周昭彬 王維維 徐鈺棟 賴宇謙 白心亮 宋澤和 劉自逵* 賀 喜*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙410125；2.內(nèi)蒙古昶輝生物科技股份有限公司，通遼028400；3.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，長沙410128)

目前，我國禁止在畜禽飼料中添加抗生素，因此各種植物添加劑的開發(fā)愈加重要。水飛薊素是從水飛薊干燥成熟果實中提取得到的黃酮類天然化合物，其主要成分是水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊亭和水飛薊寧[1]。藥理學研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素具有抗氧化[2]、增強免疫功能[3-4]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[5]等作用。近年來，水飛薊素在養(yǎng)殖業(yè)上的用途愈加廣泛，如飼糧中添加水飛薊素膠束可以通過提高母豬血清中催乳素濃度以提高母豬產(chǎn)奶量，從而提升斷奶仔豬的窩重、仔豬個體重量和平均日增重[6]。肉雞飼糧中添加250 mg/kg的水飛薊素可調(diào)節(jié)流感病毒抗體滴度和綿羊紅細胞(SRBC)抗體滴度[7]。黃羽肉雞是我國優(yōu)質(zhì)肉雞品類，但目前缺少水飛薊素對黃羽肉雞的作用探索，因此，本試驗旨在研究飼糧中添加不同劑量水飛薊素對黃羽肉雞抗氧化能力、免疫功能及腸道菌群的影響，從而為水飛薊素作為黃羽肉雞飼料添加劑提供理論參考和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水飛薊素由內(nèi)蒙古某生物科技股份有限公司提供，有效含量≥80%。

1.2 試驗動物與設計

試驗選取288羽1日齡體質(zhì)健康的快速型黃羽肉雞，隨機分成4組，每組6個重復，每個重復12羽。對照組(CON組)飼喂基礎飼糧，低劑量組(S250組)、中劑量組(S500組)、高劑量組(S750組)在基礎飼糧的基礎上分別添加250、500、750 mg/kg水飛薊素。試驗期56 d，1～28日齡為試驗前期，29～56日齡為試驗后期。

1.3 試驗飼糧

基礎飼糧以玉米、豆粕為主要原料，參照《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)進行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

續(xù)表1項目Items含量 Content1～28日齡1 to 28 days of age29～56日齡29 to 56 days of age蛋氨酸 Met0.470.41蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.800.71鈣 Ca1.000.90總磷 TP0.680.64有效磷 AP0.400.36粗纖維 CF2.912.75

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗雞采用3層籠養(yǎng)。試驗前對雞舍進行充分沖洗和嚴格消毒，入雛前24 h將雞舍升溫至32～35 ℃，此后溫度每周降低2～3 ℃，直至保持在22～24 ℃為止。試驗期舍內(nèi)光照、濕度和溫度根據(jù)常規(guī)飼養(yǎng)管理要求進行控制，雞只按正常免疫程序進行免疫。整個試驗期雞自由采食和飲水。

1.5 樣品采集

于試驗29和57日齡(空腹8 h)，每個重復選體重相近的1只肉雞進行屠宰取樣。采集適量肝臟、空腸黏膜和盲腸食糜，液氮中速凍后，于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.6 測定指標

1.6.1 肝臟抗氧化指標測定

使用南京建成生物工程研究所試劑盒進行肝臟總抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的測定。

1.6.2 空腸黏膜分泌型免疫球蛋白(SIgA)含量測定

使用江蘇雨桐生物科技有限公司酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒(CK-E60068)測定空腸黏膜SIgA含量。

1.6.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)測定

將部分肝臟組織與空腸黏膜RNA裂解液勻漿后，按照SteadyPure通用型RNA提取試劑盒(AG21022，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司)說明書操作進行肝臟RNA提取。得到RNA后，按照Evo M-MLV反轉錄試劑盒(AG11706，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司)說明書操作進行，反轉錄得到cDNA，采用SYBR Green(AG11701，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司)嵌合熒光法進行RT-qPCR檢測，引物序列見表2。目的基因包括核因子E2相關因子2(Nrf2)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)、NAD(P)H醌氧化還原酶1(NQO1)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)。以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法對定量結果進行計算分析。

1.6.4 盲腸腸道菌群

采用16S的測序方法測定盲腸微生物的組成及結構(上海派森諾生物科技有限公司)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007整理后，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較，結果以平均值和均值標準誤(SEM)表示，以P<0.05為顯著性水平。

2 結 果

2.1 水飛薊素對黃羽肉雞肝臟抗氧化指標的影響

如表3所示，與CON組相比，S250組、S500組、S750組肉雞前期和后期肝臟T-AOC顯著升高(P<0.05)；S250組、S500組、S750組肉雞前期肝臟SOD活性顯著升高(P<0.05)，S750組肉雞后期肝臟SOD活性顯著升高(P<0.05)；S500組、S750組肉雞前期肝臟CAT活性顯著升高(P<0.05)，S250組肉雞后期肝臟CAT活性顯著升高(P<0.05)；S250組、S500組肉雞前期和后期肝臟GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。

表2 RT-qPCR引物序列

表3 水飛薊素對黃羽肉雞肝臟抗氧化指標的影響

續(xù)表3項目Items組別 GroupsCONS250S500S750SEMP值 P-value處理Treatment線性Linear二次Quadratic過氧化氫酶CAT21.51±1.83b31.12±2.15a22.97±1.47b20.64±1.81b1.150<0.0010.022<0.001谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px211.21±1.94c412.23±27.40a321.78±18.04b220.45±23.12c21.679<0.0010.188<0.001

2.2 水飛薊素對黃羽肉雞肝臟Nrf2、GCLC和NQO1 mRNA表達量的影響

如表4所示，與CON組相比，S250組、S500組、S750組肉雞前期和后期肝臟GCLCmRNA表達量顯著升高(P<0.05)；S250組、S500組、S750組肉雞前期肝臟Nrf2 mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，S500組、S750組肉雞后期肝臟Nrf2 mRNA表達量顯著降低(P<0.05)；S750組肉雞前期肝臟NQO1 mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，S500組、S750組肉雞后期肝臟NQO1 mRNA表達量顯著升高(P<0.05)。

表4 水飛薊素對黃羽肉雞肝臟Nrf2、GCLC和NQO1 mRNA表達量的影響

2.3 水飛薊素對黃羽肉雞空腸黏膜免疫相關基因mRNA表達量的影響

如表5所示，與CON組相比，S500組、S750組肉雞前期空腸黏膜IFN-γmRNA表達量顯著升高(P<0.05)，S250組、S500組肉雞后期空腸黏膜IFN-γmRNA表達量顯著升高(P<0.05)；S500組肉雞前期空腸黏膜TNF-αmRNA表達量顯著升高(P<0.05)，S250組、S500組肉雞后期空腸黏膜TNF-αmRNA表達量顯著升高(P<0.05)；S250組、S500組、S750組肉雞前期和后期空腸黏膜IL-6 mRNA表達量顯著升高(P<0.05)；S250組、S500組、S750組肉雞前期空腸黏膜IgGmRNA表達量顯著降低(P<0.05)，S250組、S500組、S750組肉雞后期空腸黏膜IgGmRNA表達量顯著升高(P<0.05)；S500組、S750組肉雞前期空腸黏膜IgMmRNA表達量顯著升高(P<0.05)，S250組、S500組、S750組肉雞后期空腸黏膜IgMmRNA表達量顯著降低(P<0.05)。

表5 水飛薊素對黃羽肉雞空腸黏膜免疫相關基因mRNA表達量的影響

2.4 水飛薊素對黃羽肉雞空腸黏膜SIgA含量的影響

如表6所示，與CON組相比，S500組肉雞后期空腸黏膜SIgA含量顯著升高(P<0.05)。

表6 水飛薊素對黃羽肉雞空腸黏膜SIgA含量的影響

2.5 水飛薊素對黃羽肉雞腸道菌群的影響

如圖1所示，與CON組相比，S250組、S500組、S750組肉雞前期盲腸菌群Chao1、Goods_coverage、Shannon、Simpson和Observed_species指數(shù)均顯著升高(P<0.05)。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

如表7所示，各組肉雞前期和后期盲腸優(yōu)勢菌群均為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和軟壁菌門(Tenericutes)。與CON組相比，S250組、S500組、S750組肉雞前期盲腸Firmicutes門相對豐度均顯著升高(P<0.05)，盲腸Bacteroidetes門相對豐度顯著降低(P<0.05)；S750組肉雞后期盲腸Tenericutes門相對豐度顯著降低(P<0.05)。

如表8所示，與CON組相比，S250組、S500組、S750組肉雞前期盲腸糞桿菌屬(Faecalibacterium)相對豐度顯著升高(P<0.05)，盲腸另枝菌屬(Alistipes)、AF12相對豐度顯著降低(P<0.05)；S500組肉雞后期盲腸布勞特氏菌屬(Blautia)相對豐度顯著升高(P<0.05)。

表7 盲腸菌群在門水平上的物種組成

表8 盲腸菌群在屬水平上的物種組成

續(xù)表8項目Items組別 GroupsCONS250S500S750SEMP值 P-value處理Treatment線性Linear二次QuadraticBatyricicoccus0.868±1.1880.986±0.6190.179±0.0300.404±0.1350.1460.1590.0890.84929～56日齡 29 to 56 days of ageFaecalibacterium14.032±14.84310.560±7.25918.995±11.40517.754±13.7632.4170.6280.3880.825Oscillospira7.042±2.7269.642±2.8678.860±3.77411.083±9.1731.0610.6250.2580.932Alistipes6.760±8.9177.873±7.0486.475±7.5416.365±10.1231.6210.9890.8690.862Ruminococcaceae_Ruminococcus3.578±1.8064.547±2.6894.566±2.7714.306±1.2910.4320.8540.5940.507AF124.661±3.7695.032±1.8942.757±1.4153.508±1.8820.4970.3620.2080.849Lactobacillus1.980±1.6062.614±3.6531.461±1.2173.147±3.5630.5390.7330.6440.643Ruminococcus2.478±1.0302.611±1.6472.207±1.0091.606±0.9630.2410.4910.1820.461Blautia1.780±0.401b1.118±0.396b3.526±2.111a1.468±0.826b0.2950.0090.4980.159Subdoligranulum1.979±2.3911.116±1.0180.802±0.4622.185±1.6350.3190.3700.9160.092Streptococcus1.678±2.3322.340±3.7430.320±0.4591.243±2.1270.4920.5560.4670.898

如圖2所示，試驗前期，CON組肉雞盲腸的優(yōu)勢菌屬為另枝菌屬(Alistipes)、HB2_32_21、AF12和科爾韋爾氏菌屬(Colwellia)，S250組肉雞盲腸的優(yōu)勢菌屬為糞桿菌屬(Faecalibacterium)和顫螺菌屬(Oscillospira)，S500組肉雞盲腸的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus)，S750組肉雞盲腸沒有出現(xiàn)優(yōu)勢菌屬。試驗后期，CON組、S750組肉雞盲腸沒有出現(xiàn)優(yōu)勢菌屬，S250組肉雞盲腸的優(yōu)勢菌屬為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)，S500組肉雞盲腸的優(yōu)勢菌屬為Anaerofustis。

以線性判別分析評分>2為差異篩選閾值。

3 討 論

3.1 水飛薊素對黃羽肉雞肝臟抗氧化能力及Nrf2、GCLC和NQO1 mRNA表達量的影響

T-AOC反映動物機體抗氧化能力；SOD、CAT、GSH-Px是機體主要的抗氧化酶，能夠清除過多的自由基[8]，其活性的高低可以評定動物體抗氧化功能。Yu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素可提高赭曲霉毒素誘導的雞原代肝細胞的SOD活性；Oskoueian等[10]研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素可提高熱應激雞肝細胞中SOD和CAT活性。本試驗中，水飛薊素可以提高黃羽肉雞肝臟T-AOC，改善SOD、CAT、GSH-Px活性，與Yu等[9]、Oskoueian等[10]研究結果一致。此外，本試驗結果還顯示，在黃羽肉雞生長前期，隨著水飛薊素添加量的增加，黃羽肉雞肝臟抗氧化能力增強；在黃羽肉雞生長后期，隨著水飛薊素添加量的增加，水飛薊素增強黃羽肉雞肝臟抗氧化能力的效果減弱。

Nrf2是調(diào)控機體抗氧化能力的重要轉錄因子，能介導下游基因GCLC、NQO1的轉錄[11]，具有調(diào)節(jié)SOD、CAT等抗氧化酶表達的作用[12]。胡俊等[13]研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素能提高HepG2細胞Nrf2 mRNA表達量；李亮[14]研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素可以提高PC12細胞Nrf2、GCLCmRNA表達量，且與劑量呈正相關。本試驗結果顯示，水飛薊素可以提高肝臟GCLC、NQO1 mRNA表達量，與前人研究結果一致。且本試驗中，在黃羽肉雞生長前期，肝臟GCLC、NQO1 mRNA表達量與水飛薊素添加量呈正相關；在黃羽肉雞生長后期，隨著水飛薊素添加量的增加，水飛薊素增強黃羽肉雞肝臟GCLC、NQO1 mRNA表達量的效果逐漸減弱。水飛薊素對肝臟GCLC、NQO1 mRNA表達量的影響與對肝臟SOD、CAT、GSH-Px活性的作用一致，表明水飛薊素通過上調(diào)黃羽肉雞肝臟GCLC、NQO1 mRNA的表達量以改善SOD、CAT、GSH-Px活性，進而發(fā)揮抗氧化作用。

3.2 水飛薊素對黃羽肉雞免疫功能的影響

細胞因子IFN-γ和TNF-α具有免疫調(diào)節(jié)活性[15-16]。IFN-γ、TNF-α由Th1細胞分泌，可誘導T、B淋巴細胞分化增殖，從而介導細胞免疫應答[16-17]。本試驗中，飼糧中添加中劑量水飛薊素提高了肉雞前期空腸黏膜中IFN-γ、TNF-αmRNA表達量，添加低、中劑量水飛薊素提高了肉雞后期空腸黏膜中IFN-γ、TNF-αmRNA表達量，與Rodríguez-Flores等[18]研究結果相似。IL-6由Th17細胞產(chǎn)生[17]，Th17細胞參與促炎反應，調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)能減輕炎癥，Treg/Th17細胞的平衡狀態(tài)對于機體免疫功能具有重要影響[19]。本試驗中，飼糧中添加3種不同劑量的水飛薊素均提高了肉雞空腸黏膜IL-6 mRNA表達量，可能是因為水飛薊素促進了初始T細胞分化為Treg[4]，為維持機體Treg/Th17細胞平衡，水飛薊素增加Th17細胞數(shù)量從而使得空腸黏膜中IL-6含量升高。免疫球蛋白是B淋巴細胞受抗原刺激之后合成并分泌于體液中能夠與抗原產(chǎn)生特異性反應的球蛋白[20]。張洪[21]通過水飛薊素治療淋巴瘤，發(fā)現(xiàn)治療后患者血清IgG和IgM含量升高。本試驗中，飼糧中添加中、高劑量水飛薊素能上調(diào)肉雞前期空腸黏膜IgMmRNA表達量，添加低、中、高劑量水飛薊素均能上調(diào)肉雞后期空腸黏膜IgGmRNA表達量，與前人研究結果一致。因此，水飛薊素或是在一定程度上刺激肉雞空腸B淋巴細胞增殖，從而提高IgG、IgMmRNA表達量。此外，在試驗前期添加水飛薊素使肉雞空腸黏膜IgGmRNA表達量下降，試驗后期添加水飛薊素使IgMmRNA表達量下降，可能是因為肉雞空腸黏膜中已經(jīng)積聚大量的IgG或IgM，肉雞空腸黏膜中的IgG或IgM已經(jīng)能夠滿足機體的需要。

SIgA是由呼吸道和消化道黏膜固有層B淋巴細胞分泌的一種抗體[22]，其是黏膜免疫的主要效應因子。本試驗中，飼糧中添加中劑量水飛薊素提高了肉雞后期空腸黏膜SIgA含量。郭秀麗等[23]也得出了類似的結論，其通過給大鼠飼喂高脂飲食并添加水飛薊素，發(fā)現(xiàn)水飛薊素能提升高脂飲食大鼠小腸SIgA含量。有研究表明，水飛薊素能促進脂多糖(LPS)誘導的B淋巴細胞增殖[24]。因此，水飛薊素或是通過促進肉雞B淋巴細胞增殖繼而促進空腸黏膜SIgA含量的升高。

綜上所述，水飛薊素對黃羽肉雞空腸黏膜免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用。

3.3 水飛薊素對黃羽肉雞盲腸菌群的影響

本研究對肉雞盲腸菌群進行了16S rRNA測序。α多樣性分析用于研究特定環(huán)境內(nèi)或單一樣本中的多樣性，常用的指標有Goods_coverage、Chao1、Shannon、Simpson和Observed_species指數(shù)。Goods_coverage指數(shù)主要反映操作分類單元(OTU)覆蓋情況，其值高于98%說明覆蓋率高、數(shù)據(jù)量夠，Observed_species、Chao1指數(shù)與菌群中物種數(shù)目成正比，Shannon、Simpson指數(shù)與菌群中物種豐度和均勻度成正比[25]。本試驗中，試驗前期和后期盲腸菌群Goods_coverage指數(shù)均高于98%，說明本次盲腸菌群測樣數(shù)據(jù)符合統(tǒng)計學要求；飼糧中添加3種不同劑量水飛薊素均顯著提高了肉雞前期的盲腸菌群Chao1、Shannon、Simpson和Observed_species指數(shù)，表明飼糧中添加水飛薊素能顯著提升肉雞前期盲腸菌群中物種數(shù)量、豐度和均勻度，優(yōu)化菌群結構。

本試驗中，我們從門水平和屬水平上探討了飼糧中添加水飛薊素對肉雞盲腸菌群物種組成的影響，結果表明，試驗前期，飼糧中添加3種不同劑量水飛薊素均顯著增加了Firmicutes相對豐度，F(xiàn)irmicutes相對豐度的改變主要是由于Faecalibacterium相對豐度的增加；飼糧中添加3種不同劑量水飛薊素降低了Bacteroidetes相對豐度，Bacteroidetes相對豐度的改變主要是由于Alistipes相對豐度的降低。Faecalibacterium具有腸黏膜保護作用，能通過上調(diào)閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)的表達修復腸黏膜屏障結構[26]。有研究顯示，腸道中Alistipes相對豐度與血清IL-6含量呈正相關[27]，表明Alistipes參與機體炎癥性疾病的發(fā)生。此外，Alistipes與促進回腸炎癥有關[28]。因此，飼糧中添加水飛薊素或能通過提高盲腸Faecalibacterium相對豐度改善腸黏膜屏障，減少Alistipes相對豐度，抑制炎癥。本試驗中，飼糧中添加水飛薊素降低了AF12相對豐度，AF12是理研菌科(Rikenellaceae)的細菌，有研究表明，Rikenellaceae相對豐度與銀屑病病理特征呈正相關，且與丙酸含量呈負相關[29]。腸道微生物來源的丙酸可通過增加黏蛋白和杯狀細胞分泌產(chǎn)物來加強腸道黏液屏障，因此，水飛薊素能通過抑制腸道Rikenellaceae中AF12相對豐度從而增加腸道環(huán)境中丙酸含量，進而維護腸道健康。試驗后期，飼糧中添加中劑量水飛薊素提高了Blautia相對豐度，有研究表明，Blautia是廣泛存在于動物糞便和腸道中的益生菌[30]，其能通過增加腸道Treg數(shù)量和產(chǎn)生短鏈脂肪酸維持腸道環(huán)境平衡和預防炎癥[31]，因此，飼糧中添加中劑量水飛薊素能通過促進Blautia生長繼而有益于腸道健康。此外，試驗后期，飼糧中添加高劑量水飛薊素降低了Tenericutes相對豐度，Tenericutes可以上調(diào)糖苷水解酶的活性以促進多糖的降解，并具有產(chǎn)生氫氣的潛力，是一種有益菌[32]。因此，本試驗結果提示，試驗后期飼糧中添加高劑量水飛薊素會降低盲腸有益菌數(shù)量，對腸道產(chǎn)生一定程度的不利影響。

對飼糧中添加水飛薊素的肉雞盲腸菌群進行了線性判別分析分析，結果發(fā)現(xiàn)，試驗前期CON組出現(xiàn)優(yōu)勢菌屬Alistipes、HB2_32_21、AF12和Colwellia，S250組出現(xiàn)優(yōu)勢菌屬Faecalibacterium和Oscillospira，S500組出現(xiàn)優(yōu)勢菌屬Lactobacillus；試驗后期S250組出現(xiàn)優(yōu)勢菌屬Bifidobacterium，S500組出現(xiàn)優(yōu)勢菌屬Anaerofustis。HB2_32_21和Colwellia多存在于海洋湖泊中[33-34]，目前有關二者的功能性研究較少，HB2_32_21和Colwellia對于腸道的影響還有待探討。Oscillospira在腸道可產(chǎn)生丁酸為主的各種短鏈脂肪酸[35]，腸道微生物產(chǎn)生的丁酸介導小腸發(fā)育和黏膜屏障完整性增強，促進雞腸上皮細胞增殖[36]，因而飼糧中添加低劑量水飛薊素可通過提高前期肉雞盲腸優(yōu)勢菌屬Oscillospira的相對豐度繼而增強腸黏膜屏障。Lactobacillus可激活Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)途徑誘導腸干細胞向潘氏細胞分化，增強抗菌肽的表達以抑制有害菌的腸道定植[37]；Bifidobacterium的代謝產(chǎn)物通過激活芳香烴受體和羥基羧基受體3以劑量依賴性的方式調(diào)控CD4+T細胞和單核細胞，繼而參與腸道免疫反應[38]；Anaerofustis是腸道的產(chǎn)丁酸菌[39]，因此，其也可以同Oscillospira一樣通過產(chǎn)生丁酸刺激雞腸上皮細胞增殖和調(diào)節(jié)腸道黏液屏障的修復[36]。因而，水飛薊素可通過增加盲腸Lactobacillus、Bifidobacterium和Anaerofustis相對豐度提高肉雞腸道免疫功能。

綜上所述，飼糧中添加水飛薊素可促進盲腸有益菌生長，抑制有害菌繁殖，優(yōu)化肉雞腸道菌群組成。

4 結 論

飼糧中添加水飛薊素可以提高快速型黃羽肉雞肝臟抗氧化能力和空腸黏膜免疫功能，優(yōu)化盲腸菌群結構。試驗前期和后期均以飼糧中添加中劑量(500 mg/kg)水飛薊素為宜。