò)程[14]。

1.2 多功能的GAPC

近年研究發(fā)現(xiàn)，GAPC除糖酵解催化功能外[15]，在介導(dǎo)植物的生物/非生物脅迫以及果實(shí)成熟調(diào)控中起重要作用[16-21]。S.P.Rius等[22]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥GAPC1的突變體通過(guò)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)碳通量使轉(zhuǎn)基因擬南芥形成線粒體呼吸障礙，導(dǎo)致ATP合成減少，并受到氧化脅迫，造成植株矮小、結(jié)實(shí)率低且伴隨著雄性不育；Li X.等[23]研究發(fā)現(xiàn)TaGAPCp1正響應(yīng)小麥的干旱脅迫；Luo Y.等[21]發(fā)現(xiàn)草莓FaGAPC2作為一個(gè)負(fù)調(diào)控因子參與草莓果實(shí)成熟的調(diào)控。由此說(shuō)明，細(xì)胞質(zhì)GAPC是一個(gè)多功能蛋白[24]。

1.2.1 GAPC的催化功能

GAPC在糖酵解中可將甘油醛-3-磷酸與其特異性輔因子NAD+和磷酸鹽偶聯(lián)轉(zhuǎn)化為1，3-BPG和NADH。1，3-BPG與ADP經(jīng)磷酸甘油酸激酶（phos‐phoglycerate kinase，PGK）催化產(chǎn)生 ATP[25]。因此，GAPC也會(huì)對(duì)涉及到ATP，NADH的細(xì)胞代謝產(chǎn)生影響。在藍(lán)細(xì)菌中過(guò)表達(dá)GAPC1會(huì)促進(jìn)NADH積累，而GAPC1無(wú)效突變體可以促進(jìn)氧化型磷酸戊糖（oxidized pentose phosphate，OPP）循環(huán)積累更多的NADPH[26]。在擬南芥中，AtGAPC1的突變體可能降低ATP含量和呼吸速率導(dǎo)致種子空胚囊[27]，同時(shí)，AtGAPCs敲除系/過(guò)表達(dá)AtGAPCs分別降低/提高脂肪酸、ATP和NAD（P）H的含量，表明AtGAPCs可能通過(guò)促進(jìn)ATP含量的積累來(lái)正調(diào)節(jié)種子中的脂肪酸與NAD（P）H積累[28]。在低磷條件下，AtGAPC2的表達(dá)水平被抑制，是因?yàn)镻i與糖代謝和能量產(chǎn)生相關(guān)，所以Pi含量改變會(huì)影響AtGAPC的表達(dá)量[29]。

1.2.2 GAPC參與調(diào)節(jié)H2O2和ABA介導(dǎo)的脅迫信號(hào)通路

H2O2以氧氣部分還原的形式穩(wěn)定地存在于植物體，在調(diào)節(jié)植物發(fā)育，如擬南芥種子發(fā)芽、細(xì)胞增殖和分化以及加強(qiáng)植物對(duì)脅迫環(huán)境刺激的耐受性中發(fā)揮信號(hào)分子的作用[30,34]。在高等植物的H2O2信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，氧化還原敏感蛋白（如GAPC）發(fā)生氧化還原反應(yīng)[35]，再經(jīng)過(guò)氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子(如熱激因子（heat shock factor，HSF））感知、轉(zhuǎn)導(dǎo)氧化還原信號(hào)[36]，進(jìn)而調(diào)節(jié)氧化還原平衡，同時(shí)氧化還原敏感蛋白激活下游信號(hào)分子（如激酶、磷酸酶）發(fā)揮作用[37]。H2O2也是ABA響應(yīng)非生物脅迫信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，參與提高小麥的抗旱性及擬南芥的非生物脅迫抗性[23,38]，ABA調(diào)控氣孔關(guān)閉是ABA參與非生物脅迫的經(jīng)典范例，通過(guò)鈣/非鈣依賴兩種途徑調(diào)節(jié)[39]，SNRK2.6/開(kāi)放式氣孔 1(open stomata 1，OST1)是非鈣依賴途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[40]。在脅迫環(huán)境下，ABA積累導(dǎo)致PP2C失活，促進(jìn)SNRK2.6及下游效應(yīng)蛋白的磷酸化，如轉(zhuǎn)錄因子ABF2、ABA不敏感蛋白4/5（ABA insensitive 4/5，ABI4/5）、離子通道蛋白KAT1和Slow-陰離子關(guān)聯(lián)通道1（slow anion channel-associated 1，SLAC1）以及 NADPH氧化酶等[41-42]，從而改變細(xì)胞蛋白質(zhì)和離子分布，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，減少植物經(jīng)蒸騰作用失水[43-44]。其中NADPH氧化酶誘導(dǎo)產(chǎn)生O2-·后，在超氧化物歧化酶（super‐oxide dismutase，SOD）作用下產(chǎn)生H2O2[45]。誘導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2通過(guò)調(diào)節(jié)離子通道來(lái)影響保衛(wèi)細(xì)胞Ca2+的流出和流入，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的膨脹，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉。因此H2O2是ABA介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)下產(chǎn)生的重要信號(hào)分子，協(xié)助ABA進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)下游信號(hào)調(diào)控細(xì)胞響應(yīng)脅迫環(huán)境（圖1）。

圖1 植物體內(nèi)脫落酸誘導(dǎo)產(chǎn)生H2O2并響應(yīng)脅迫的過(guò)程[44-45]Figure 1 Abscisic acid induces the production of hydrogen peroxide and responds to stress in plants[44-45]

為了維持脅迫環(huán)境下植物細(xì)胞中ROS和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）的平衡，高等植物相應(yīng)蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生可逆的氧化還原翻譯后修飾（re‐dox post translational modification，RPTM）來(lái)感知并傳遞氧化還原信號(hào)[46]。研究表明，GAPC發(fā)揮其多功能性是因?yàn)樽陨戆腚装彼岬膸€基側(cè)鏈對(duì)H2O2和NO等具有較強(qiáng)氧化還原性的分子非常敏感[47]，GAPC極易受到H2O2的氧化，或經(jīng)亞硝基谷胱甘肽（nitrosoglutathione，GSNO）發(fā)生S-亞硝基化后強(qiáng)烈抑制酶活性并形成氧化還原依賴性修飾[48]，促進(jìn)GAPC在氧化應(yīng)激中發(fā)揮其它“兼職”功能。由于細(xì)胞質(zhì)中的GAPC濃度高達(dá)240μM，且其半胱氨酸結(jié)構(gòu)域高度保守，決定了細(xì)胞質(zhì)GAPC的巰基活性比其他氧化還原蛋白更高[49]，更易發(fā)生氧化修飾。對(duì)GAPC晶體結(jié)構(gòu)分析表明，α-螺旋N-末端的催化性Cys表面積與GAPC的反應(yīng)速率和巰基酸度呈正相關(guān)[50]，并運(yùn)用量子力學(xué)（quantum mechanism，QM）構(gòu)建GAPC活性位點(diǎn)模型，發(fā)現(xiàn)His176的氮中和了Cys149的負(fù)電作用，形成中性Cys149-(O)nH-His176中間體，促進(jìn)H2O2對(duì)催化性Cys149的多步氧化[48]。在擬南芥中，AtGAPC1和AtGAPA的酸性催化性Cys149極易被修飾，但AtGAPC1的活性Cys巰基鹽與H2O2的反應(yīng)速度以及將次磺酸轉(zhuǎn)化為亞磺酸的速度均比AtGAPA快[51]，說(shuō)明GAPC對(duì)H2O2更加敏感。

1.2.3 GAPC作為修飾蛋白的潛在功能

在氧化脅迫下，GAPC被H2O2可逆氧化成次磺酸，但可以被還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）或二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）恢復(fù)，植物體內(nèi)冗余的H2O2，進(jìn)一步將次磺酸氧化生成磺酸與亞磺酸[52]，并抑制GAPC活性，同時(shí)賦予GAPC其它功能，例如，調(diào)節(jié)脅迫條件下的基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，保護(hù)端粒DNA以及參與調(diào)節(jié)果實(shí)的成熟[21,53-54]。因此，GAPC受到氧化還原修飾后會(huì)具備額外的功能[55]。在干旱脅迫下，擬南芥AtGAPCs的雙敲除突變體和小麥TaGAPC2/5/6的沉默株系均表現(xiàn)出ROS積累更多、氣孔閉合且對(duì)ABA響應(yīng)變?nèi)醯奶卣鱗8,56]。Zhang L.等[57]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下小麥植株ABA含量的增加會(huì)誘導(dǎo)TaGAPC1與TaWRKY互作以促進(jìn)體內(nèi)H2O2的清除。Guo L.等[58]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥植物受到氧化脅迫后使氧化失活的GAPC能與磷脂酶（phospholipase D，PLD）結(jié)合后激活PLD促進(jìn)磷脂酸（phosphatidic acid，PA）產(chǎn)生并介導(dǎo)ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉。因此，GAPC可能通過(guò)感知H2O2含量變化并將氧化還原信號(hào)傳遞給PLD，同時(shí)促進(jìn)PLD產(chǎn)生PA來(lái)介導(dǎo)氣孔關(guān)閉，從而響應(yīng)脅迫信號(hào)。此外，擬南芥和煙草經(jīng)蛋白源二肽Tyr-Asp處理后抑制了GAPC的活性，并將葡萄糖重新導(dǎo)向磷酸戊糖途徑（pentose phosphoric acid path‐way，PPP）和NADPH的產(chǎn)生，從而提高植物對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性[59]（圖2）。Li L.等[60]在研究馬鈴薯塊莖發(fā)芽的機(jī)制中，發(fā)現(xiàn)抗菌肽Snakin-2（StSN2）與StGAPC1相互作用后增強(qiáng)StGAPC1酶活性，減少氧化修飾并抑制馬鈴薯塊莖發(fā)芽。GAPC除了響應(yīng)氧化應(yīng)激，還可以防御植物病原體，阻止竹花葉病毒（Bamboomosaicvirus，BaMV）在感病煙草中復(fù)制[61]；過(guò)表達(dá)GAPCs通過(guò)與自噬相關(guān)蛋白3（autophagyrelated protein 3，ATG3）相互作用抑制煙草自噬，提高煙草抗病性[62]。

圖2 GAPC在氧化還原信號(hào)中的作用Figure 2 Functions of GAPC in redox signalling

GAPC多功能性通常與應(yīng)激誘導(dǎo)GAPC核易位有關(guān)。在冷脅迫和鎘脅迫下，擬南芥AtGAPC從細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核[63-64]；在熱脅迫下，AtGAPC通過(guò)與核轉(zhuǎn)錄因子NFYC10相互作用使AtGAPC在細(xì)胞核中積累，并促進(jìn)熱誘導(dǎo)基因的表達(dá)以響應(yīng)熱脅迫[65]（圖2）。近期研究發(fā)現(xiàn)，E3泛素連接酶（seven in absentia like 7，SINAL7）與AtGAPC1發(fā)生相互作用，使單泛素化的AtGAPC1催化活性喪失，使其進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控細(xì)胞凋亡[66]（圖3）。此外，在鹽脅迫下，煙草NtGAPC的催化性半胱氨酸發(fā)生S-亞硝基化及其突變形式均可以在細(xì)胞質(zhì)中與煙草滲透脅迫活化蛋白激酶（NtOSAK）相互作用，但NtGAPC的催化性半胱氨酸位點(diǎn)存在時(shí)才能在細(xì)胞核中與NtOSAK相互作用。因此，催化性半胱氨酸S-亞硝化只是NtGAPC核易位的必需（圖3）[20]。值得注意的是，盡管脅迫誘導(dǎo)GAPC核定位的一些機(jī)理已明確，但其在植物細(xì)胞核中的明確作用仍然缺失。

GAPC除了受到氧化修飾和S-亞硝化修飾外，還可以發(fā)生磷酸化修飾、乙?；揎椀榷喾N翻譯后修飾。在水稻中，GAPDH的核定位會(huì)因氧化應(yīng)激而增強(qiáng)，而GAPDH與組蛋白去乙酰化酶OsSRT1相互作用會(huì)減少其核易位，并使GAPDH發(fā)生去乙酰化修飾，降低其活性，同時(shí)抑制GAPDH轉(zhuǎn)錄激活糖酵解基因的功能（圖3），從而讓植物細(xì)胞感知氧化還原狀態(tài)以積極響應(yīng)氧化脅迫[67]。而GAPDH的磷酸化會(huì)影響種子發(fā)育過(guò)程中磷酸三糖在不同代謝途徑和細(xì)胞區(qū)間的分配，以滿足碳、能量和還原當(dāng)量的需求[68]。

圖3 GAPDH核轉(zhuǎn)位響應(yīng)非生物脅迫Figure 3 GAPDH nuclear translocation in response to abiotic stress

1.2.4 GAPC氧化失活引起初生代謝轉(zhuǎn)變響應(yīng)氧化脅迫

植物細(xì)胞在氧化脅迫下已經(jīng)發(fā)展出各種包含酶（如SOD、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶）以及非酶抗氧化劑（如抗壞血酸和還原谷胱甘肽）的抗氧化系統(tǒng)。其中谷胱甘肽是最重要的抗氧化劑之一，直接或間接作為谷胱甘肽還原系統(tǒng)和硫氧還蛋白系統(tǒng)活性氧的清除因子[69]。NADPH是許多合成代謝的供氫體，在PPP途徑、三羧酸循環(huán)（tricar‐boxylic acid cycle，TCA）和葉酸代謝等途徑中都有產(chǎn)生[70]。其中PPP途徑是植物NADPH的主要來(lái)源，也是維持氧化還原平衡的關(guān)鍵[71]。研究表明，GAPDH作為氧化敏感蛋白，使其半胱氨酸殘基受到氧化修飾并限制糖酵解通量，同時(shí)使中間產(chǎn)物在PPP中積累來(lái)介導(dǎo)短期抗氧化反應(yīng)，還可能促進(jìn)DNA損傷修復(fù)的核苷酸合成[72]。當(dāng)人類細(xì)胞受到H2O2和紫外線輻射引起的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致GAPDH氧化失活使糖酵解代謝受阻，從而激活葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）使糖代謝轉(zhuǎn)向PPP和嘌呤代謝[73]，并可能通過(guò)多次循環(huán)，產(chǎn)生更多NADPH來(lái)滿足還原當(dāng)量的急性需求。用H2O2處理酵母細(xì)胞也使糖酵解受到嚴(yán)重抑制后促進(jìn)初始階段PPP中間產(chǎn)物濃度急劇增加[74]。擬南芥根被氧化劑甲萘醌處理后改變了糖酵解通量來(lái)響應(yīng)氧化脅迫[75]。因此，GAPDH是響應(yīng)氧化脅迫的關(guān)鍵蛋白，并通過(guò)氧化失活引起初生代謝的轉(zhuǎn)變響應(yīng)氧化脅迫。

總結(jié)與展望

在各種非生物脅迫下，植物通過(guò)感知環(huán)境變化產(chǎn)生ROS、RNS和PA等第二信使。GAPC由于其易被氧化的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，而且是ROS和RNS的共同靶蛋白[55]，成為了ABA與H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的關(guān)鍵信號(hào)節(jié)點(diǎn)，這一發(fā)現(xiàn)給進(jìn)一步探究植物在氧化逆境中的信號(hào)調(diào)控提供了新的思路。鑒于糖酵解對(duì)植物能量代謝、生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆性的重要作用，對(duì)于未來(lái)GAPC的研究主要涉及以下三個(gè)方面。

首先，挖掘作為修飾蛋白GAPC的更多潛在功能。植物GAPC翻譯后修飾研究多集中在氧化還原修飾。該類修飾賦予GAPC的功能是響應(yīng)各種生物與非生物脅迫。在Luo Y.等研究中發(fā)現(xiàn)，GAPC參與調(diào)控草莓果實(shí)成熟和品質(zhì)的形成[21]，且該過(guò)程受到乙?；揎椀挠绊懀〝?shù)據(jù)未發(fā)表）。因此翻譯后修飾的GAPC對(duì)園藝植物生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)的調(diào)控及其機(jī)制的解析還需要深入研究。

其次，GAPC細(xì)胞核易位機(jī)制的解析。哺乳動(dòng)物GAPDH的核轉(zhuǎn)位機(jī)制和凋亡功能已得到很好的闡釋[76]，植物GAPC核轉(zhuǎn)位的研究仍處于起步階段。對(duì)植物GAPC翻譯后修飾關(guān)鍵位點(diǎn)的挖掘以及該修飾位點(diǎn)在促進(jìn)GAPC核易位中的作用有助于更好的理解GAPC的多功能性。

最后，GAPC在細(xì)胞核中的作用仍需深入研究。在動(dòng)物細(xì)胞中，核GAPDH通過(guò)與各種核成分結(jié)合來(lái)影響轉(zhuǎn)錄活性、DNA復(fù)制和修復(fù)以及表觀遺傳修飾[77-78]。植物GAPC在細(xì)胞核中的明確作用仍然缺失。找到GAPC直接調(diào)控的細(xì)胞核靶基因可以為解答翻譯后修飾的GAPC調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、品質(zhì)形成以及響應(yīng)各種脅迫的問(wèn)題提供直接答案。